Name: 組織工学用植物組織の Decellularization の 2 つの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学ぶ植物組織の脱細胞化法。界面活性剤を用いる方法と無界面活性剤の2手法を比較し、細胞外マトリックスを保持したスカフォールドを作成する技術を解説。組織工学への応用可能性を探る。

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快くこのプロジェクトで使用される試料を供給するためオルブリッチ庭園のジョン ・ ワースに感謝したいと思います。この作品は、国民の中心、肺および血の協会で一部サポートされて (G.R.G.、R01HL115282)全米科学財団 (DGE1144804 J.R.G、G.R.G.)、ウィスコンシン大学外科教室と同窓会基金 (H.D.L.)。この作品は、環境保護庁 (星グラント号 83573701)、国立衛生研究所 (R01HL093282 01A1 と UH3TR000506)、全米科学財団 (IGERT DGE1144804) 部分で支えられましたまた。

1. 洗剤ベースのアプローチを使用して植物組織の decellularization
<ol><li>
新鮮なまたは冷凍F. オオバアサガラ葉のサンプルを使用します。-20 ° C のフリーザー (1 年) 将来の使用のための店で未使用の新鮮な試料を凍結します。 注: は、ほぼあらゆる目的の植物の茎や葉の組織を使用します。拡張ストレージ時間は、組織への損傷を引き起こす可能性が。<ol>
<li>サイズとサンプルの意図されていた使用に基づいて処理されるサンプルの形状が決まります (短冊状にカット サンプルすなわち機械的テスト アプリケーションに適しています、一方 8 mm ディスク サンプル ウェル培養アプリケーションに有用であります。).室温 (20-25 ° C) 脱イオン H2o ・水没中パンチ シャープ、きれいな生検で 8 mm ディスクに葉をカットします。 注: このプロトコルは、全体の葉や茎で使用できます。ただし、小さいサンプルが高速 decellularize します。</li>
		<li>室温 (20-25 ° C) 脱イオン H2O の洗浄および/またはそれらを解凍する低速設定に振るプレート セットで 5-10 分のためのサンプルをインキュベートします。十分な脱イオン H2O を使用すると、すべてのサンプルは徹底的に接液します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
適当な容器 (ガラスまたはプラスチックの皿が理想的です) のサンプル 10% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 脱イオン H2o ・場所でのソリューションを準備し、SDS サンプルを完全にカバーするソリューションを追加します。室温 (20-25 ° C) で 5 日間のサンプルへの損傷を防ぐための低速度に振るプレート セットのサンプルをインキュベートします。 注: は満杯になるコンテナー decellularization プロセスを遅らせるし、SDS によって不均一な治療につながることができます。この手順では、サンプルは、茶色の色調を獲得すべき。<ol>
<li>5 日後に置き換えます SDS ソリューション脱イオン H2o ・加温残留 SDS ソリューションを徹底的に洗い流す振るプレートに追加の 10 〜 15 分のためのサンプル。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1% (v/v) の非イオン性界面活性剤 10% (v/v) の漂白剤溶液を準備します。500 mL の溶液を作る、非イオン性界面活性剤の 5 mL の漂白剤 50 mL を混ぜて、脱イオン H2o ・ サブマージ 445 mL を加える作りたてのソリューションのサンプルします。 注: 非イオン性界面活性剤/漂白剤の解決は従って長い貯蔵寿命がない、準備の 48 時間以内に使用する必要があります。</li>
	<li>
サンプルが完全にクリアされるまで、非イオン性界面活性剤/漂白剤ソリューションすべての 24 h を置き換える (視覚的比較のため図 1 aを参照してください)。余分な非イオン性界面活性剤/漂白剤溶液を洗い流す純水を 2 分間振るプレート上にサンプルをインキュベートします。振動板を試料の損傷を防ぐために低設定に設定します。 注: 使用サンプルをクリアするために必要な時間は、種類や植物の種類によって異なります。サンプルの完全な変色は、完全 decellularization の示す (徹底したクリアリングを確保するため DNA の定量化を行う)。<ol>
<li>年までそれらを格納するサンプルを凍乾 (液体窒素を用いて凍結フラッシュをお勧め、-80 ° C のサンプルを凍結も可能です)、室温 (20-25 ° C) の低湿度で保管します。</li>
		<li>トリス-HCl (10 mM、pH 8.5) のサンプルを再構成十分なコートのサンプルを使用します。優しく使用 (すなわち使用 150-300 μ L/標準 24 well プレート リンスイン) する前にマイクロ ピペットを使用して血清自由な媒体のサンプル 2-3 回をすすいでください。 注: トリス塩酸バッファーと無血清メディア (すなわちDMEM がメディアを置き換えることができます任意の基本的な細胞培養) 脱イオン H2O だけで治療を受けた人よりも扱われる SDS サンプルの細胞生存率への影響を下げることに効果的です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 洗剤無料 Decellularization アプローチを使用して試料の調製
注: この手順の最初の手順は、手順 1.1 1.1.2 (上記参照) と一致します。
<ol><li>5% (v/v) の漂白剤 (NaClO) と 3% (w/v) (NaHCO3) 重炭酸ナトリウム溶液を準備します。F. オオバアサガラの葉のサンプルにホット プレート攪拌しながら 8 mm ディスクにカットの 60-70 ° C に発煙のフード ソリューションを温めます。 注: 重炭酸ナトリウムは、炭酸ナトリウム (Na2CO3)、または水酸化ナトリウム (NaOH) と代替可能します。所望の温度は大きく (部屋温度 90 ° C) から変化し、使用するサンプルの特性に応じて調整する必要があります。</li>
	<li>ソリューションには、所望の温度範囲が達すると、サンプルが水没、それらが損傷しないように攪拌速度を減らします。サンプルが目に見えてクリア後 (視覚的比較のため図 1 bを参照)、お風呂から慎重に取り外します。脱イオン H2O に余分な漂白剤溶液を削除する 1-2 分で一度サンプルをインキュベートします。 メモ: サンプルをオフに必要な時間はかなり異なることができます。たとえば、全体の葉の茎は、高温のお風呂は完全にオフの時間を取ることができるように、カット パセリが厚い、大きなサンプル中の 10-15 分でクリアできます。</li>
	<li>サンプルを凍結乾燥し、室温 (20-25 ° C) の低湿度で保管します。</li>
</ol>

