Name: 格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ格子光シート顕微鏡を用いたT細胞受容体の4次元ダイナミクス可視化法。CD4+初期T細胞の表面受容体をリアルタイムで追跡し、高時空間分解能と低光漂白性を活かした生細胞イメージング技術を解説します。

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シカゴ大学のヴィタス・ビンドカス博士からの助言と指導を受け、お知りしたいと思います。私たちは、格子光シート顕微鏡をサポートし、維持するためにシカゴ大学の統合光顕微鏡コア施設に感謝します。この作品は、NIH新イノベーター賞1DP2AI144245とNSFキャリアアワード1653782(To J.H.)によってサポートされました。J.R.は、NSF大学院研究フェローシッププログラムの支援を受けています。

5C.B10におけるC7 TCRトランスジェニックRAG2ノックアウトマウス。シカゴ大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、この研究で背景が使用されました。
1. T細胞の収穫と活性化
注: プロトコルのこの部分は、以前のプロトコルに基づいています。詳細20、21の引用を参照してください。
<ol><li>10-12週齢の5Cを安楽死させる。C7のトランスジェニックマウスは、承認されたIACUCプロトコルに従って(〜20〜25g)、承認されたIACUCプロトコル(すなわち、CO2チャンバーの後に頚部脱臼が続く)に従った。</li>
	<li>70%エタノールでマウスの死骸を十分にスプレーしてファーを浸し、BSL-2安全キャビネットに持ち込みます。</li>
	<li>マウスを右側に回し、手術用はさみで体腔内に小さな切開を行います。手術用鉗子を使って脾臓を取り除く。必要に応じて、外科的はさみで結合組織を切り取ります。</li>
	<li>脾臓を70μmの細孔メッシュセルストレーナーに入れ、1mLシリンジプランジャーの背面でつぶします。完全なRPMI(10%ウシ胎児血清[FBS]、2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、50 μM 2-メルカプトエタノール)でストレーナーを十分に洗浄します。</li>
	<li>脾細胞の単細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。 注:この時点のペレットは赤になります。</li>
	<li>脾細胞を5 mL RBCリシス緩衝液中に再懸濁させる。5分間インキュベートし、その後、完全なRPMIの5 mLでクエンチします。</li>
	<li>脾細胞の単細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。 注:この時点のペレットは、赤ではなく白でなければなりません。</li>
	<li>完全なRPMIの5 mLでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>T-25フラスコに移し、10 μMの蛾シトクロムC(MCC、配列ANERADLIAYLKQATK)を加える。細胞を培養培養器に37°C、5%CO2で一晩入れる。</li>
	<li>翌日、組換えマウス IL-2 を最終濃度 100 U/mL に加えます。</li>
	<li>次の日を観察し、現在のメディアが黄色に変わると、新しいメディアを追加します。T細胞は黄色の培地に放置して48時間以上放置すると死んでしまい、細胞は収穫後6-10日を使用する準備ができています。</li>
</ol>2. セルの準備
<ol><li>0.1%ポリLリジンを10分間5mmラウンドカバースリップにインキュベートし、自然乾燥させます。</li>
	<li>密度勾配試薬(材料表を参照)を使用して、死細胞を分離し、1 x 106 T細胞と1 x 106 APC(CH27細胞21、22細胞質mCherryでトランスデュース)を別々に得ます。 注: 細胞は、ヘモサイトメーターを使用してカウントされます。<ol>
<li>密度勾配試薬の3 mLを15 mL円錐形チューブに加え、細胞をチューブの縁に滴下して慎重に加えます。を混在させないでください。4 °Cで10分間930 x gで遠心分離。加速/減速を使用する:遅い/遅い。完全な培地と密度勾配試薬の間の薄い中層の細胞を慎重に取り除き、各細胞タイプを別々の円錐形のチューブに入れます。 注:プロセス中に平均50%が失われていることが分かるように、イメージングに必要以上の細胞を準備する必要があります。プロセスに使用されるセルが多いほど、密度勾配から細胞を簡単に収穫できます。我々は、余分な細胞を確保するために、両方の細胞タイプの4-8 mLを使用しています。必要に応じて、この手順の前にセルをカウントして、必要な量を確保できます。余分な細胞は、それぞれのフラスコに戻されます。</li>
