Name: アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ二次元半変性アガロースゲル電気泳動法で、アミロイド様繊維のサイズ不均一性が電気泳動中の解離によるものか、あるいは本来の特性かを確認する方法です。HT-29細胞を用いて、繊維の安定性とネイティブ状態を評価します。

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この作品の交わりに支えられて s. h. a.NIH/NCATS (TL1TR001104) からウェルチ財団 (I-1827) を与えるし、Z.W. Z.W. に日の出 (RGM120502A) から R01 グラントはテキサス州学者の研究所 (R1222) やがん予防医学研究のバージニア マーチソン リンシカム学者。

1. 試料を準備します。
<ol><li>2 x 10 の文化6アミロイド 10 ml のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清とペニシリン-ストレプトマイシンを含む 10 cm 培養皿に HT 29 大腸がん細胞を生産します。培養細胞は、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩します。<ol>
<li>セルは、80% の confluency に成長後は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml セルを洗浄しています。トリプシン溶液 3 mL を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>セルはお皿から完全解離後培地 10 mL を追加し、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットで細胞を転送します。室温で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心します。培地を吸引を 5 mL の培地、細胞を再懸濁します、携帯カウンターを使用してセルをカウントします。それぞれ 2 つの 10 cm 料理のプレート 2 x 106セルです。</li>
		<li>細胞が接着し、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩回復を許可します。一皿 20 ng/ml の腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、100 nM Smac 擬態と 20 μ M 汎カスパーゼ阻害剤 Z VAD FMK11アミロイドの形成を誘導するために治療を適用します。組み合わせはチーリンと省略されます。コントロールとして車両と他の料理を扱います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な期間後 6 h 通常細胞ライセートの収穫します。<ol>
<li>プラスチックのスクレーパーとプレートから細胞をこすり、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットを使用します。4 ° C で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離します。</li>
		<li>10 mL の氷冷 PBS に再、4 ° C で 3 分間 1,000 × g で遠心分離によってセルを洗浄して 2 回PBS ソリューションを吸い出しなさい。 注: プロセスをここで休止して細胞ペレットを液体窒素で凍結し、˗80 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに細胞ペレットを転送し、0.3 mL の氷の上で 30 分間溶解バッファーで孵化させなさい。4 ° C で 15 分間 20,000 × g で遠心します。上清は全細胞ライセートです。 注: プロセスは、-20 ° c で数ヶ月にサンプルを格納することによってここで休止できます。</li>
		<li>製造元のプロトコルに従ってブラッドフォードの試金蛋白質濃度を測定します。4 x 20 μ 3 μ g/μ L のサンプルを準備し、10 分間室温でインキュベート SDD 時代読み込みバッファーを追加します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 準備し、ゲルを実行
<ol><li>寒天 2 g を 200 mL のガラス製ビーカーで agarose を溶かし、電子レンジで加熱 1 x トリス酢酸バッファー (TAE) に追加します。最終濃度 0.1 %sds の 20 %sds の 1 mL を追加します。慎重に混合旋回します。SDS 添加後泡を生成しないように注意してください。</li>
	<li>15 cm × 14 cm ゲル平板にアガロース溶液を注ぐ。1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去します。1 つの 20 も櫛を上部に配置します。</li>
	<li>まず寸法: ピペット 60 μ g の全細胞ライセート一番右車線で。(染料のフロントはゲルを通って約 ¾) まで約 4 時間 60 V でゲルを実行実行バッファーとして 0.1 %sds を含む TAE を使用します。</li>
	<li>2 番目の寸法: 慎重回転させるとゲル 90 ° 反時計回り (図 2A)。約 4 時間の 60 V でゲルを実行します。 注: 一般的な走行条件は 4 V/cm のゲルの長さです。実行条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることが重要です。</li>
</ol>3. 転送
<ol><li>ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜 (図 2B) に蛋白質を転送するための毛管転送メソッドを使用します。<ol>
<li>転送バッファーの 500 の mL を追加し、約 20 cm × 20 cm のコンテナー。コンテナーの横にあるペーパー タオルの 5 cm 高スタックを確認します。スタックの先頭の表面積は、ゲルの大きさよりも大きくなければなりません。</li>
		<li>転送バッファーの 14 cm x 15 cm のフィルター ペーパーを浸し、紙タオルのスタック上に配置。しわや気泡がない紙の上に注意してください。フィルター紙の別の部分でを繰り返します。</li>
		<li>30 のメタノールで 14 cm x 15 cm PVDF 膜をアクティブに s は、ローラーを使用して、すべてのバブルを削除する世話ろ紙上にレイヤーします。転送バッファーでゲルを洗い流すし、再び任意の気泡をロールアウト、膜上にレイヤーします。</li>
		<li>プラスチック製のラップと転送バッファーのコンテナーに最も近いペーパー タオルの端をカバーします。ペーパー タオルのスタックとの直接接触に次の手順で紙の鉄橋が来ないことが重要です。</li>
		<li>転送バッファーの 15 cm × 35 cm フィルター紙を浸漬し、一端がゲルの上をカバーしてもう一方の端は、転送バッファーのコンテナー内に配置します。別の橋を繰り返します。</li>
		<li>プラスチック製のラップのコンテナーをカバーし、室温で一晩おきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ウエスタンブロット検出
<ol><li>0.05% を含む PBS の 50 mL の膜を洗浄トゥイーン 20 (pbst;) 20 cm × 20 cm のコンテナー。PBST で 5% ミルク 20 mL を追加します。ブロックを 30 分間室温でロック。</li>
	<li>PBST で 5% ミルク 20 mL にウサギ抗 MLKL 抗体の 10 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。4 ° C で一晩ロッカーでインキュベートします。</li>
	<li>5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。</li>
	<li>Pbst; 5% ミルク 20 mL に抗うさぎ HRP の 4 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。ロッカー 2 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。</li>
	<li>基板化学発光 (ECL) を追加し、製造元のプロトコルによると x 線フィルムを公開します。</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

