格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。

ラティスライトシート顕微鏡は強力なイメージング技術ですが、それを使用できるラボは世界ではほとんどありません。このプロトコルは、市販の格子光シート顕微鏡の使用方法の詳細な概要を提供します。これは、分子のリアルタイム追跡を可能にする個々の細胞または胚の4次元イメージングが可能な非常に強力なシステムです。

この技術の主な利点は、高い時空間分解能と最小限の写真の漂白を持つ単一の生きた細胞または器官を3次元的に画像化できることである。ライトシートの格子模様は、高速画像サンプルを可能にし、他の技術では実現できない分子的な詳細を持つ3次元の生きている細胞や臓器のリアルタイムビデオを取得することができます。この最初のビデオプロトコルは、私たちに光シート顕微鏡を4次元的に画像単一の細胞に格子化する方法を示す。

これは、アライメントとサンプル調製による非常に複雑な手法です。そして、より多くの科学者が生物学の多くの異なる分子、細胞、器官を画像化できるようにすることで、視覚デモンストレーションがアクセシビリティを向上させると考えています。この手順を開始するには、室温で0.1%ポリL-リジンを用いた5ミリメートルの丸いカバーリップを10分間インキュベートします。

液体を吸引し、カバーリップスの空気を自然に乾燥させます。次に、15ミリリットルの円錐管に3ミリリットルの密度勾配を加えます。慎重にチューブの端にドロップワイズセルを追加します。

930倍gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。この後、完全な媒体と密度勾配試薬の間の細胞の薄い中間層を慎重に除去し、各細胞タイプを別々の円錐形のチューブに入れてください。遠心分離機を300回gで5分間培養し、細胞を洗浄する。

上清を捨て、T細胞およびCH27細胞の管に5ミリリットルのRPMIを加える。3回の洗浄が完了するまで、新鮮なRPMIで洗浄を繰り返します。次いで、完全なRPMIの1ミリリットルで各チューブ内の細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞を数える。

完全なRPMIの500マイクロリットルで100万個の抗原提示細胞を再懸濁し、10マイクロモルMCCを加える。37°Cで5%の二酸化炭素を3時間インキュベートします。この後、完全なRPMIの500マイクロリットルに100万個のT細胞を再懸濁する。

FABとラベル付けされた抗TCRベータAlexa 488の2マイクログラムを追加し、30分間5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。次に、両方の細胞を300回gで5分間遠心し、上清を捨てる。完全なRPMIの500マイクロリットルを加え、遠心分離機を繰り返して細胞を洗います。

洗浄後に上清を廃棄して3回の洗浄が行われるまで、新鮮なRPMIで洗浄を繰り返します。この後、両方の細胞タイプを500マイクロリットルのイメージング媒体に再懸濁させる。まず、10ミリリットルの水と30マイクロリットルのフルオレセインをLLSMバスに加えます。

イメージホームを押してオブジェクトを画像位置に移動し、単一のベッセルレーザービームパターンを見ます。目的のガイドとプリセット領域を使用してレーザービームを位置合わせし、ビームをすべての方向でバランスのとれた薄いパターンにします。ビームはファインダーカメラにも焦点を当てて表示されます。

2つのミラーチルト調整器、トップフォーカスマイクロメーター、および目的の色を使用してビームを調整します。次に、フルオレセインを完全に除去するために、少なくとも200ミリリットルの水で浴と目的を洗います。標準蛍光ビーズをイメージするには、Xgalvoレンジボックスで3に設定してディザをオンにし、Liveを押して現在のフィールドを表示します。

最大グレー値に対して、チルトミラー、目標色、フォーカスマイクロメーターを手動で調整します。次に、必要に応じて調整して、目的スキャン、Zガルボ、Zプラス目的、およびサンプルスキャンキャプチャモードの適切なパターンを取得します。この後、サンプルスキャンモードで実行を押して、デスキューおよびデコンボリューションのサンプルポイントスプレッド関数を収集します。

レーザーを3色モードに変更し、再度実行を押します。まず、調製された直径5ミリメートルの円形カバースリップに100,000個の提示防止セルを追加し、10分間落ち着かせるようにします。サンプルホルダーをグリースし、カバースリップをセルサイドに上に追加します。

次に、カバースリップの背面にイメージングメディアを1滴追加します。サンプルホルダーをピエゾにねじ込み、イメージホームを押します。画像に抗原提示細胞を見つけ、LLSMおよびイメージングソフトウェアが正常に機能していることを確認します。

現在の画像を表示するには、ライブを押します。Z に沿って移動してカバースリップとセルを見つけます。Z方向に移動して抗原提示細胞の中心を見つけ、停止を押してレーザーを一時停止します。

3Dをチェックし、希望の設定を入力します。センターを押し、実行を押してデータを収集します。ステージを負荷位置まで下げ、50マイクロリットルのT細胞とイメージングメディアをカバースリップの上に直接ドロップします。

ピペット先端の端にドロップフォームを入れてから、先端を浴液に触れるのが最善です。[イメージの戻り値] をクリックして、ステージを元に戻します。イメージングを開始します。

目的の Z スタックとタイムラプスの長さを設定してください。たとえば、0.4 マイクロメートルのステップ サイズと入力 500 のタイムフレームでイメージ 60 Z スタックします。写真の漂白を避けるために500フレームに達する前に録音を停止します。

ライブモードを使用してセルペアを検索し、準備ができ、希望する設定が入力されたら、[Execute]を押してデータを収集します。本研究では、一次マウス5CC7T細胞を単離して調製し、次いで格子光シート顕微鏡を用いて画像化する。フルオレセインで画像化した場合の正しいビームパスとビームアライメントを次に示します。

目的のスキャンでは、XZ および YZ 投影の XZ および YZ の投影に、できるだけ対称な大きな X シェイプが表示されます。また、できるだけ X の小さい方に調整する必要があります。Zガルボスキャンは、XZとXYの楕円形を表示し、両側に単一のドットを付ける必要があります。

最後に、Z + 目的スキャンとサンプルスキャンの両方が、できるだけ丸く見えるドットを表示する必要があります。このプロトコルを用いて、T細胞表面上のT細胞受容体の4次元ダイナミクスが見られた。この顕微鏡の主な利点は、T細胞受容体の可視化された表面単位を追跡し、そのサイズ、運動、信号強度、および排泄物から定量化されたデータを得ることができる点にある。

覚えておくべきことは、アライメントの品質です。格子状のライトシートは毎日整列する必要があり、これを適切に行わないと、画像が歪んでしまいます。同様に、収集されたPSFの品質は、最終的に最終画像の品質をもたらすデコンボリューションの品質に直接影響を与えます。

この方法が非常に強力である理由の一つは、各細胞とラベルを置き換えて多くの細胞タイプおよび分子を視覚化することができるからです。したがって、この方法は、分子の4次元追跡に関連する任意の質問に答えるために使用することができます。この技術は、研究者が分子人身売買の分野で新しい疑問を探求する道を開くと考えています。

複雑なシステムのためにまだ広く使用されていないので、このJoveビデオがこの技術へのアクセス性を向上させることを期待しています。システムで使用されるレーザーはクラス4なので、レーザーの安全性を確保するために絶対注意が必要です。この方法を使用する前に、必要なレーザー安全訓練を受けてください。