Name: 植物の鉄含有量を測定するための比色定量法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぶ プルシアンブルー比色法による植物組織の鉄含有量測定法。タバコ葉を用いた正確な定量プロトコルで、植物栄養研究に応用可能です。

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この作品は、イスラエル農業 (#16-16-0003) 省の主任研究員からの助成金によってイスラエル省、科学、技術およびスペースによって支えられました。

1. 植物材料と成長条件
<ol><li>5 cm × 5 cm ポット当たり種子 1 つタバコ (品種サムスン) は標準的なポットの中に満ちています。トレイにポットを置きます。23 ° C の一定温度で長い一日 (16/8 h/暗) 条件の下で成長部屋の植物を育てるポットから排水まで水道水で灌漑します。</li>
	<li>50±5 日後、実験用に最適の濃度によると、灌漑で Fe 治療を開始します。たとえば、0 から 6 mm、可溶性鉄キレート剤 (Fe EDDHA) によって補われる鉄濃度の範囲を使いました。水を引く適切なソリューションが付いている植物 2 日毎 (脱水症状を避けるため) に 6-8 日の。</li>
</ol>2. 鉄測定葉の準備
メモ: 使用するすべての材料がある必要があります鉄無料の鉄汚染.の危険性を減らすために4% 塩酸溶液で 2 回すりこぎをきれいにし乾燥ろ紙を使用する前にするたびに。任意の材料を再使用する場合二度 4% 塩酸溶液とそれをきれいにしろ紙を乾燥します。
<ol><li>手袋 (任意の金属の装置を使用して) を使用して、手で茎から葉をデタッチします。各サンプルの葉 (生体重) 約 10 g を使用します。スプレー ボトルを使用して二重蒸留水 (DDW) 各葉をきれいに。この手順は、鉄の汚染を防止することが重要です。</li>
	<li>ペーパー タオルの上葉を乾燥し、紙の袋に入れてください。80 ° C の一定温度でオーブンに 2 〜 3 日の紙バッグを転送します。</li>
	<li>乾燥時、モルタルと乳棒と滅菌 15 mL プラスチック チューブに転送を用いた粉体に葉を粉砕します。</li>
</ol>3. 燃焼灰の葉
ノート: HCl (0) に近い低 pH 溶液の使用は、鉄の溶解度を増すものです。岩綿は、ガスが燃焼中にバイアルを脱出することを防ぐために使用されます。
<ol><li>その蓋なしの新しい、密封された 20 mL シンチレーション バイアルの重量を量る。値に注意してくださいまたはゼロ、風袋のボタンを使用して値を設定します。バイアルに砕いた乾燥葉 (サンプル) を追加します。</li>
	<li>サンプルとコンテナーの重量を量るし、値に注意してください。ロックウールでバイアルを閉じます。</li>
	<li>サンプルを追加することがなく 3 追加バイアルの重さし、その値に注意してください。これらのバイアルは、試料重量の増加につながっている可能性がありますロック ウールの量を評価するコントロールとして使用されます。</li>
	<li>炉内サンプルとコントロールのバイアルに置き温度以下を使用して書き込みを開始: 部屋の温度、高速 4 時間増資 425 ° C、および、最終的に、425 ° C。この時点で、乾燥した葉は灰になっているでしょう。</li>
	<li>約 100 ° C にダウン サンプルを冷ますがない、この温度湿度を避けるために次の 2 つの手順のため、以下は、サンプルの最終的な重量を影響するかもしれない。厚手の手袋を使用して、ピンセット、内方バイアルを保持炉からサンプルを削除します。</li>
	<li>バイアルを平らな面に配置、岩綿を削除し、元の蓋と瓶を閉じます。</li>
	<li>3 コントロール バイアル (3.3 を参照) の重量を量るし、自分の平均体重を計算します。体重増加が等しい場合または上記灰重量の 1% に (手順 4.2 を参照)、測定誤差の推定値としてこの値を使用します。</li>
</ol>4. 鉄測定の灰を準備
メモ: 初期サンプルの最終的な鉄濃度は塩酸の量で割った灰の重量として計算されます。