2 D の SDD 時代の最も重要な側面は、電気泳動条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることです。45 ° (解離や劣化が発生しなかったことを示す) でシャープな斜めラインによって異なります両方中に同じ方法で移行する繊維を検出する能力は electrophoreses します。電圧または実行時間の長さを変更するなど、さまざまな条件を使用して、これらの結果があいまいされます。また、従来の 1 次元の場合と同様 SDD 時代、サンプルを沸騰避けるべきである、これはアミロイドとアミロイド様線維が中断されますと。すべての転送として、フィルター ペーパー、膜およびゲルの層間泡を避けるために注意が必要があります。最後に、転送処理中にブリッジしないドループし、ペーパー タオル スタックに直接問い合わせが重要です。信頼性の高い方法これを防ぐためには、ペーパー タオルの端をカバーするプラスチック製のラップの小片を使用することです。
プロトコル (60 V 4 時間) で提供される実行条件を調整可能性があります。たとえば、このプロトコルでは agarose のゲルは 14 cm x 15...

1アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの病態に関与するタンパク質のミスフォールディングによるアミロイド繊維の形成を知られている長い。最近では、アミロイドやアミロイド様線維形成が抗ウイルス自然免疫応答2ネクロトーシス3,4中を含む人間と低い有機体のシグナル伝達経路の一部であると示されています。酵母5,6などしたがって、実験室でこれらの繊維を検出する機能は重要です。現在、アミロイドとアミロイド様線維を検出する 3 つの主な方法があります: 染料、EM、および SDD 時代の使用。
コンゴ赤や Thioflavin T などの染料の使用では、急速な顕微鏡、分光法7を使用して容易に検出できるという利点を提供しています。しかし、コンゴ赤の場合、顕微鏡による検出には、繊維、または繊維のサイズを構成するタンパク質の特異性は提供しません。同様に、コンゴ赤または Thioflavin T のバインディングを蛋白質の複合体を検出する分光学の使用は、正または負の結果のみを提供します。
EM は、繊維と繊維の長さと直径の8について定量的な情報の存在の決定的な証拠を提供します。ただし、この方法では、非常に厳格な浄化が必要です。さらに、EM は高価な機器を使用する特殊な技術です。
SDD 時代は、SDS 耐性メガ ダルトン タンパク質やアミロイドのようなアミロイド繊維を含むを検出するために使用されています。多くの利点を提供しています。最初に、それは繊維の精製を必要としないし、peform9に簡単です。第二に、それは相対的なサイズおよび繊維の heterogenicity の量を含む繊維のサイズに関する定性的情報を提供します。ウェスタンブロッティングは、電気泳動後実行できます、ために、最後に、それは、SDD 時代は半変化、いくつかのエピトープが隠されたままにするそれに注意する必要がありますを任意のタンパク質、抗体がある存在を検出する簡単です抗体による検出を複雑になります。
最近では、受容体相互作用タンパク質キナーゼ 1 (RIPK1) と 3 (RIPK3) は、ネクロトーシス、壊死3のプログラムのフォームの間にプラットフォームをシグナルとして機能するフォーム アミロイド線維に報告されています。これらの繊維を勉強しながら私たちの研究室は、リネージュ キナーゼ ドメインのような (MLKL) を混合、別のネクロトーシス関連蛋白質がまた4アミロイド様線維を形成を示した。しかし、SDD の年齢を調べると、MLKL 繊維のサイズ登場登場お互い (図 1) と同じ RIPK1 と RIPK3 の繊維とは異なる。MLKL RIPK1/RIPK3 にバインド ネクロトーシス シグナリング複合 necrosome10と呼ばれる形成して知られているのでこれは予想外だった。
少なくとも 2 つの説明があります。最初に、2 つのまったく異なるアミロイドのような繊維がネクロトーシス、1 つ含む RIPK1/RIPK3 およびその他の含まれている MLKL の中にフォームがあります。第二に、含む RIPK1/RIPK3/MLKL 可能性がありますネクロトーシス、MLKL 協会他の蛋白質との間に形成されるアミロイド様線維の 1 種類のみですそれは SDD 時代の間に電離する十分に弱いです。
これに対処するため二次元 (2 D) SDD 時代を実行することを提案します。SDD 時代安定アミロイドやアミロイド様線維は最初と 2 番目のディメンションの電気泳動中に同じの移行パターンをあります。膜へのタンパク質の転送、西部のしみの実施後、これは検出可能になります。安定した繊維は、シャープな斜めパターンを展示いたします。これからの逸脱は、繊維が SDS 電気泳動による変化を受けることを示唆するでしょう。