		<li>T細胞とCH27細胞の両チューブを5 mLの完全なRPMI(5分間300 x g)で3回洗浄します。洗浄中に毎回上清を捨てます。各チューブを1 mL完全なRPMIで再懸濁し、細胞をヘモサイトメーターでカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 μL 完全 RPMI で 1 x 106 APCを再サスペンドし、10 μM MCC を追加します。37 °C、5% CO2で 3 時間インキュベートします。500 μL の完全な RPMI (300 x g 5 分) で細胞を 3 回洗浄します。上清を捨てます。</li>
	<li>500 μL 完全 RPMI で 1 x 106 T 細胞を再サスペンドします。500 μLの細胞に抗TCRβAlexa488標識Fab(クローンH57)を2μg添加する。37 °Cで30分間インキュベートし、5%CO2。500 μLのRPMI(5分間300 x g)で細胞を3回洗浄します。洗った後に上清を捨てる。 注:二価抗TCR抗体を、二価抗体によるT細胞受容体の架橋を避けるためにFab調製キット(材料表を参照)を用いて1価Fabに切断した(このステップは任意である)。</li>
	<li>両方の細胞タイプを500μLのイメージング培地(フェノール赤フリーのライボヴィッツのL-15培地、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン)で再懸濁します。</li>
</ol>3. LLSMデイリーアライメントの実施
注: (重要) このアライメント プロトコルは、使用される LLSM 計測器に基づいています(資料表を参照)。LLSM はそれぞれ異なっていて、異なるアライメント戦略、特にホーム ビルドされた方法が必要です。適切なルーチンアライメントを実行し、セクション4に進みます。
<ol><li>10 mLの水と30μLのフルオレセイン(1mg/mLストック)をLLSMバス(約10mL)に加え、画像(ホーム)を押して画像位置に目標を移動し、単一のベッセルレーザービームパターンを見ます。ガイドと事前に設定された関心領域(ROI)を使用してレーザービームを整列させ、ビームを細いパターンをすべての方向に平衡させます。<ol>
<li>ビームはファインダーカメラに集まったように見えるはずです。2つのミラーチルトアジャスタ、トップマイクロメータ、フォーカス、および放出目的のカラーを使用して調整します。正しく整列されたビームについては、図2A、Bを参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フルオレセインを完全に除去するために、少なくとも200 mLの水で浴と目的を洗います。</li>
	<li>画像の標準蛍光ビーズ(ポリL-リジンで5mmのカバースリップにビーズを付けて調製する)は、材料の表を参照してください。 注:後で処理するために表示できるビーズは1つしかないので、ビューア内にあるか、簡単に切り取って1つのビーズを得ることができるビーズを見つけてみてください。<ol>
<li>[X ガルボ範囲] ボックスで 3 に設定してディザをオンにします。現在のフィールドを表示するには、Liveキーを押します。Z 方向に沿って移動して、カバー スリップとビーズを見つけます。Zに沿って移動してビーズの中心を見つけ、停止を押してレーザーを一時停止します。3Dを確認し、中央キーを押してから実行キーを押します。これにより、データが収集されます。</li>
		<li>チルトミラー、目標カラー、フォーカスマイクロメータを手動で調整してグレーの最高値を調整し、必要に応じて目標スキャン、z galvo、z +objective (totPSF)、サンプルスキャン(samplePSF)キャプチャモードの適切なパターンを取得します。適切に調整された最大強度プロジェクション(MIP)については、図2のC-Fを参照してください。 注: さまざまなキャプチャ モード(目的スキャン、z galvo、z+目標、サンプル スキャン)によって、ライトシートがサンプル内を移動する方法が変わります。すべてのスキャンモードは、配置に使用する必要があります。</li>
		<li>サンプル スキャンでは、実験中にデータがどのように収集されるかが示されます。サンプル PSF を収集するには、サンプル スキャン モードで[実行]を押して、デスキューおよびデコンボリューションを行います (セクション 5 を参照)。レーザーを3色モード(488、560、647)に変更し、もう一度[実行]を押します。 注: 角度(57.2°)の LLSM 画像なので、「サンプルスキャン」モードで撮影された画像はこの角度で収集されるため、「歪む」。スキュー解除とは、この角度を補正し、イメージを真の Z スタックに「再整列」するプロセスです。これらのデータは、イメージングメディアと実験中に画像化されるすべてのチャンネルで収集する必要があります。これが正しく収集されない場合、データは正しく歪みなくなります。同様に、媒体が37°C(または所望の実験温度)に加温されていることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. LLSM を使用したセルの設定