<ol><li>1 M 塩酸溶液を準備 (4 %hcl) (プラスチックまたはガラス フラスコ) の DDW の 87.5 ml 12.5 mL 37% 塩酸原液を追加することによって。</li>
	<li>15 mL プラスチック チューブの重量を量ると値に注意してくださいまたは、風袋のボタンを使用してゼロ値に設定。遺灰を転送管、計量、そして値をメモします。これは、灰の重量です。</li>
	<li>灰の中に 1 M 塩酸 5 mL を追加します。22 μ m フィルターをフィルターして灰と同じフィルターを使って 1 M HCl の追加 5 mL を追加します。</li>
	<li>最終巻は 10 mL をする必要があります。フィルターにソリューションの一部が失われることに注意してください。 注: サンプルは、FAAS またはプルシアン ブルー法による Fe 測定する準備が整いました。</li>
	<li>Fe 濃度で検量線プルシアン ブルーによる原子吸光法によって測定する (図 4を参照) の各植物種。その後、単独でプルシアン ブルー法による Fe 濃度が測定できます。</li>
</ol>5. FAAS により Fe 濃度の測定
<ol><li>FAAS による測定の各サンプルから 4 mL を削除します。</li>
	<li>灰の重さで FAAS 測定から得られた結果を分割します。(灰は 10 mL で溶いた) ので、0.01 で結果の値を分割します。結果の値はグラム灰 (ppm) ごとの鉄濃度です。</li>
</ol>6. プルシアン ブルーの染色液の準備
<ol><li>4% を準備 K4Fe(CN)6を 100 mL DDW と渦の 4 g を追加することによってソリューションをプルシアン ブルー (他のボリュームおよび/または濃度使用できます別の要求)。本研究ではより少なく集中することプルシアン ブルーのソリューションよりも以前に報告された (20%)14が使用されたことに注意してください。</li>
	<li>暗闇の中で使用されるまでの 4 ° C でのソリューションを保持します。ソリューションは、このような条件で保存する場合、6 ヶ月間安定です。</li>
</ol>7. FAAS 結果を用いたプルシアン ブルーの較正曲線の生成
注: 次の式を使用して灰の鉄濃度を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">式 1 C: 濃度、v: サンプル ボリューム w: 灰重量 (g) です。
<ol><li>プルシアン ブルーのソリューション、1 M HCl の 0.50 mL 0.50 mL を混ぜます。これは、空のソリューションとなります。</li>
	<li>サンプルの 0.5 mL を混ぜる (4% 灰 HCl、セクション 3 で説明したよう)、ピペッティングによるプルシアン ブルー溶液 (ステップ 6.1) の 0.5 mL。しかし、最低 1 分間、5 分を待ちます。5 分後のサンプルで沈降が発生します。</li>
	<li>キュベットにミックスを転送し、715 で外径を測定分光光度計を用いた nm。値に注意してください。</li>
	<li>サンプルの灰重量 (ステップ 3.2) OD 値 (ステップ 7.3) を分割します。結果は、グラム灰あたり外径を表します。</li>
	<li>FAAS 測定 (Y 軸) と OD 値から得られる鉄濃度の線形回帰のプロット (X 軸) です。5.2 と 7.4 手順で取得した結果を使用します。回帰式は、Y を計算する =、+ bX、Y が鉄濃度、吸光度が交差する表します、b を表す吸光度斜面を表し X OD。</li>
</ol>8. 同じ植物のタイプから他のサンプルの鉄のレベルを決定するためプルシアン ブルー メソッドを使用してください。
メモ: この種の植物に、検量線は既に確立されて、以来同じ植物のタイプから任意の新しいサンプルの鉄濃度直接計算できます線形回帰式を使用します。
<ol><li>3 と 4 の手順 7.1 7.4 に続いてのセクションで手順に従います。</li>
	<li>線形回帰 (ステップ 7.5) から得られた式を使って、溶液中の鉄の濃度を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

