の発達過程を追跡し、定量化

画像解析ソフトウェアと発生生物学を用いる総合的な目的は、生物学的プロセスのメカニズムモデルのための定量的データを得ることにあります。この手法は、変異体の表現型をどのように定量的に解析できるかといった、発生生物学における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生物学的プロセスや発生現象における変化を、偏りなく同定できる能力を研究者に提供することです。

この手法は、海辺の優雅な生物（sea elegance）の発達および形態形成に関する知見を得るために使用できますが、josephaなどの他のモデル生物にも適用可能です。Im modを用いた細胞形状の再構築については、私の研究室の博士課程学生であるCINA Lemanが実演します。IM MODプログラムをインストールした後、eunuch shellを開き、IM modウィンドウにIm modと入力してください。3Dモデルを生成するための適切な生データを含むファイルを選択し、情報ウィンドウを使用してzapウィンドウ内のオブジェクトの底部と頂部を特定します。

情報ウィンドウで、再度セルの外郭をトレースし、各セルの最上方の平面で最初の輪郭線を作成します。その際、各セルに対して新しいオブジェクトを作成するように注意してください。次に、Z軸方向にスクロールし、各Z平面で新しい輪郭線を作成し、続いて各セルに対して新しいオブジェクトを作成します。モデルに適した数のセルをアウトライン化した後、モデルビューウィンドウを開き、オブジェクトとその輪郭線を確認します。

次に、モデルビューツールバーで「編集」および「オブジェクト」を選択します。それぞれの編集ウィンドウが開くので、すべての細胞を塗りつぶされた閉じたオブジェクトとしてモデル化します。描画データ型に「メッシュ」を、描画スタイルに「塗りつぶし」を選択してください。

「meshing」をクリックし、「cap」オプションにチェックを入れます。次に、必要なオブジェクトをすべて選択し、「mesh」をクリックします。これにより、プログラムがコンターのスタックからソリッドオブジェクトを生成します。

ビューウィンドウのZスケールを変更し、必要に応じてZサンプリング係数を調整します。次に、編集メニューから「ビュー」を選択して3Dオブジェクトを回転させ、蛍光タイムラプス記録からオブジェクトを追跡するために、必要に応じて細胞のスナップショットまたは動画を保存します。まずNDRを使用して、生データをTIFFファイルに変換します。

次にファイルを開きます。Enddropにて、2Dビューアのアイコンを選択し、データメニューにあるフィットレンジ（fit range）アイコンをクリックしてヒストグラムを調整します。

ファイル、名前、画像、セット、チャンネルを選択し、セットのX、Y、Z分解能を設定して、X、Y、Zの値を入力します。核をアノテーションするには、目的の平面に移動し、再度2Dビューアを選択します。次に、ドロップダウンメニューからlineageを選択し、new lineageを選択します。

関心のある核をクリックしてドラッグし、マーキングします。次に、その核を右クリックし、「rename particle（粒子の名前変更）」を選択します。ドロップダウンメニューから粒子に名前を入力し、矢印アイコンをドラッグして円の直径を変更します。

次に、右側のアイコンをクリックして核の中心平面をマークします。その後、時間および平面を順に追うため、下部ツールバーのフレームおよびZオプションを選択し、追跡している細胞が分裂するまで、核をマークする円の位置またはサイズを適宜調整します。細胞分裂が観察されたら、娘核をマークし、ウィンドウアイコンをクリックしてリネージ（細胞系譜）表示に切り替えます。

ビューアーは3つの核を同時にマークし、リネージ（系統）オプションの下にある「associate parent（親を関連付ける）」を選択します。その後、すべての細胞のトラッキングが完了したら、ファイル名をクリックしてチャンネルを切り替えます。細胞分裂の残渣をマークし、粒子画像流速（PIV）対称性ソフトウェアを用いて皮質流を定量的に解析します。

pif labに新しい画像ファイルを読み込み、シーケンシングスタイル（1, 2, 2, 3）を選択します。次に、目的の画像のシーケンスが含まれるディレクトリに移動します。

画像を選択し、「add」をクリックして画像をインポートします。次に、「analysis settings」の下で、「exclusions」を選択し、「ROI mask」と「use」ボタンを使用します。

解析設定の下で、画像の不要な部分を不活性化するために、現在のフレームにマスクを描画します。再度、PIF設定を選択し、希望するPIFアルゴリズムとして高速フーリエ変換ウィンドウ変形を選択します。パス1では、問い合わせ領域の値に64 pixelsを、パス2のステップに32を入力します。

インターロゲーション領域の値に32ピクセル、ステップに16を入力します。次に、ウィンドウ変形のドロップダウンメニューからlinearを選択し、サブピクセル変位推定にはGaussian two by three point methodを選択します。続いて、解析メニューからanalyzeを選択し、post-processingでanalyze all framesを選択します。ポストプロセッシングメニューからvector validationを選択し、プロットメニューからすべてのフレームに標準偏差フィルタしきい値として7を適用します。

派生パラメータを選択します。データ、続いてベクトル、1フレームあたりのピクセル数を修正し、ベクトルの平滑度とハイパスフィルターを調整します。これらの調整をすべてのフレームに適用した後、使用フレームを1から最後までに設定します。

最後に、「calculate mean vectors」ボタンをクリックし、先ほど実演したように、野生型C. elegans成体の生殖腺の屈曲部に焦点を当てた全フレームの平均ベクトルを測定します。顕微鏡データから生殖細胞の3Dモデルが生成され、2色タイムラプス顕微鏡法を用いることで、細胞が生殖腺の遠位腕から近位腕へ移行する際に起こる細胞サイズの変化を解析することが可能になります。ヒストン融合タンパク質および非筋肉型ミオシンをマーカーとして得られたモデルにより、細胞分裂時の剰余物の継承という定型的なパターンが示されます。

さらに、ラインデータから、各細胞Lおよび細胞分裂残渣のトラッキングデータと、細胞分裂タイミングとの相関を本実験で得ることができます。予想通り、皮質の非筋性ミオシンIIの高時間分解能での短期的タイムラプス顕微鏡観察を行い、野生型胚と、Rho GTPase活性化タンパク質RGA3を枯渇させた胚との間における皮質分極流のダイナミクスの違いを評価しました。野生型胚における流れは、主に胚の長軸方向に沿っていました。

PIP解析から容易にわかるように、RGA 3 RNA interference 胚における流れはこの軸に対して直交していました。複雑な物体の手動セグメンテーションと胚発生中の細胞トラッキングに習熟すれば、適切に行うことで数時間以内に完了でき、細胞および物体のトラッキングを実行することが可能です。ここで説明した3つのツールを使用して解析を行う際は、解析中に物体を見失わないよう、適切な時間分解能を設定することが重要です。

ばらつきに関する疑問への回答や、異なる胚の比較を行うために、統計解析を実施することも可能です。定量的な画像解析ソフトウェアを導入することで、我々や同様の開発生物学者が、かつてないほど詳細なレベルで発生の形態形成メカニズムを探索できるようになります。このビデオを視聴することで、定量的な画像解析を行うために多様なソフトウェアツールをどのように活用するかについて、十分な理解が得られるはずです。