<ol><li>Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+from+first+principles+to+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+function+of+hepatocytes+on+a+novel+three-dimensional+synthetic+biodegradable+polymer+scaffold+with+an+intrinsic+network+of+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels.</a> Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).</li>
<li>Park, A., Wu, B., Griffith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+surface+modification+and+3D+fabrication+techniques+to+prepare+patterned+poly%28L-lactide%29+substrates+allowing+regionally+selective+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterial+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion.</a> Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).</li>
<li>Steinhoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+pulmonary+heart+valves+on+allogenic+acellular+matrix+conduits%3A+in+vivo+restoration+of+valve+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+JAMA.+102+%28Suppl+3%29%2C+III-50-+III+-55%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue.</a> Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).</li>
<li>Stock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+valved+conduits+in+the+pulmonary+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).</li>
<li>Ott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Guyette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li>
<li>Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Mesh+Implants+for+Abdominal+Hernia+Repair%3A+US+Food+and+Drug+Administration+Approval+Process+and+Systematic+Review+of+Its+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Surgery%22%5BJournal%5D)">Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy.</a> JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).</li>
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<li>Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+osteoblastic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+on+hydroxyapatite%2Fbacterial+cellulose+nanocomposite+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds.</a> Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928493106003523">Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications.</a> Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+injectable+cellulose-based+hydrogel+for+the+transfer+of+autologous+nasal+chondrocytes+in+articular+cartilage+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silanized+hydroxypropyl+methylcellulose+hydrogel+for+the+three-dimensional+culture+of+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes.</a> Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cartilage+with+human+nasal+chondrocytes+and+a+silanized+hydroxypropyl+methylcellulose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).</li>
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<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aligned+nanofibrous+collagen+scaffold+by+electrospinning+and+its+effects+on+in+vitro+fibroblast+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shape-controlled+tuneable+microgel+platform+to+modulate+angiogenic+paracrine+responses+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells.</a> Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).</li>
<li>Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/tb/c5tb01640a">The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).</li>
<li>Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+cellulose+sponge+degradable+or+stable+as+implantation+material%3F+An+in+vivo+subcutaneous+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat.</a> Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).</li>
<li>Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biocompatibility+of+cellulose+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiac+cell+constructs+on+cellulose-based+scaffolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding.</a> Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).</li>
<li>Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+Subcutaneously+Implanted+Plant-Derived+Cellulose+Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials.</a> PLoS One. 11 (6), e0157894(2016).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで、植物組織を decellularize に 2 つの方法を説明します。ここでは、提示される結果25先行研究の結果と相まって出すプロトコルが可能性があることをお勧めの広いスペクトルに適用される植物種と茎と葉の両方で実行できます。これらの手順は単純な特殊な機器は必要ないので植物 decellularization は、ほとんどの実験室で行うことが。それは decellularization 後、足場必要が哺乳類の細胞接着を促進する官能基化する注目に値するです。哺乳類細胞接着と組織されている植物の成長を有効にする別の機能化技術は25現在原稿のないトピックは他の場所で説明します。
ここで紹介する decellularization プロトコル両方 (図 1) の最後のステップは彼らの成功に批判的であった。いずれかの方法を実行するはこのお風呂が混雑ないときは不均一なクリアになります。これらのメソッドは、全体の葉と茎; に適用できま...