<ol><li>ステップ 2.5 からステップ 2.1 から 5 mm の直径の円形カバースリップに 100,000 APC (50 μL) を追加し、10 分間落ち着くようにします。</li>
	<li>サンプルホルダーをグリースし、カバースリップセルサイドアップを加えます。お風呂に入れる前に泡を避けるために、カバースリップの背面に画像媒体の滴を追加します。サンプルホルダーをピエゾにねじ込み、イメージ(ホーム)を押します。</li>
	<li>画像化するAPCを見つけて、LLSMおよびイメージングソフトウェア(資料表を参照)が正しく機能していることを確認します。 注: 0.4 μm のステップサイズで、ディザが 3 に設定された 2 色の場合は、0.4 μm のステップ サイズと 10 ミリ秒の露出を使用し、その結果、3D イメージのフレームあたり 1.54 秒 (~200 nm XY および 400 nm Z 解像度) になります。これらの設定は、使用する蛍光標識技術からのセルサイズ、所望のZ分解能、およびシグナルの強さに基づいて調整する必要があります。レーザー電力の使用も、使用する蛍光標識技術によって異なります。<ol>
<li>現在の画像を表示するには、ライブを押します。Z に沿って移動して、カバー スリップとセルを探します。</li>
		<li>Z 方向に移動して APC の中心を探し、[Stop]を押してレーザーを一時停止します。3Dを確認し、必要な設定を入力します (手順 4.3.1 を参照) 、[中央]を押してから[実行]を押します。これにより、データが収集されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステージを下げて位置を読み込み、画像媒体に50 μLのT細胞を加えます(ステップ2.5から100,000個の細胞)がカバースリップの上に直接滴下されます。ピペットの先端の端にドロップフォームを入れて、お風呂の液体に先端を触れるのが最善です。「画像(戻る)」をクリックしてステージを上げます。</li>
	<li>イメージングを開始します。必要なスタック サイズと時間経過の長さを設定してください。たとえば、0.4 μm のステップ サイズで 60 z スタックをイメージし、500 のタイムフレームを入力します。(通常)フォトブリーチを避けるために500フレームに達する前に記録を停止します。Liveモードを使用してセルペアを検索し、準備が整い、必要な設定が入力されたら、「実行」を押してデータを収集します。例については、ムービー 1および図 1を参照してください。</li>
</ol>5. 表面ダイナミクスを追跡する
<ol><li>イメージング ソフトウェアからデータをエクスポートします(資料の表を参照)。これにより、各色の各時点に対して Z スタック TIF ファイルが作成されます。</li>
	<li>まず、データをデスキューしてデコンボルします。 注: 私たちは、HHMIのJaneliaリサーチキャンパス18のライセンスの下でLLSpyパイプラインを使用していますが、複数のイメージングソフトウェア内でデスキューとデコンボルションも利用可能です(資料の表を参照)。</li>
	<li>データをデブリーチします。 注:私たちはヒストグラムマッチングでフィジーのデブリーチ機能を使用しています(フィジーパスウェイ:画像 |調整 |漂白矯正 |ヒストグラムマッチング |OKです)。</li>
	<li>トラッキングソフトウェアにインポートします(資料表を参照)。ソフトウェア仕様に従ってクラスタを追跡します。例については、ムービー 2 を参照してください。 注:追跡結果は、使用するトラッキングソフトウェア、選択したアルゴリズム、選択された希望の出力パラメータなどによって異なります。たとえば、使用した追跡ソフトウェア (マテリアルの表を参照) では、TCR クラスターは完全な球体に編成されていないので、各フィーチャに 1 つのスポットを割り当てるのではなく、不規則な形状を追跡することをソフトウェアに許可することを選択しました。さらに、速度、方向、体積、強度、面積、位置、トラックの継続時間情報を含む35のパラメータを収集することを選択しました。ただし、異なる方法やパラメータは、異なる質問に答えるために有益です。<ol>
<li>トラッキングが必要ない場合は、フィジー向け ClearVolume プラグインを使用して、ハイパースタックデータからムービーを視覚化し、作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