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植物組織の鉄の測定は、灌漑や他の環境条件の影響を評価するために非常に重要です。ここでは、他の植物種や組織に容易に合わせることができるタバコ葉における Fe コンテンツ測定のための簡単で正確な比色定量法について述べる。
比色法のための条件を最適化する、鉄の溶解性を許可するように低 pH 媒体 (pH < 1.0) を使用しました。書き込み処理を行った鉄のすべてのフォームを解放し、汚染物質のサンプルで現在が結果を変更できません。については鉄汚染、1 つ留意すべき地球の地殻の 6.7% に酸化鉄 (FeOn) の種21が装備されていること、その濃度が植物の乾燥重量220.009% に達することができます。したがって、1 つは、ほこりは、できるだけ多くの 3 〜 7% (地域) によって鉄23、大きく結果に影響を与えることができますので、汚染のリスクを検討してください。また、実験で使用されるすべての装置の鉄含有量を慎重に確認し...

鉄 (Fe) は、すべての生物に重要な微量栄養素です。植物の呼吸、光合成とクロロフィル生合成などの基本的なプロセスに関与のため必須微量栄養素1についてです。無料鉄多価イオンの高集積植物細胞酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルのリリースにつながる反応のために有害です。植物細胞内鉄の恒常性を維持するために、イオンは液胞に格納され、フェリチン、鉄の恒常性2に直接関与するタンパク質ケージおよびすべての生きている有機体の鉄の主要な記憶域構造内で隔離。同時には、鉄欠乏性貧血は、植物鉄 biofortification の増加が必要で、その結果、人間の人口のかなりの割合を影響します。植物フェリチンのユニークな性質上、フェリチン鉄食品濃縮栄養失調3のこの問題を戦うために有望な戦略を提供しています。
鉄イオンは、主に 2 つ酸化状態、すなわち鉄 (2価 Fe2 +または鉄 (II))、鉄 (三価 Fe3 +または鉄 (III)) フォーム。鉄、鉄クラスター4などのいくつかの他の形態はまた細胞であります。Fe はセルと自然フォーム ヘマタイト (Fe2O3) と ferryhidrites 内の酸化鉄として格納されます ((Fe3 +)2O3•0.5 H2O)5生理学的な条件の下で。これらの反応は、特に鉄のフォームに形成された水酸化物非常に低い容解性があります。鉄保持は、pH 56上固体状態で主はその結果、溶液の pH によって影響を受けます。
溶解性が悪い、Fe の高反応性を考慮した植物組織や器官の間での転送が適切なキレート分子と関連付ける必要があります。また、鉄と鉄のフォーム1の間の酸化還元状態を制御する必要があります。葉、内鉄の約 80% は、電子伝達系、チトクローム、葉緑素と他のヘム分子の生合成に重要な役割はそのための光合成細胞で発見され、鉄 S の形成におけるクラスター7。セル内の余分な鉄の場合、黒字はフェリチン分子8金属が保存されている液胞に転流します。
鉄は、いくつかの方法、含む火炎原子吸収分光法9 (FAAS) または比色試金10, 前者は後者よりもはるかに正確な植物組織で測定できます。FAAS は、個々 の要素の電磁放射に基づくサンプルの元素組成を決定することができる精度の高い手法です。FAAS に変換します金属イオン原子状態のサンプルでは、炎加熱による特定イオンの基底状態に戻るときに特定の波長のイオン励起と放射に 。別のイオンからの排出量は、分光器で区切られ、吸収センサー11によって検出されました。したがって、FAAS は直接鉄濃度を定量化する提供しています。しかし、生体組織中の鉄を可視化するための他の手法が利用できます。誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS)12は、鉄などの微量要素を測定するための非常に正確な技術、機器、FAAS と ICP-MS の両方の不足が共通問題。その一方で、チオシアン酸測色13による鉄の測定は、精度を欠いている、サンプル間の小さな変化を検出する失敗します。プルシアン ブルー染色14,15,16,17は鉄フェロシアン化カリウム (K4Fe(CN)6) 生産、鉄イオンとの反応に基づく間接法、青い色の強い、動物や植物の組織の組織学的セクションで質的な鉄の検出に使用されます。
金属 (ゼロ原子価) 鉄は、リソスフェアのまれです。環境中の鉄の支配的な非複合イオンの形態は、ほとんど無酸素環境で比較的より豊富である鉄と鉄有酸素サイトの色合いが強い、周囲の酸素の量によって決まります。鉄酸化の原因となるエージェントはしばしば無酸素、酸性環境18で異なるが、この後者の形式、非常に酸性環境で支配的なも。4% で鉄を溶解するとき HCl (pH 0) 好気性環境で、希薄化後の鉄の主要な部分として存在する、鉄 (Fe3 +)19,20を形成します。
鉄イオンと K4Fe(CN)6の反応は次のとおりです。
Fe3 +: した FeCl3 + K4Fe(CN)6 KFe(III)Fe(II)(CN)6̄ + 3KCl =
Fe2 +: 2 K4Fe(CN)6 + 4 のした FeCl2 = 鉄4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
本研究で我々 はプルシアン ブルー染色することができますソリューションの鉄のレベルを測定するために役立つかどうか尋ねた。
当初は、水溶液中の Fe の濃度とプルシアン ブルー染色の相関関係を検証しました。水溶液中で (した FeCl2、した FeCl3または 2 つの 1:1 混合物) として Fe 濃度は、プルシアン ブルーの付加の後で原子分光法と吸光度 (OD) の両方を測定しました。図 1は、それぞれの方法によって得られる測定の線形回帰曲線を示しています。溶液中の鉄濃度の定量分析のためプルシアン ブルーのメソッドを使用できますと結論づけた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> 図 1: FAAS と光の吸光度によって測定される Fe 濃度の線形回帰 (OD、715 nm) プルシアン ブルーによる得られた。青い正方形とラインは Fe2 +ソリューションを表す、赤い四角形と線 Fe3 +ソリューションおよび黒い正方形を表しライン Fe2 +と Fe3 +の間の 1:1 混合物。次の回帰が得られた: [Fe2 +] = 3 + 123 x 外径 r 0.996、R2 = = 0.989;[Fe3 +] = 1 + 292 x 外径 r = 0.999、R2 = 0.997;[Fe2 +/3 +] = 11 + 146 x 外径 r = 0.983、R2 = 0.956。Fe2 +ドナーした FeCl2 Fe3 +ドナーした FeCl3であった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
比色プルシアン ブルー植物組織の鉄の定量分析法を適応し、火炎吸収原子分光学とプルシアン ブルー染色によりタバコ葉灰の鉄含有量を測定しました。2 つの手法から結果の相関があった。

