アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

この二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動の全体的な目標は、従来のSDD-AGEで見られたアミロイドまたはアミロイド様繊維のサイズ不均一性を確認することです。この方法は、従来のSDD-AGEで見られたサイズの不均一性がin vivoでの繊維の天然状態なのか、ゲル電気泳動中のタンパク質の分解または解離の結果なのかなど、アミロイドまたはタンパク質凝集分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特殊な機器を使用せずにラボで簡単に実行できることです。

従来のSDD-AGEで使用されているもの以外に追加の機器は必要ありません。まず、アミロイド産生HT-29結腸がん細胞を10cmの組織培養皿に播種します。次に、細胞を摂氏37度で一晩、5%の二酸化炭素でインキュベートします。

細胞が80%のコンフルエント度に達したら、リン酸緩衝生理食塩水を使用して細胞を洗浄します。次に、3ミリリットルのトリプシンを細胞に加え、摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞が培養皿から分離した後、プレートに10ミリリットルの培地を追加します。

次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞懸濁液を室温で3分間、1,000倍gで遠心分離する。遠心分離後、培地を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルの培地に再懸濁します。

セルカウンターを使用してセルをカウントします。次に、2つの培養プレートを摂氏37度で一晩放置します。次に、培養皿の1つにTSZ試薬を治療として加えます。

約6時間後、プラスチックスクレーパーを使用して細胞を採取します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、摂氏4度で3分間1,000倍gで遠心分離する。次に、細胞ペレットを10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、遠心分離プロセスを繰り返します。

次に、PBS溶液を吸引し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。0.3ミリリットルの溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、氷上で30分間インキュベートします。再び、摂氏4度で15分間、20, 000倍のgで遠心分離します。

得られる上清は全細胞溶解物です。上清に4X SDD-AGEバッファーを加えて、サンプル1マイクロリットルあたり3マイクログラムの20マイクロリットルを調製します。サンプルを室温で10分間インキュベートします。

ゲルを調製するには、ガラスビーカー中の200ミリリットルのTAEバッファーに2グラムのアガロース粉末を加えます。次に、ビーカーを電子レンジで加熱してアガロースを溶かします。次に、20%SDSを1ミリリットル加えて最終濃度0.1%ビーカーを静かに渦巻きます。

次に、液体アガロースを15 x 14 cmのゲルスラブに注ぎます。気泡を取り除くには、1ミリリットルのピペットを使用します。次に、ゲルの上に20ウェルコームを置きます。

次に、ゲルの右端のレーンに約60μgの全細胞ライセートを加えます。0.1%SDSを含むTAEバッファーをランニングバッファーとして使用して、ゲルを60ボルトで約4時間泳動します。ゲルを2次元に泳動させるには、ゲルを反時計回りに90度慎重に回転させます。

その後、ゲルを60ボルトで約4時間泳動します。20 x 20 cm のコンテナに、500 ミリリットルの転写バッファーを追加します。コンテナのすぐ横に、高さ5センチのペーパータオルのスタックを準備します。

次に、2枚の濾紙(それぞれ14 x 15 cmの寸法)を転写バッファーに浸し、ペーパータオルのスタックの上に置きます。メタノール中の14 x 15 cmのPVDFメンブレンを30秒間活性化します。活性化後、メンブレンを濾紙の上に置き、ローラーを使用してすべての気泡を取り除きます。

転写の最も重要な部分は、ゲルとメンブレンの間に気泡が形成されていないことを確認することです。ゲルを転写バッファーですすぎ、メンブレンの上に重ねます。形成された気泡をロールアウトします。

次に、ラップを使用して、転写バッファー容器に最も近いペーパータオルの端を覆います。次に、15 x 35 cmの寸法の濾紙を転写バッファーに浸します。一方の端がゲルの上部を覆い、もう一方の端が転写バッファー容器に入るように濾紙を置きます。

容器をラップで覆い、室温で一晩放置します。翌日、20 x 20 cmの容器に50ミリリットルのPBSTでメンブレンをすすぎます。次に、メンブレンにPBST中の5%ミルク20ミリリットルを追加します。

その後、メンブレンをロッカーに室温で30分間放置してブロックします。10マイクロリットルのウサギ抗MLKL抗体をPBST中の20ミリリットルの5%ミルクにピペットで移します。次に、抗体ミックスをメンブレンに添加します。

メンブレンをロッカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、メンブレンを20ミリリットルのPBSTで5分間洗浄します。この洗濯を5回繰り返します。

次に、4マイクロリットルの抗ウサギHRP抗体をPBST中の20ミリリットルの5%ミルクにピペットで移します。メンブレンに抗体を添加します。ロッカーにメンブレンを載せた容器を室温で2時間放置します。

2時間後、メンブレンを20ミリリットルのPBSTで5回、それぞれ5分間洗浄します。最後に、強化された化学発光基質をメンブレン上に加えます。次に、製造元の指示に従ってメンブレンをX線フィルムにさらします。

この研究は、腫瘍壊死因子α処理細胞から得られた全細胞溶解物中のSDS耐性アミロイド様線維の存在を実証するために行われます。ここでは、RIPK1とRIPK3が同様の同一のアミロイド様パターンを示すことを示しています。興味深いことに、MLKL繊維は他の繊維とは異なる移動パターンで不均一に見えます。

この画像は、アミロイドまたはアミロイド様繊維の可能な移動パターンを示しています。1次元SDD-AGEでは、アミロイドまたはアミロイド様繊維が特徴的な塗抹標本を示します。この画像では、繊維は 2 回目の実行で同じように移動し、メンブレン上 45 度で斜めの移動パターンを示しています。

これは、ゲルのランニングプロセス中に繊維が劣化または解離しないことを示しています。それどころか、繊維が解離すると、対角線の下に垂直な縞模様が生じ、2回目の電気泳動中に小さな繊維がより速く移動することを示しています。これらの 1 次元と 2 次元の SDD-AGE はどちらも、MLKL ファイバーが SDD-AGE プロセス中に解離せず、実際に RIPK1 ファイバーや RIPK3 ファイバーとは異なることを示しています。

この画像では、MLKL繊維は最初の次元で特徴的な汚れを示しています。しかし、同じ繊維は、2次元SDD-AGEでは垂直な縞模様のない鋭い斜めの線を示しています。この手順を試みるときは、電圧や配線の長さなどのすべての条件が 1 次元と 2 次元の間で同じままであり、45 度の角度で鋭い線が確保されることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、メンブレンのストリッピングや他の抗体による再プローブなどの他の方法を実行して、繊維に他のタンパク質が含まれているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、従来のSDD-AGE中にアミロイドまたはアミロイド様繊維の分解や解離が起こっていないことを確認する方法を十分に理解しているはずです。