提示されたプロトコルは、5Cから分離されたCD4+ T細胞の使用に最適化された。使用されるLLSM機器上のC7トランスジェニックマウス、したがって他の細胞システムとLLSMは異なる方法で最適化する必要があるかもしれません。しかし、このプロトコルは、生理学的条件下で最も歪みが少ない細胞全体の表面受容体のダイナミクスを定量化するために使用することができるため、4Dイメージングのパワーを示す。したがって、この技術の将来の多くの応用があります。
重要なステップは、細胞が適切な濃度で沈降できるようにすることです。カバースリップに多くのAPCが落ち着き、密度が高くなりすぎると、単一のAPCと相互作用しているTセルを見つけるのは難しいです。T細胞に複数のシナプスがある場合、データの追跡と解釈は非常に複雑になる可能性があります。同様に、APCが少なすぎると、シナプスを形成するT細胞を見つけることも困難である。私たちの手の中で、50,000個の細胞が10分間落ち着くことを可能にすることは最適な密度を達成する。ただし、付着細胞を持つシステムを使用する場合、この問題は回避できます。...

リアルタイムで3次元細胞表面に人身売買し、拡散する分子の正確なダイナミクスは、解決するための謎でした。顕微鏡は常に速度、感度、および分解能のバランスをとってきました。1 つまたは 2 つが最大化されている場合、3 つ目は最小化されます。したがって、表面受容体が移動する小型および膨大な速度のために、そのダイナミクスを追跡することは、細胞生物学の分野における大きな技術的課題であり続けています。例えば、多くの研究は、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡1、2、3を用いて行われ、時間分解能は高いが、T細胞膜の非常に薄いスライス(約100nm)しか画像化できないため、細胞内で遠くに起こる事象を見逃す。これらのTIRF画像はまた、細胞の2次元断面のみを示す。対照的に、ストカスティック光学再構成顕微鏡(STORM)4、光活性化局在顕微鏡(PALM)5、刺激発光枯渇顕微鏡(STED)6などの超解像技術は、光のアッベ回折限界を克服できる。これらの技術は、高い空間分解能(~20 nmの解像度)4、5、6、7を有するが、それらは多くの場合、完全な2次元(2D)または3次元(3D)画像を取得するために、時間分解能が失われる。さらに、点滅する信号に依存するSTORMやPALMなどの技術は、カウント8、9に不正確を持つ可能性があります。電子顕微鏡法は、はるかに最高の解像度(最大50 pm解像度)10を有する。集積イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)で3次元的に行うことさえでき、最大3nm XYおよび500nmZ分解能11を生じる。しかし、電子顕微鏡の任意の形態は、過酷なサンプル調製を必要とし、時間をかけてライブサンプルをイメージングする可能性を排除し、固定細胞または組織でのみ行うことができます。
真の生理的3Dの性質において、生細胞における表面および細胞内分子のダイナミクスを同定するために必要な高い時空間分解能を得るための技術は、最近開発されたばかりです。その一つがラティス光シート顕微鏡(LLSM)12で、構造型ライトシートを利用して光の漂白を大幅に低減する。ノーベル賞受賞者エリック・ベツィヒによって2014年に開発され、高軸解像度、低いフォトブリーチングとバックグラウンドノイズ、および視野ごとに数百の平面を同時に画像化する能力は、LLS顕微鏡を広視野、TIRFおよび共焦点顕微鏡12、13、14、15、16、17、19に優れています。この4次元(x、y、zおよび時間)イメージング技術は、まだ回折が限られている(約200 nm XYZ解像度)、3D空間取得のための信じられないほどの時間分解能(約100fpsのフレームレートを達成し、フレームあたり0.85秒の3D再構築された細胞像をもたらす)を有する。
LLSMは、一般に、単一分子および単一細胞レベル、特に免疫細胞のような高い可動細胞における任意の細胞内の任意の分子のリアルタイムダイナミクスを追跡するために使用することができる。例えば、ここではLLSMを使用してT細胞受容体(TCR)ダイナミクスを視覚化する方法を示します。T細胞は、適応免疫系のエフェクター細胞である。TCは、抗原提示細胞(APC)の表面に表示されるペプチドMHC(pMHC)リガンドを認識し、T細胞の選択、発達、分化、運命、機能を決定します。この認識は、T細胞とAPCの界面で起こり、局所的な受容体クラスタリングが免疫学的シナプスと呼ばれるものを形成する。免疫シナプスのTCRはT細胞エフェクター機能に不可欠であると知られているが、シナプスへのリアルタイムTCR人身売買の根本的なメカニズムはまだ不明である。LLSM は、結果として得られた pMHC-TCR インタラクションを使用して、シナプスへの入稿の前後に TCR のダイナミクスをリアルタイムで視覚化することを可能にしました (図 1)。