<table><tbody><tr><td>ゲル電気泳動ユニット</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus ゲルランニング用。</td></tr><tr><td>アグロース</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>アガロースゲル用。</td></tr><tr><td>ペーパータワー</td><td>フィッシャー</td><td>19-120-2484</td> 濾紙<td>の転写用</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>21427-386</td> PVDF 膜<td>の転写用</td></tr><tr><td></td><td>バイオ・ラッド</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング粉乳</td>の移送用 <td>バイオ・ラッド</td><td>1706404XTU</td><td>ウェスタンブロットでのブロッキング</td></tr>用 <tr><td>MLKL 抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>ウサギ 抗 MLKL 抗体</td></tr><tr><td>RIPK1抗体</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>610459</td><td>マウス抗RIPK1抗体</td></tr><tr><td>RIPK3抗体</td><td>Xiaodong Wang</td><td></td>ウサギ<td>抗RIPK3博士からの贈り物。参照 11.</td></tr><tr><td>抗ウサギHRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ECL</td><td>フィッシャー</td><td>WBKLS0500</td><td>ウェスタン化学発光HRP基質</td></tr><tr><td>X線フィルム</td><td>フィ</td><td>ッシャーF-BX810</td>(<td>ウェスタンブロット用</td></tr>) <tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td>(<td>ウ</td></tr><tr><td>シ胎児血清</td>用) シ<td>グマ</td><td>F4135</td>(<td>細胞培養</td></tr><tr><td>用)ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>P4333</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>トリプシン溶液</td><td>Σ</td><td>T4049</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>用 PBS 組織培養用 Σ</td><td></td><td>D8662</td> 細胞<td>培養</td></tr><tr><td>用組換えTNF</td> ネクロプトーシスを誘導するために<td>当研究室</td><td></td>で製造した<td>。参考文献11を参照してください。</td></tr><tr><td>Xiaodong Wang</td><td></td>博士からの<td>smac模倣ギフト</td><td>で、ネクロプトーシスを誘発します。参考文献11を参照してください。</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td> ネ<td>クロプトーシスの誘導用。参考文献11を参照してください。</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; 細胞数計数用</td></tr><tr><td>Pierce&trade;BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>細胞溶解物中のタンパク質濃度測定用</td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-364</td><td>皿から細胞を除去</td></tr><tr><td>溶解バッファー (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL グリセロール 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (プロテアーゼおよびリン酸塩阻害剤)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48.4 g Tris base 11.42 mL 氷酢酸 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE ローディングバッファー (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL グリセロール 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% ブロモフェノール blue 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>TBS トランスファーバッファー (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>PBST Wash Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10XPBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot;2H2O 24g KH2PO4 ddH2O を 10 L に追加</td></tr></tbody></table>

