アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用
2018年4月26日
ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。
この二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動の全体的な目標は、従来のSDD-AGEで見られたアミロイドまたはアミロイド様繊維のサイズ不均一性を確認することです。この方法は、従来のSDD-AGEで見られたサイズの不均一性がin vivoでの繊維の天然状態なのか、ゲル電気泳動中のタンパク質の分解または解離の結果なのかなど、アミロイドまたはタンパク質凝集分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特殊な機器を使用せずにラボで簡単に実行できることです。
従来のSDD-AGEで使用されているもの以外に追加の機器は必要ありません。まず、アミロイド産生HT-29結腸がん細胞を10cmの組織培養皿に播種します。次に、細胞を摂氏37度で一晩、5%の二酸化炭素でインキュベートします。
細胞が80%のコンフルエント度に達したら、リン酸緩衝生理食塩水を使用して細胞を洗浄します。次に、3ミリリットルのトリプシンを細胞に加え、摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞が培養皿から分離した後、プレートに10ミリリットルの培地を追加します。
次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞懸濁液を室温で3分間、1,000倍gで遠心分離する。遠心分離後、培地を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルの培地に再懸濁します。
セルカウンターを使用してセルをカウントします。次に、2つの培養プレートを摂氏37度で一晩放置します。次に、培養皿の1つにTSZ試薬を治療として加えます。
約6時間後、プラスチックスクレーパーを使用して細胞を採取します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、摂氏4度で3分間1,000倍gで遠心分離する。次に、細胞ペレットを10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、遠心分離プロセスを繰り返します。
次に、PBS溶液を吸引し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。0.3ミリリットルの溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、氷上で30分間インキュベートします。再び、摂氏4度で15分間、20, 000倍のgで遠心分離します。
得られる上清は全細胞溶解物です。上清に4X SDD-AGEバッファーを加えて、サンプル1マイクロリットルあたり3マイクログラムの20マイクロリットルを調製します。サンプルを室温で10分間インキュベートします。
ゲルを調製するには、ガラスビーカー中の200ミリリットルのTAEバッファーに2グラムのアガロース粉末を加えます。次に、ビーカーを電子レンジで加熱してアガロースを溶かします。次に、20%SDSを1ミリリットル加えて最終濃度0.1%ビーカーを静かに渦巻きます。
次に、液体アガロースを15 x 14 cmのゲルスラブに注ぎます。気泡を取り除くには、1ミリリットルのピペットを使用します。次に、ゲルの上に20ウェルコームを置きます。
次に、ゲルの右端のレーンに約60μgの全細胞ライセートを加えます。0.1%SDSを含むTAEバッファーをランニングバッファーとして使用して、ゲルを60ボルトで約4時間泳動します。ゲルを2次元に泳動させるには、ゲルを反時計回りに90度慎重に回転させます。
その後、ゲルを60ボルトで約4時間泳動します。20 x 20 cm のコンテナに、500 ミリリットルの転写バッファーを追加します。コンテナのすぐ横に、高さ5センチのペーパータオルのスタックを準備します。
次に、2枚の濾紙(それぞれ14 x 15 cmの寸法)を転写バッファーに浸し、ペーパータオルのスタックの上に置きます。メタノール中の14 x 15 cmのPVDFメンブレンを30秒間活性化します。活性化後、メンブレンを濾紙の上に置き、ローラーを使用してすべての気泡を取り除きます。
転写の最も重要な部分は、ゲルとメンブレンの間に気泡が形成されていないことを確認することです。ゲルを転写バッファーですすぎ、メンブレンの上に重ねます。形成された気泡をロールアウトします。
次に、ラップを使用して、転写バッファー容器に最も近いペーパータオルの端を覆います。次に、15 x 35 cmの寸法の濾紙を転写バッファーに浸します。一方の端がゲルの上部を覆い、もう一方の端が転写バッファー容器に入るように濾紙を置きます。