LLSMは、TCの形成力学の現在の問題を解決し、細胞が自己抗原と外来抗原をどのように区別するかを理解するための洞察を提供するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309659</td><td>T 細胞採取用</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td>T 細胞培養用</td></tr><tr><td>5 mm 丸型カバーガラス</td><td>World Precision Instruments</td><td>502040</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>70um 滅菌細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>7201431</td><td>T 細胞採取用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗マウス TCR &β; 鎖抗体</td><td>BioLegend</td><td>109215</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>X&Y細胞培養</td><td>FBS-500</td><td>T細胞培養用</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>T細胞採取用デニスティグラジエント試薬</td></tr><tr><td>フルオレセインナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td>顕微鏡アライメント用</td></tr><tr><td>FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F8810</td><td>顕微鏡アライメント用</td></tr><tr><td>イマリス</td><td>ビットプレーン</td><td>N/A</td><td>追跡ソフトウェア;追跡ソフトウェアの他のオプションには、AmiraまたはTrackmate(フィジー)が含まれます。</td></tr><tr><td>格子ライトシート顕微鏡</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>LeibovitzのL-15媒体を使用し、フェノールレッドなし</td><td>イメージング用サーモフィッシャー科学</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-081</td><td>T細胞培養用</td></tr><tr><td>LLSpy</td><td>Janelia Research Campus</td><td>N/A</td><td>LLSpyは、ハワードヒューズ医学研究所、ジャネリアリサーチキャンパスからのライセンスの下で使用されました。アクセスについては、innovation@janelia.hhmi.org にお問い合わせください。他のデコンボリューションおよびデクソーイング方法は、Fiji、Slidebook、Amiraなどの画像処理ソフトウェアで利用できます。<a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a</td></tr><tr><td>>蛾 シトクロムC (MCC)、配列 ANERADLIAYLKQATK</td><td>エリンビオ</td><td>カスタム合成</td> T<td>細胞収穫用</td></tr><tr><td>ペナシリン/ストレプタマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>15140122_3683884612</td><td>T細胞培養用</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>フェニックス 研究製品</td><td>P8920-100ML</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>RBC 溶解バッファー</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td>T細胞収穫用</td></tr><tr><td>組換えマウス IL-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0523</td><td>T細胞培養用</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地</td><td>コーニング</td><td>MT10040CV</td><td>T細胞培養用</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>LLSMイメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>外科解剖ツール</td><td>Nova-Tech International</td><td>DSET10</td><td>T細胞収穫用</td></tr><tr><td>T-25フラスコ</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231710126</td><td>T細胞培養用</td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック ピアス ファブ マイクロプレパレーションキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>44685</td><td>ファブの準備用</td></tr></tbody></table>