<table><tbody><tr><td>ヘキサシアノフェレートカリウム(II)</td><td>Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>Reagent for the Pussian Blue</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 &mu;m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>灰+ 4% HCl溶液</td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td>をろ過するために使用されるフィルター <td>フィッシャーブランド</td><td>03-337-4</td><td>燃焼手順中に乾燥粉末植物材料を保持するために使用されます。</td></tr><tr><td>使い捨てシリンジ 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>ろ過中に使用したシリンジ</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>4% HCl 溶液で灰を希釈し、材料をきれいにするために使用されます</td></tr><tr><td>タバコ, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN</td><td>Simon Barak 教授から入手し、Zaccai Lab</td><td>で日常的に使用バラクS、ネジダットA、ハイマーY、ヴォロキタM.タバコ苗のグリコール酸オキシダーゼ遺伝子の転写および転写後調節。植物分子生物学。2001年3月1日;45(4):399-407。</td><td>このプロトコルで使用されるタバコ品種</td></tr><tr><td>グラスウール(ロックウール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>炉でサンプルを燃焼させる手順で使用されます。</td></tr></tbody></table>

植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

鉄生体内で最も重要な栄養素の一つは、呼吸や光合成などの基本的なプロセスに関与しています。鉄の含有量は乾燥重量の約 0.009% に相当する植物で、すべての生物で幾分低いです。日付、火炎吸収原子分光学植物組織中の鉄濃度を測定する最も正確な方法の一つです。ただし、この方法は時間がかかり、高価な一般的植物研究所は、特定の機器が必要です。したがって、日常的に使用することができます簡単に、まだ正確な方法が必要です。比色のプルシアン ブルー メソッドは、動物や植物の組織切片の染色質の鉄の定期的に使用されます。本研究では、タバコ中の鉄の定量計測法の葉プルシアン ブルーを適応.原子分光学と同じ試料中の鉄の含有量を測定し、線形回帰を発見する染色プルシアン ブルーの両方を使用してこのメソッドの精度を検証しました (R2 = 0.988) 2 つのプロシージャの間。我々 はプルシアン ブルーの植物組織定量的鉄測定法は正確な単純な安価な結論します。しかし、ここで紹介する線形回帰はサンプルと試薬の潜在的な相互作用のための他の植物種のために適切かもしれない。回帰曲線の確立は別の植物種にしたがって必要です。

このプロトコルは正しく実施される、1 つはプルシアン ブルーと原子分光法によって得られた結果と良好な相関性を得る必要があります。したがって、次の実験に反映は、植物試料中の鉄濃度の正確な測定を取得するプルシアン ブルーのメソッドを簡単に使用できます。
タバコがプロトコルに記載を栽培され、異なる鉄濃度を含む殺菌水で灌漑 (0、1、2、3、4、5、または 6 の mM) 7 日間。植物、収穫、洗浄、80 ° C で 3 日間の乾燥(すなわち、ステップ 2.3 から) プロトコルの次の手順は、説明されているように続いていた。コントロール バイアルは、灰の重量から 1% 未満の変動を示したので、この値がさらに計算に追加されませんでした。
鉄濃度は、FAAS により測定しました。表 1は、これ...