組織工学生体組織を作成する 1980 年代の代理および可能性のあるアドレス重要な臓器不足1。1 つの戦略は、足場を刺激し、行方不明の組織や臓器を再生する体をガイドに使用しています。高度な 3次元印刷を作り出した独特な物理的性質の足場などにアプローチを製造、達成可能な物理的な生物的特性の多様な範囲の足場を製造する能力がチャレンジ2,3。 また、機能血管ネットワークの不足は、これらの技術が限定されていました 3 次元組織を再生します。足場として脱動物と人間組織の使用が回避この問題4,5,6,7で支援します。ただし、高コスト、バッチ間の可変性および限られた可用性の広まった使用を制限可能性があります脱動物骨格の8。患者に潜在的な病気の感染やいくつかの哺乳類ティッシュの脱9に対する免疫学的反応の懸念もあります。
セルロース、植物および細菌のソースから派生は、再生医療で幅広い用途のためのバイオマテリアルを生成する広く使用されています。いくつかの例があります: 骨10、11、軟骨12,13,14と創傷治癒の15。足場を構成するセルロースの耐久性と耐性を哺乳類細胞によって分解されている付加的な利点があります。これは、哺乳類細胞はセルロース分子を分解に必要な酵素を生成しないためにです。比較では、足場はコラーゲンなどの細胞外マトリックスから高分子を使用して生産、16容易に分解され、長期的なアプリケーションには適していない場合があります。コラーゲンの足場は、化学架橋により安定化することができます。ただし、足場17の生体適合性に影響を与えるゲルビーズの固有の毒性のためのトレードオフがあります。逆に、セルロースには、哺乳類細胞18,19,20による酵素分解に不浸透ではないため長時間の注入のサイトで存在を維持する可能性があります。これは加水分解前処理の分解の率およびセルラーゼ21足場の共同配信をチューニングすることによって変更できます。植物由来セルロースの脱足場体内の生体適合性は、マウス22に行われた研究で実証されています。
進化の何百万年の何百も、植物はその構造と流体輸送と保存の効率を高めるための構成を洗練しています。工場血管は、小型船の場合、マレーの法23によると哺乳類の血管のように分岐することで油圧抵抗を最小限に抑えます。Decellularization 後、植物の相互接続された毛穴と血管の複雑なネットワークは維持されます。、すぐに利用できる異なる植物種の膨大な数を考慮した植物由来足場現在組織工学24,25の足場に影響を与える設計上の制限を克服するために可能性があります。例えば、Modulevskyらは脱アップル組織は皮下22マウスの背中に移植されたときに血管新生や細胞の移行が発生したことを示した。同様に、Gershlakらは、血管内皮細胞を脱葉24の血管内で成長するかもしれないことを示した。別の実験では、Gershlakらは心筋細胞が葉の表面上に成長させることができる、24を契約することができたことを示すことができるも。
植物には、複雑な組織を細胞からマクロ スケールで培った高度な製造技術とも達成するために困難であるにも含まれます。植物組織の複雑な階層設計、それらを彼らの成分26の合計よりも強く。植物は堅く、堅い茎等に至る種々 の機械的特性の茄多を持っている、27の葉よりフレキシブルで柔軟なものにします。葉は、サイズの面で種によって異なります、形状、破壊強度、血管新生、性、親水性の程度が異なるを運ぶことができます。全体的にみて、これらの植物のプロパティは、脱植物がティッシュ工学足場などのユニークで高機能な医療機器として使用できることを提案します。
このプロトコルは植物組織を decellularize に 2 つの方法に焦点を当てて、ようの葉し、茎、再生組織工学における足場として使用するため。最初の方法は DNA および哺乳類 decellularize し、組織6,22,25 を植物に広く使われている技術から適応されている携帯電話の問題を削除する風呂のシリーズを使用して洗剤ベースの技術 ,28,29,30。2 番目のメソッドは洗剤無料、一般に葉31の軟部組織を削除するために使用「白骨」プロトコルから適応。前の仕事を示したことは血管の周囲の軟部組織の31からの分離を促進漂白剤と炭酸水素ナトリウムの溶液に葉をぐつぐつ煮えます。この手法は、17回と 18th世紀、アルベルトゥスマグヌス セバ32とエドワード ・ パリッシュ33の仕事などで行う実験に引用できます。これらの実験は、葉や果物などの植物の問題を残すことのまわりの中心は長時間水に浸漬時間 (週か月) と当然のことながら朽ち果てるに柔らかい組織を許可します。ここで「白骨化」アプローチは、細胞残渣を削除する、かなり軟部組織構造を崩すことを避けるために低温培養時間が長くなるなど、穏やかな条件を使用する適応されます。ここに詳細な実験、3 つの植物のタイプを使用しました:イチジク オオバアサガラ、パキラアクアティカとフクギの種。DNA の定量化、機械テスト、および両手法による細胞の代謝活性に与える影響の結果を説明します。