格子光シート顕微鏡による表面t細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

細胞のシグナル伝達と機能は、その表面受容体の動的構造および相互作用によって決定される。これらの受容体の構造と機能の関係を実際に理解するには、十分な時空間分解能で生きた細胞表面上でそれらを視覚化し、追跡する必要があります。ここでは、最近開発したラティス光シート顕微鏡(LLSM)を使用して、生細胞膜でT細胞受容体(TCR)を4次元(4D、空間、時間)で画像化する方法を示します。T細胞は適応免疫系の主要なエフェクター細胞の一つであり、ここではT細胞のシグナル伝達および機能がTCRの動態および相互作用によって駆動されることを示す例としてT細胞を使用した。LLSMは、前例のない時空間分解能で4Dイメージングを可能にします。したがって、この顕微鏡技術は、生物学において異なる細胞の表面または細胞内分子の広い配列に一般的に適用することができる。

ここでは、主マウス5Cの分離、調製、およびイメージングについて説明する。C7T細胞は格子光シート顕微鏡を用いた。セクション3の間に、顕微鏡を正しく整列させ、収集後にデータをデコンボルするPSFを毎日収集することが不可欠です。図2では、顕微鏡を整列させると正しい位置合わせ画像が表示されます。図2Aと図2Bは、フルオレセインで画像化した場合の正しいビーム経路とビームアライメントをそれぞれ示す。客観的なスキャンは、XZ および YZ 投影に大きな X 形状を示す必要があります。また、これはできるだけ小さい X に調整する必要があります (図 2C)。これは主に、排出目標カラーを調整することによって達成されます。z galvo スキャンでは、XZ と XY の楕円形が、両側に単一のドット (XZ の場合は上と...