比色のプルシアン ブルーを用いた植物組織の鉄含有量を測定するための簡潔かつ信頼できるプロトコルを提案します。

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

医学的に言えば、生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、生物学のコアサンプル中の鉄をいかに簡単に定量できるかなどです。この技術の主なベンチャーは、製造が容易で、非常に正確な比色技術であるということです。この手法を好む一方で、鉄分汚染は避けるべきです。この方法を視覚的に示していると、さまざまな手順を理解するのに役立ちます。この手順を開始するには、5センチ×5センチのポットに標準のポットメディウムを入れて準備します。各ポットにタバコの種を1つずつ植えます。植物を摂氏23度の長い日中の条件下で、一定の温度にある成長室に移します。鉢から水がなくなるまで水道水で灌漑し、約50日間植物を育てます。この時間の後、実験に適した濃度で灌漑中の鉄処理を開始します。この溶液で植物を2日ごとに6〜8日間灌漑します。次に、金属製の器具を使わないように注意しながら、手で茎から葉を取り除きます。二重蒸留水で満たされたスプレーボトルを使用して、各葉をきれいにします。ペーパータオルで葉を乾かし、紙袋に移します。葉っぱを詰めた袋をオーブンに入れ、摂氏80度の一定温度に2〜3日間入れます。乳鉢と乳棒を4%塩酸溶液で2回洗浄します。そして、濾紙を使って乾かします。乳鉢と乳棒を使って、乾燥した葉を粉末に粉砕します。次に、粉末を滅菌済みの15ミリリットルのプラスチックチューブに移します。まず、蓋のない新しい密封された20ミリリットルのシンチレーションバイアルの重量を量ります。重量を書き留めるか、はかりを風袋引きします。次に、砕いた葉を追加します。バイアル内のサンプルを計量し、重量をメモします。ロックウールを使用してバイアルを閉じます。サンプルを追加せずに、コントロールとして使用するために、追加の3つのバイアルを計量し、各重量をメモします。次に、サンプルとコントロールバイアルを炉に移します。テキストプロトコルで説明されているように葉を燃やします。この後、サンプルを摂氏約100度に冷まします。厚手の手袋とピンセットを使用して、サンプルを炉から取り出し、バイアルを外側に保持します。バイアルを平らな面に置きます。ロックウールを取り外し、バイアルを元の蓋で閉じます。次に、3つのコントロールバイアルを秤量し、それらの平均重量増加を計算します。重量増加が灰灰重量の1%以上の場合は、この値を測定誤差の推定値として使用します。15ミリリットルのプラスチックチューブの重さを量ります。重量を記録するか、はかりを風袋引きします。次に、灰をチューブに移します。この値(灰の重量)を記録します。次に、1モルの塩酸溶液を5ミリリットル灰に加えます。22マイクロメートルのフィルターで灰をろ過します。次に、同じフィルターを通して1モルの塩酸溶液をさらに5ミリリットル加えると、最終的なサンプル量は10ミリリットルになります。この後、原子分光法による測定のために各サンプルから4ミリリットルを取り出します。そして、テキストプロトコルに概説されているように、灰のグラムあたりの鉄濃度を決定します。まず、100ミリリットルの二重蒸留水に4グラムのフェロシアン化カリウムを加えて、プルシアンブルー溶液を調製します。渦を混ぜ合わせ、使用する準備ができるまで摂氏4度で保管します。使用する準備ができたら、50ミリリットルのプルシアンブルー溶液と50ミリリットルの1モル塩酸を混合してブランク溶液として機能します。次に、ピペットを使用して、以前に取得したサンプル0.5ミリリットルと0.5ミリリットルのプルシアンブルー溶液を混合します。この混合物を少なくとも1分間、ただし5分未満で休ませます。この混合物をキュベットに移し、分光光度計を使用して715ナノメートルの光学密度を測定します。次に、灰分1グラムあたりの光学密度を決定し、テキストプロトコルで概説されているように、鉄濃度間の線形回帰をプロットします。21のタバコの葉のサンプルからの代表的な結果は、灌漑用水の鉄濃度が葉の鉄含有量に大きく影響したことを示しています。次に、21の代表的なサンプルすべてのスペクトルをプルシアンブルー法でテストします。ここに見られるように、715ナノメートルでの吸光度は、鉄2と鉄3の濃度が異なる溶液を測定する際の最適な波長です。原子分光法で得られた鉄濃度値とプルシアンブルー法で得られた吸光度値をプロットした線形回帰曲線により、同じ植物タイプの新しいサンプルを分析できます。HCLでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。また、この手順を実行するときは、目の保護などの予防策を常に講じる必要があります。線形回帰では、結果が現実的な範囲内にあることを確認することが重要です。開発後、この技術は、生物学研究者が食料生産やバイオレメディエーションのための追加の植物を探索するのに役立ちます。

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