容器をラップで覆い、室温で一晩放置します。翌日、20 x 20 cmの容器に50ミリリットルのPBSTでメンブレンをすすぎます。次に、メンブレンにPBST中の5%ミルク20ミリリットルを追加します。
その後、メンブレンをロッカーに室温で30分間放置してブロックします。10マイクロリットルのウサギ抗MLKL抗体をPBST中の20ミリリットルの5%ミルクにピペットで移します。次に、抗体ミックスをメンブレンに添加します。
メンブレンをロッカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、メンブレンを20ミリリットルのPBSTで5分間洗浄します。この洗濯を5回繰り返します。
次に、4マイクロリットルの抗ウサギHRP抗体をPBST中の20ミリリットルの5%ミルクにピペットで移します。メンブレンに抗体を添加します。ロッカーにメンブレンを載せた容器を室温で2時間放置します。
2時間後、メンブレンを20ミリリットルのPBSTで5回、それぞれ5分間洗浄します。最後に、強化された化学発光基質をメンブレン上に加えます。次に、製造元の指示に従ってメンブレンをX線フィルムにさらします。
この研究は、腫瘍壊死因子α処理細胞から得られた全細胞溶解物中のSDS耐性アミロイド様線維の存在を実証するために行われます。ここでは、RIPK1とRIPK3が同様の同一のアミロイド様パターンを示すことを示しています。興味深いことに、MLKL繊維は他の繊維とは異なる移動パターンで不均一に見えます。
この画像は、アミロイドまたはアミロイド様繊維の可能な移動パターンを示しています。1次元SDD-AGEでは、アミロイドまたはアミロイド様繊維が特徴的な塗抹標本を示します。この画像では、繊維は 2 回目の実行で同じように移動し、メンブレン上 45 度で斜めの移動パターンを示しています。
これは、ゲルのランニングプロセス中に繊維が劣化または解離しないことを示しています。それどころか、繊維が解離すると、対角線の下に垂直な縞模様が生じ、2回目の電気泳動中に小さな繊維がより速く移動することを示しています。これらの 1 次元と 2 次元の SDD-AGE はどちらも、MLKL ファイバーが SDD-AGE プロセス中に解離せず、実際に RIPK1 ファイバーや RIPK3 ファイバーとは異なることを示しています。
この画像では、MLKL繊維は最初の次元で特徴的な汚れを示しています。しかし、同じ繊維は、2次元SDD-AGEでは垂直な縞模様のない鋭い斜めの線を示しています。この手順を試みるときは、電圧や配線の長さなどのすべての条件が 1 次元と 2 次元の間で同じままであり、45 度の角度で鋭い線が確保されることを覚えておくことが重要です。
この手順に続いて、メンブレンのストリッピングや他の抗体による再プローブなどの他の方法を実行して、繊維に他のタンパク質が含まれているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、従来のSDD-AGE中にアミロイドまたはアミロイド様繊維の分解や解離が起こっていないことを確認する方法を十分に理解しているはずです。
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概要
本研究では、2次元セミ変性アガロースゲル電気泳動を用いて、アミロイド様線維のサイズ不均一性を調査します。この手法は、観察されたサイズの変動が線維に固有のものであるのか、あるいは電気泳動過程における解離の結果であるのかを判断することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- タンパク質凝集
背景
- アミロイド様線維は、さまざまな神経変性疾患に関連しています。
- それらのサイズと安定性を理解することは、疾患メカニズムにおける役割を解明するために極めて重要です。
- 従来の手法では、これらの線維の天然状態を正確に反映できない場合があります。
- サイズの不均一性は、実験結果の解釈を困難にする可能性があります。
研究目的
- 不均一なサイズの類アミロイド繊維が存在することを確認する。
- サイズの不均一性が、本来の特性によるものか、あるいは実験的なアーティファクトによるものかを判断する。
- 研究室でアミロイド繊維を研究するための信頼性の高い方法を提供する。
使用した手法
- 二次元半変性アガロースゲル電気泳動。
- アミロイド産生HT-29結腸がん細胞の播種。
- 5% 二酸化炭素、37 °Cでの細胞培養。
- ゲル結果の解析による繊維のサイズおよび安定性の評価。
主な結果
- アミロイド様線維におけるサイズの不均一性の確認。
- 観察されたサイズの変動の原因として、解離の可能性を排除すること。
- アミロイド線維を研究するための信頼性の高い手法としての検証。
- in vivo におけるアミロイド線維の天然状態に関する知見。
結論
- 二次元セミデナチュアリングアガロースゲル電気泳動は、アミロイド様線維の研究に有効です。
- サイズの不均一性は、手法によるアーティファクトではなく、線維自体の特性です。