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

ラティスライトシート顕微鏡は強力なイメージング技術ですが、それを使用できるラボは世界ではほとんどありません。このプロトコルは、市販の格子光シート顕微鏡の使用方法の詳細な概要を提供します。これは、分子のリアルタイム追跡を可能にする個々の細胞または胚の4次元イメージングが可能な非常に強力なシステムです。この技術の主な利点は、高い時空間分解能と最小限の写真の漂白を持つ単一の生きた細胞または器官を3次元的に画像化できることである。ライトシートの格子模様は、高速画像サンプルを可能にし、他の技術では実現できない分子的な詳細を持つ3次元の生きている細胞や臓器のリアルタイムビデオを取得することができます。この最初のビデオプロトコルは、私たちに光シート顕微鏡を4次元的に画像単一の細胞に格子化する方法を示す。これは、アライメントとサンプル調製による非常に複雑な手法です。そして、より多くの科学者が生物学の多くの異なる分子、細胞、器官を画像化できるようにすることで、視覚デモンストレーションがアクセシビリティを向上させると考えています。この手順を開始するには、室温で0.1%ポリL-リジンを用いた5ミリメートルの丸いカバーリップを10分間インキュベートします。液体を吸引し、カバーリップスの空気を自然に乾燥させます。次に、15ミリリットルの円錐管に3ミリリットルの密度勾配を加えます。慎重にチューブの端にドロップワイズセルを追加します。930倍gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。この後、完全な媒体と密度勾配試薬の間の細胞の薄い中間層を慎重に除去し、各細胞タイプを別々の円錐形のチューブに入れてください。遠心分離機を300回gで5分間培養し、細胞を洗浄する。上清を捨て、T細胞およびCH27細胞の管に5ミリリットルのRPMIを加える。3回の洗浄が完了するまで、新鮮なRPMIで洗浄を繰り返します。次いで、完全なRPMIの1ミリリットルで各チューブ内の細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞を数える。完全なRPMIの500マイクロリットルで100万個の抗原提示細胞を再懸濁し、10マイクロモルMCCを加える。37°Cで5%の二酸化炭素を3時間インキュベートします。この後、完全なRPMIの500マイクロリットルに100万個のT細胞を再懸濁する。FABとラベル付けされた抗TCRベータAlexa 488の2マイクログラムを追加し、30分間5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。次に、両方の細胞を300回gで5分間遠心し、上清を捨てる。完全なRPMIの500マイクロリットルを加え、遠心分離機を繰り返して細胞を洗います。洗浄後に上清を廃棄して3回の洗浄が行われるまで、新鮮なRPMIで洗浄を繰り返します。この後、両方の細胞タイプを500マイクロリットルのイメージング媒体に再懸濁させる。まず、10ミリリットルの水と30マイクロリットルのフルオレセインをLLSMバスに加えます。イメージホームを押してオブジェクトを画像位置に移動し、単一のベッセルレーザービームパターンを見ます。目的のガイドとプリセット領域を使用してレーザービームを位置合わせし、ビームをすべての方向でバランスのとれた薄いパターンにします。ビームはファインダーカメラにも焦点を当てて表示されます。2つのミラーチルト調整器、トップフォーカスマイクロメーター、および目的の色を使用してビームを調整します。次に、フルオレセインを完全に除去するために、少なくとも200ミリリットルの水で浴と目的を洗います。標準蛍光ビーズをイメージするには、Xgalvoレンジボックスで3に設定してディザをオンにし、Liveを押して現在のフィールドを表示します。最大グレー値に対して、チルトミラー、目標色、フォーカスマイクロメーターを手動で調整します。次に、必要に応じて調整して、目的スキャン、Zガルボ、Zプラス目的、およびサンプルスキャンキャプチャモードの適切なパターンを取得します。この後、サンプルスキャンモードで実行を押して、デスキューおよびデコンボリューションのサンプルポイントスプレッド関数を収集します。レーザーを3色モードに変更し、再度実行を押します。まず、調製された直径5ミリメートルの円形カバースリップに100,000個の提示防止セルを追加し、10分間落ち着かせるようにします。サンプルホルダーをグリースし、カバースリップをセルサイドに上に追加します。次に、カバースリップの背面にイメージングメディアを1滴追加します。サンプルホルダーをピエゾにねじ込み、イメージホームを押します。画像に抗原提示細胞を見つけ、LLSMおよびイメージングソフトウェアが正常に機能していることを確認します。現在の画像を表示するには、ライブを押します。Z に沿って移動してカバースリップとセルを見つけます。Z方向に移動して抗原提示細胞の中心を見つけ、停止を押してレーザーを一時停止します。3Dをチェックし、希望の設定を入力します。センターを押し、実行を押してデータを収集します。ステージを負荷位置まで下げ、50マイクロリットルのT細胞とイメージングメディアをカバースリップの上に直接ドロップします。ピペット先端の端にドロップフォームを入れてから、先端を浴液に触れるのが最善です。[イメージの戻り値] をクリックして、ステージを元に戻します。イメージングを開始します。目的の Z スタックとタイムラプスの長さを設定してください。たとえば、0.4 マイクロメートルのステップ サイズと入力 500 のタイムフレームでイメージ 60 Z スタックします。写真の漂白を避けるために500フレームに達する前に録音を停止します。ライブモードを使用してセルペアを検索し、準備ができ、希望する設定が入力されたら、[Execute]を押してデータを収集します。本研究では、一次マウス5CC7T細胞を単離して調製し、次いで格子光シート顕微鏡を用いて画像化する。フルオレセインで画像化した場合の正しいビームパスとビームアライメントを次に示します。目的のスキャンでは、XZ および YZ 投影の XZ および YZ の投影に、できるだけ対称な大きな X シェイプが表示されます。また、できるだけ X の小さい方に調整する必要があります。Zガルボスキャンは、XZとXYの楕円形を表示し、両側に単一のドットを付ける必要があります。最後に、Z + 目的スキャンとサンプルスキャンの両方が、できるだけ丸く見えるドットを表示する必要があります。このプロトコルを用いて、T細胞表面上のT細胞受容体の4次元ダイナミクスが見られた。この顕微鏡の主な利点は、T細胞受容体の可視化された表面単位を追跡し、そのサイズ、運動、信号強度、および排泄物から定量化されたデータを得ることができる点にある。覚えておくべきことは、アライメントの品質です。格子状のライトシートは毎日整列する必要があり、これを適切に行わないと、画像が歪んでしまいます。同様に、収集されたPSFの品質は、最終的に最終画像の品質をもたらすデコンボリューションの品質に直接影響を与えます。この方法が非常に強力である理由の一つは、各細胞とラベルを置き換えて多くの細胞タイプおよび分子を視覚化することができるからです。したがって、この方法は、分子の4次元追跡に関連する任意の質問に答えるために使用することができます。この技術は、研究者が分子人身売買の分野で新しい疑問を探求する道を開くと考えています。複雑なシステムのためにまだ広く使用されていないので、このJoveビデオがこの技術へのアクセス性を向上させることを期待しています。システムで使用されるレーザーはクラス4なので、レーザーの安全性を確保するために絶対注意が必要です。この方法を使用する前に、必要なレーザー安全訓練を受けてください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルは、リンパ節のスライスに導入された画像蛍光T細胞への方法を説明します。技術は、従来の広視野蛍光または共焦点顕微鏡でのT細胞遊走のリアルタイム分析を可能にします。...