<table><tbody><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma Life Science</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>807426</td><td>論文で参照されている非イオン性界面活性剤。非常に粘性のある試薬で、ピペットの先端を伸ばすときに端を切るのに役立ちます。</td></tr><tr><td>濃縮漂白剤(8.25%次亜塩素酸ナトリウム)</td><td>クロロックス</td><td>アイテム#: 31009</td><td>標準的な濃縮漂白剤。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Acros Organics</td><td>217120010</td><td>水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムで代用できます。</td></tr><tr><td>8 mm Biopunch</td><td>HealthLink</td><td>15111-80</td><td>24ウェルプレートによく収まるサンプルをカット</td></tr>します <tr><td>ベリーダンサー-シェイクテーブル</td><td>ストーバルライフサイエンス</td><td>BDRAA115S</td><td>組織を傷つけないように低速で使用します。任意のモデル/ブランドのシェイクテーブルを使用できます。</td></tr><tr><td>Isotempホット/スタープレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ックは、<td>ホット/スタープレートの任意のスタイル/ブランドを使用することができます。</td></tr><tr><td>ビーカー</td><td>Any</td><td></td><td>それがあなたのサンプルにフィットし、それらを過密にしない限り、任意のサイズのビーカーを使用できます。</td></tr><tr><td>トリス塩酸塩</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング</td><td>MT50003PC</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNAアッセイ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ P11496</td><td>手元にある任意のdsDNA定量化方法を使用することができます。</td></tr></tbody></table>