- この手法は、アミロイドおよびタンパク質凝集分野の研究を前進させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
アミロイド様繊維の天然状態を確認することは、凝集しやすいタンパク質が高価値ながらリスクの高い標的となる神経変性疾患研究における標的バリデーションにおいて極めて重要です。この二次元SDD-AGE法は、真の繊維の不均一性と電気泳動によるアーティファクトを区別することでメカニズム的なリスク低減を可能にし、標的結合アッセイにおける予測信頼性を向上させます。精製の必要なく細胞溶解液中の繊維安定性を直接的に定性評価できるため、この手法は初期の探索ワークフローを支援し、電子顕微鏡のような低スループットで特殊な技術への依存を軽減します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 観察された線維サイズ分布が、in vivoにおけるネイティブなアミロイド構造を反映しているかを確認することで、治療仮説を検証する。
- 運用的価値： タンパク質の精製なしに機能的なターゲットバリデーションを可能にし、凝集しやすいターゲットプログラムにおけるヒットからリードへのタイムラインを加速させる。
- 予測の信頼性： 方法論的なアーティファクトによって凝集挙動が誤認される可能性のあるターゲットのリスクを低減し、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状況： 変性条件下での線維の完全性を確認することにより、ダウンストリームのスクリーニングに適した検証済み生物学的システムを準備します。
- 定量的出力： 化合物誘発性の線維の安定性またはサイズの変化と相関させることができる泳動パターンのデータを生成します。
- プラットフォームの再利用： 既存のSDD-AGEインフラを活用するため、標準的なゲル電気泳動およびブロッティングツール以外の特殊な装置は必要ありません。
翻訳および前臨床研究
- 疾患との関連性：オンコロジーおよび神経変性疾患におけるアミロイド関連パスウェイに適用され、線維の不均一性がシグナル伝達や毒性に影響を及ぼす可能性があります。
- トランスレーショナルな連続性：in vitroでの知見を天然状態での確認へと繋げ、前臨床モデルにおけるバイオマーカーの整合性を裏付けます。
- メカニズムのデリスク（リスク低減）：線維の変動が生物学的な複雑性に起因するものか、あるいは実験的なアーティファクトによるものかを明確にし、ゴー/ノーゴー決定の判断材料とします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの妥当性確認からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、特に線維の安定性が作用機序に影響を与えるタンパク質凝集経路を標的としたプログラムに有用である。
- 基礎生物学：電気泳動分析における天然の繊維の不均一性と解離アーティファクトを区別することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：観察された繊維パターンが再現可能であり、ゲル誘発性の解離によるものではないことを確認することで、アッセイの標準化を可能にします。
- 分析：定性的な泳動結果（例：対角線状のストリーキングパターン）を提供し、異なる条件下または遺伝的摂動下での繊維の安定性の比較に役立てます。
- トランスレーショナルリサーチ：細胞ベースの凝集表現型を天然状態の検証に結びつけ、前臨床モデルにおけるリスク調整済みの進展を支援します。
- 企業での再利用：複数のアミロイド形成標的にわたって再利用可能なプラットフォーム機能として動作し、冗長なメソッド開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 繊維サイズの不均一性が生物学的に意味があることを確認することで、ターゲット検証における予測の信頼性を高める。
- 運用的価値： 繊維解析における主要な変動要因を排除することにより、研究室間の再現性と標準化を向上させる。
- 戦略的価値：凝集アッセイにおける手法上のアーティファクトから生じる誤ったリードを減らし、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 信頼性の高い繊維安定性データに基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の留意点
- タンパク質生物化学およびゲル電気泳動技術の専門知識が必要です。
- 標準的な電気泳動装置、アガロース、SDS、TAEバッファー、およびブロッティング材料を使用します。
- 再現性のある対角線状の移動パターンを確保するため、電圧、走行時間、およびゲルの取り扱いについてチーム間での標準化が必要です。
- 非アミロイド凝集体に適用する場合、溶解および電気泳動条件の最適化が必要になる場合があります。
- 定性的な評価に限定されており、正確な質量決定が必要な場合の定量的なサイズ測定法に代わるものではありません。