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

このビデオでは、生きたT細胞と抗原提示細胞との間の相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法について説明します。この方法では、相互作用する細胞ペアに極薄の格子ライトシートを集束させて一連の2次元画像を取得し、それらを組み合わせて高解像度の4次元画像を取得し、細胞間相互作用の時空間ダイナミクスを明らかにします。...

生細胞における受容体-リガンド相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。...

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。...

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

細胞間の通信は、細胞内外の様々な生理活性を制御するために重要です。本稿では、単一細胞分泌物の時空間的な性質を測定するためのプロトコルについて説明します。これを達成するためには、学際的なアプローチは、生細胞イメージングとラベルフリーnanoplasmonic検知を統合が使用されます。...

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。...

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

T細胞免疫シナプスにおける糸状アクチンの流れ速度と方向性を調査するために、生細胞の超解像イメージングと全反射蛍光を組み合わせ、時空間画像相関分光法で定量化します。...

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング...

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

ここでは、光シート顕微鏡を用いた三次元 (3 D) コラーゲン マトリックスに埋め込まれた免疫細胞を可視化するためのプロトコルを提案する.このプロトコルはまた、3 D の細胞の移動を追跡する方法を詳しく説明します。3 D...

人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

学ぶ格子光シート顕微鏡を用いたT細胞受容体の4次元ダイナミクス可視化法。CD4+初期T細胞の表面受容体をリアルタイムで追跡し、高時空間分解能と低光漂白性を活かした生細胞イメージング技術を解説します。

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

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