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 agarose のゲル電気泳動の使用

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

アミロイドやアミロイド様線維は多くの人間の病気に関連付けられている、今多くのシグナル伝達経路の重要であることが発見されています。様々 な実験条件下でのこれらの繊維の形成を容易に検出する機能は潜在的な機能を理解するために不可欠です。多くの方法は、繊維を検出するために使用されているいくつかの欠点がないわけで。たとえば、電子顕微鏡検査 (EM) やコンゴーレッドまたは Thioflavin T にしばしば染色繊維の精製が必要です。その一方で、半変化洗剤アガロース電気泳動 (SDD-年齢) は精製することがなく細胞抽出液の SDS 耐性のアミロイド様線維の検出をことができます。さらに、それは繊維の大きさの違いの比較をことができます。もっと重大に、それは西部にしみが付くことによって繊維内の特定の蛋白質を識別するために使用できます。時間がかかるであり、ラボの広い数をより簡単にアクセスできます。SDD 時代結果しばしば不均質性が変化します。それはタンパク質の SDS 存在下での電気泳動の中に複合体の解離に起因する不均一性の一部であるかどうか質問を上げます。このため、我々 は SDD 時代の SDD 時代に見られるサイズの不均一性が真に繊維不均質体内の結果、劣化または中にタンパク質のいくつかの解離の結果ではないかどうかの 2 番目の次元を採用しています。電気泳動。このメソッドは、SDD 時代プロセス中にアミロイドやアミロイド様線維が部分的に解離しない高速、定性の確認できます。

ネクロトーシス誘導後 RIPK1 と RIPK3 は、ほぼ同一のアミロイドのようなパターン (レーン 2、4、図 1) を示した。しかし、MLKL 繊維はより均一であった、RIPK1/RIPK3 繊維 (レーン 6、図 1) よりも小さくなるように見えた。求め、私たちは MLKL フォーム RIPK1/RIPK3 に依存しない繊維または MLKL を単に SDD 時代に大規模な RIPK1/RIPK3/MLKL 繊維から分離するかどうか、可能性に対処するため 2次元 SDD 時代手法を開発します。
電気泳動および転送プロシージャの一般的な回路図を図 2に示します。SDD 時代最初の次元の中にアミロイドやアミロイド様線維を図 3</st...

ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

この二次元半変性洗剤アガロースゲル電気泳動の全体的な目標は、従来のSDD-AGEで見られたアミロイドまたはアミロイド様繊維のサイズ不均一性を確認することです。この方法は、従来のSDD-AGEで見られたサイズの不均一性がin vivoでの繊維の天然状態なのか、ゲル電気泳動中のタンパク質の分解または解離の結果なのかなど、アミロイドまたはタンパク質凝集分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特殊な機器を使用せずにラボで簡単に実行できることです。従来のSDD-AGEで使用されているもの以外に追加の機器は必要ありません。まず、アミロイド産生HT-29結腸がん細胞を10cmの組織培養皿に播種します。次に、細胞を摂氏37度で一晩、5%の二酸化炭素でインキュベートします。細胞が80%のコンフルエント度に達したら、リン酸緩衝生理食塩水を使用して細胞を洗浄します。次に、3ミリリットルのトリプシンを細胞に加え、摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞が培養皿から分離した後、プレートに10ミリリットルの培地を追加します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞懸濁液を室温で3分間、1,000倍gで遠心分離する。遠心分離後、培地を吸引し、細胞ペレットを5ミリリットルの培地に再懸濁します。セルカウンターを使用してセルをカウントします。次に、2つの培養プレートを摂氏37度で一晩放置します。次に、培養皿の1つにTSZ試薬を治療として加えます。約6時間後、プラスチックスクレーパーを使用して細胞を採取します。次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、摂氏4度で3分間1,000倍gで遠心分離する。次に、細胞ペレットを10ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、遠心分離プロセスを繰り返します。次に、PBS溶液を吸引し、細胞ペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。0.3ミリリットルの溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、氷上で30分間インキュベートします。再び、摂氏4度で15分間、20, 000倍のgで遠心分離します。得られる上清は全細胞溶解物です。上清に4X SDD-AGEバッファーを加えて、サンプル1マイクロリットルあたり3マイクログラムの20マイクロリットルを調製します。サンプルを室温で10分間インキュベートします。ゲルを調製するには、ガラスビーカー中の200ミリリットルのTAEバッファーに2グラムのアガロース粉末を加えます。次に、ビーカーを電子レンジで加熱してアガロースを溶かします。次に、20%SDSを1ミリリットル加えて最終濃度0.1%ビーカーを静かに渦巻きます。次に、液体アガロースを15 x 14 cmのゲルスラブに注ぎます。気泡を取り除くには、1ミリリットルのピペットを使用します。次に、ゲルの上に20ウェルコームを置きます。次に、ゲルの右端のレーンに約60μgの全細胞ライセートを加えます。0.1%SDSを含むTAEバッファーをランニングバッファーとして使用して、ゲルを60ボルトで約4時間泳動します。ゲルを2次元に泳動させるには、ゲルを反時計回りに90度慎重に回転させます。その後、ゲルを60ボルトで約4時間泳動します。20 x 20 cm のコンテナに、500 ミリリットルの転写バッファーを追加します。コンテナのすぐ横に、高さ5センチのペーパータオルのスタックを準備します。次に、2枚の濾紙(それぞれ14 x 15 cmの寸法)を転写バッファーに浸し、ペーパータオルのスタックの上に置きます。メタノール中の14 x 15 cmのPVDFメンブレンを30秒間活性化します。活性化後、メンブレンを濾紙の上に置き、ローラーを使用してすべての気泡を取り除きます。転写の最も重要な部分は、ゲルとメンブレンの間に気泡が形成されていないことを確認することです。ゲルを転写バッファーですすぎ、メンブレンの上に重ねます。形成された気泡をロールアウトします。次に、ラップを使用して、転写バッファー容器に最も近いペーパータオルの端を覆います。次に、15 x 35 cmの寸法の濾紙を転写バッファーに浸します。一方の端がゲルの上部を覆い、もう一方の端が転写バッファー容器に入るように濾紙を置きます。容器をラップで覆い、室温で一晩放置します。翌日、20 x 20 cmの容器に50ミリリットルのPBSTでメンブレンをすすぎます。次に、メンブレンにPBST中の5%ミルク20ミリリットルを追加します。その後、メンブレンをロッカーに室温で30分間放置してブロックします。10マイクロリットルのウサギ抗MLKL抗体をPBST中の20ミリリットルの5%ミルクにピペットで移します。次に、抗体ミックスをメンブレンに添加します。メンブレンをロッカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、メンブレンを20ミリリットルのPBSTで5分間洗浄します。この洗濯を5回繰り返します。次に、4マイクロリットルの抗ウサギHRP抗体をPBST中の20ミリリットルの5%ミルクにピペットで移します。メンブレンに抗体を添加します。ロッカーにメンブレンを載せた容器を室温で2時間放置します。2時間後、メンブレンを20ミリリットルのPBSTで5回、それぞれ5分間洗浄します。最後に、強化された化学発光基質をメンブレン上に加えます。次に、製造元の指示に従ってメンブレンをX線フィルムにさらします。この研究は、腫瘍壊死因子α処理細胞から得られた全細胞溶解物中のSDS耐性アミロイド様線維の存在を実証するために行われます。ここでは、RIPK1とRIPK3が同様の同一のアミロイド様パターンを示すことを示しています。興味深いことに、MLKL繊維は他の繊維とは異なる移動パターンで不均一に見えます。この画像は、アミロイドまたはアミロイド様繊維の可能な移動パターンを示しています。1次元SDD-AGEでは、アミロイドまたはアミロイド様繊維が特徴的な塗抹標本を示します。この画像では、繊維は 2 回目の実行で同じように移動し、メンブレン上 45 度で斜めの移動パターンを示しています。これは、ゲルのランニングプロセス中に繊維が劣化または解離しないことを示しています。それどころか、繊維が解離すると、対角線の下に垂直な縞模様が生じ、2回目の電気泳動中に小さな繊維がより速く移動することを示しています。これらの 1 次元と 2 次元の SDD-AGE はどちらも、MLKL ファイバーが SDD-AGE プロセス中に解離せず、実際に RIPK1 ファイバーや RIPK3 ファイバーとは異なることを示しています。この画像では、MLKL繊維は最初の次元で特徴的な汚れを示しています。しかし、同じ繊維は、2次元SDD-AGEでは垂直な縞模様のない鋭い斜めの線を示しています。この手順を試みるときは、電圧や配線の長さなどのすべての条件が 1 次元と 2 次元の間で同じままであり、45 度の角度で鋭い線が確保されることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、メンブレンのストリッピングや他の抗体による再プローブなどの他の方法を実行して、繊維に他のタンパク質が含まれているかどうかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、従来のSDD-AGE中にアミロイドまたはアミロイド様繊維の分解や解離が起こっていないことを確認する方法を十分に理解しているはずです。

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生物化学

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学ぶ二次元半変性アガロースゲル電気泳動法で、アミロイド様繊維のサイズ不均一性が電気泳動中の解離によるものか、あるいは本来の特性かを確認する方法です。HT-29細胞を用いて、繊維の安定性とネイティブ状態を評価します。

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