核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

この方法の全体的な目標は、線虫の生殖細胞系の解析を自動化して、その核、タンパク質、および細胞骨格の分布を研究することです。この方法は、生殖細胞系の核と精子の数、核分布、および細胞骨格構造に関するC.Elegans分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、分析時間を短縮し、サンプルサイズを大きくし、手動分析に関連する人為的エラーを排除することです。

サンプルをイメージングするには、染色された生殖細胞系のあるスライドを共焦点顕微鏡の63倍対物レンズの上のスライドホルダーに置き、生殖細胞系を見つけます。生殖細胞系の上部に焦点を合わせ、共焦点顕微鏡ソフトウェアで印を付けます。総生殖細胞系の厚さが確立されたら、各スライスの厚さを最大0.5マイクロメートルまで定義し、完全な生殖細胞系をマークします。

次に、取得を開始し、各スライスを8回スキャンし、値を平均化して画質を向上させます。すべての画像を取得したら、適切な画像解析ソフトウェアプログラムに画像をインポートし、表面機能ツールを使用して有糸分裂領域を選択します。生殖細胞系の遠位端の画像が表示されます。

自動サーフェス作成ウィザードをキャンセルし、3 次元スタックの画像の最初と最後のスライスで、有糸分裂領域の周囲に関心領域を手動で描画します。Create Surface をクリックし、次に Mask Channel をクリックして、DAPI チャネルを除くすべてのチャネルをマスクします。スポット関数ツールを使用して、XY直径が2マイクロメートル、Z直径が未定義の有糸分裂領域のサイズパラメータを定義します。

背景を減算をクリックして、背景を減算します。最小しきい値を定義するには、DAPI で染色された野生型生殖細胞系列の最小 3D レンダリングしきい値を、最初のスポットが生殖細胞系列の外側に表示されるまで増やし、各領域の 3D モデルを生成します。画像を保存したら、表をクリックして、ソフトウェアによって自動的に生成された原子核の数を表示し、画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。

遷移ゾーンについては、前に説明したようにサーフェスを作成します。次に、「チャネルのマスク」をクリックして、DAPIチャネルを除くすべてのチャネルをマスクします。スポット機能を使用して、XY直径を2マイクロメートル、Z直径を1.5マイクロメートルに定義し、[背景の減算]をクリックして背景を減算します。

最小しきい値を定義するには、DAPI で染色された野生型生殖細胞系列の最小 3D レンダリングしきい値を、最初のスポットが生殖細胞系列の外側に表示されるまで増やし、各領域の 3D モデルを生成します。画像を保存したら、表をクリックして、ソフトウェアによって自動的に生成された原子核の数を表示し、画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。精子数をスコアリングするには、核領域で示されているように、関心領域として精子を選択し、スポット関数ツールを使用してXY直径を0.75〜1マイクロメートルで定義し、Z直径が未定義で各精子を検出します。

[背景の減算] ボックスを選択し、ソフトウェアによって計算された背景の補正値を使用して背景を減算します。次に、3Dレンダリングのしきい値を調整して、精子内のDAPI染色された精子をすべて検出します。卵子の染色体カウントでは、卵子を選択し、XY直径を0.75マイクロメートル未満に定義し、しきい値を定義してから3Dモデルを開発します。

次に、エクスポートする画像をTIFFファイルとして保存します。細胞骨格の生殖細胞系を再構築するには、生殖細胞系の目的の有糸分裂領域を特定し、前に示したように表面マスクを作成します。「チャネルのマスク」をクリックして、ファロイディンチャネルを除くすべてのチャネルをマスクし、表面関数ツールを使用して 0.25 マイクロメートルの表面詳細を定義します。

背景を差し引いた後、3Dレンダリングのしきい値を調整して、現像した3D画像をTIFFファイルとして保存してエクスポートします。核の分布は分化の段階に依存します。例えば、有糸分裂領域では、内側のアクチンは、核が組織化される固体の塊として現れます。

野生型の生殖細胞系では、有糸分裂領域には約250個の核が含まれており、他の生殖細胞系と比較して核が密集しています。しかし、核が遠位端から離れるにつれて、核は生殖細胞系の円周に近づき、遷移帯から始まり、減数分裂の前期の第3段階に入ると分布の変化が終わります。遷移帯では、生殖細胞系の内側のアクチンはより円筒形の構造をとり、パキテンに到達すると中空の円柱になります。

アクチンの2番目の層は内層を覆い、生殖細胞系を形作っています。円柱状のアクチン構造内のこの円柱は、卵子領域に向かって消失し、その時点でアクチンは卵子を覆う太い繊維として現れます。精子では、アクチンも厚い繊維の束を形成しますが、これらの繊維は卵母細胞領域よりも密集しているように見えます。

実証されているように、生殖細胞系の近位端の3次元レンダリングは、各精子に平均151個の精子を明らかにします。一度習得すれば、この分析は生殖細胞系列ごとに10分で完了することができます。この手順を試行する際には、実験で生殖細胞系を視覚化するために使用される対物レンズの倍率に応じて分析パラメータを定義することを忘れないでください。

このビデオを見れば、生殖細胞系の自動解析を行う方法、細胞骨格構造を研究する方法、生殖細胞系内の核の数をスコアリングする方法を十分に理解できるはずです。