組織工学用植物組織の decellularization の 2 つの方法

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

組織置換のための足場として使用されて自己、合成、動物由来の移植率の低い、貧しい生体適合性、コストなどの制限があります。植物組織に適して表面積が大きく、優れた水の輸送と保存などの足場として相互接続された気孔率、既存の血管ネットワーク、および機械の広い範囲を使用して、それら有利な特性を持っています。プロパティ。組織工学用植物 decellularization の 2 つの成功した方法は以下のとおりです。最初の方法は、洗剤お風呂使用の哺乳類ティッシュをクリアする以前に確立された方法に類似している携帯電話の問題を削除するに基づいています。2 番目の葉の血管系を分離し、葉と茎をクリアする塩浴と温水の漂白剤の使用を含むプロトコルから適応洗剤無料メソッドです。両方のメソッドは、同等の機械的性質と低細胞代謝の影響より良い自分の用途に合ったプロトコルを選択するユーザーをできるように足場を得られます。

両方の方法は、細胞培養と組織エンジニア リング アプリケーションにより適していた足場を得られました。図 1は、洗剤手法や洗剤を使用しない方法のために切断された試料 (直径 8 mm) をそのまま葉を使用して decellularization プロセスの一般的なワークフローを示します。フィカス オオバアサガラ組織両方の方法を次の成功した decellularization は、はっきりとそのままのサンプル (図 1Aおよび1 b) を得られました。全体植物組織 (図 1 a); を decellularize することが可能だったしかし、小さいサンプルより速くより効果的にオフに登場。洗剤ベースのアプローチで観察される潜在的な問題には、非イオン性界面活性剤浴 (図 1) から早期の削除の...

ここで私たちは、現在し、コントラストの 2 つのプロトコルを使用して植物組織を decellularize: 洗剤ベースのアプローチと洗剤無料アプローチ。両方の方法は、組織工学用の足場として利用することができます使用、植物組織の細胞外のマトリックスを残します。

組織工学用植物組織の Decellularization の 2 つの方法

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

これらの方法は、高度な超構造とスケーラブルな製造を備えた優れた流体移動能力を備えた足場の開発など、生体材料分野の重要な問題に対処するのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、特殊な機器を必要とせずに、ほとんどの植物に茎組織に適用できることです。まず、F.hispidaの葉の新鮮または冷凍のサンプルを収集します。残りの新鮮なサンプルは、将来の使用のために摂氏マイナス20度で保管してください。葉を摂氏20〜25度の脱イオン水に浮かび上がらせます。きれいな生検パンチを使用して、葉を直径8ミリメートルの円盤に切ります。次に、葉のサンプルを洗浄するために、脱イオン水に浸したシェイクプレート上で低速で5〜10分間インキュベートします。次に、脱イオン水にSDSを容量で10%調製します。SDS溶液を調製した後、葉のサンプルをプラスチック皿に置きます。次に、SDS溶液を追加してサンプルを完全に覆います。SDSエマードリーフサンプルを蓋をして、蒸発を防ぐためにシェイクプレートに置きます。次に、葉のサンプルを室温で5日間インキュベートします。5日間のインキュベーション後、SDS溶液を脱イオン水と交換します。脱イオン水に浸したサンプルをシェイクプレート上で10〜15分間インキュベートします。次に、5ミリリットルの非イオン性界面活性剤と50ミリリットルの漂白剤を混合します。この混合物を445ミリリットルの脱イオン水に加えます。次に、新たに調製した非イオン性界面活性剤漂白剤溶液にサンプルを入れます。サンプルがクリアされるまで、24時間ごとに非イオン性界面活性剤漂白剤溶液を交換し続けます。次に、透明化したサンプルを脱イオン水にエマージュし、シェイクプレートに2分間置きます。界面活性剤を含まない脱細胞化のためには、3体積%の重炭酸ナトリウム溶液中に5体積の漂白剤を調製します。次に、ヒュームフード内のホットプレートで溶液を摂氏60〜70度に温めます。溶液が目的の温度に達したらすぐに、葉のサンプルを浸します。次に、サンプルの損傷を防ぐために攪拌板の速度を下げ、目に見える形でクリアされたサンプルを探して、バスから慎重に移します。最後に、サンプルを脱イオン水で1〜2分間インキュベートします。すべてのサンプルは本質的に異なるため、サンプルが損傷を受けていないことを確認するために、約15分ごとに脱細胞化の進行状況を確認することをお勧めします。MTM、SAF、およびUTSパラメータは、P.aquatica種とF.hispida種の両方のユニークな脱細胞化足場特性を調査するために最初に研究されます。実際、3つのパラメータはすべて、界面活性剤ベースの脱細胞化法と界面活性剤を含まない脱細胞化法の両方を使用して、同様の機械的特性を示します。しかし、F.hispidaのUTS機械的特性は、脱細胞化のために漂白剤ではなくSDSを使用した方が有意に高い平均値を示しています。また、研究対象となった植物種のゲノムDNA含量は、非脱細胞化サンプルと比較した場合、脱細胞化時に大幅に減少します。次に、ヒトの真皮甲状腺芽細胞の代謝活性も、脱細胞化されたP.aquaticaまたはGarciniaの足場の存在下で測定されます。興味深いことに、洗剤を含まないベースの足場は、細胞代謝活性に対する影響の減少を誘発したが、トリス塩酸緩衝液による洗浄、続いてSDSクリア後に無血清培地による洗浄は、脱イオン水のみで洗浄した場合と比較すると、細胞代謝活性に対する影響を減少させる。最後に、F.hispidaの葉構造の表面に焼成で染色した間葉系幹細胞の増殖を示します。これらのテクニックを習得すると、適切に実行すれば、約7日から最短15分で完了することができます。これらの手順を実行するときは、サンプルがバッチごとに異なる可能性があり、クリア時間が異なる可能性があるため、サンプルが脱細胞化するときにサンプルを監視することを忘れないでください。この手順に続いて、減量化や機械的試験などの他の方法を適用して、サンプルがどの程度クリアされているか、サンプルが機械的に類似している他の組織は何かなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、組織工学の分野の研究者が灌流可能な足場を製造する道を開くのに役立ちました。このビデオを見た後、足場として使用するために植物組織を脱細胞化する方法についてよく理解しているはずです。洗剤や漂白剤の煙を扱う作業は危険な場合があり、これらの手順を実行する際には、適切な保護具の使用やドラフトの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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全肝臓の細胞化とRecellularization

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記事では、ラットの腸から無細胞マトリックスを製造するための方法論を説明します。腸の足場の導出は、細胞生物学および薬物検査幹、組織工学における将来の用途のために重要である。...

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Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法

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マウス心肺複合体の脱細胞化

このプロトコルは、脱細胞化ラット腎臓を用いた足場を開発する方法を導入する。このプロトコルには、バイオアベイラビリティを確認するための脱細胞化および再細胞化プロセスが含まれます。脱細胞化は、トリトンX-100およびドデシル硫酸ナトリウムを用いて行われる。...

ラットにおける脱細胞化腎臓足場の調製

プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。...

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

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骨組織工学のための脱細胞化リンゴ由来の足場( In Vitro および In Vivo)

学ぶ植物組織の脱細胞化法。界面活性剤を用いる方法と無界面活性剤の2手法を比較し、細胞外マトリックスを保持したスカフォールドを作成する技術を解説。組織工学への応用可能性を探る。

組織工学用植物組織の Decellularization の 2 つの方法

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