光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

この方法は、4Dライトシート顕微鏡を使用したノッチシグナル伝達による心臓線維柱帯のせん断応力の調節など、発生心臓メカノバイオロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、サンプルの薄い部分を5ミクロンの平面で照らすため、光の漂白や写真の損傷が少なくなることです。さらに、私たちの計算アルゴリズムにより、4Dで鼓動するゼブラフィッシュの心臓を再構築することができます。

この技術の意味は、初期発達段階から後期の表現型に至るまでの心線維柱帯のinvivo逐次視覚化を可能にするため、先天性心疾患の診断にまで及びます。一般的に、この手法に不慣れな人は、時間の経過とともに3次元で考えることを想像するのが難しいことに気付くでしょう。また、システムを作成し、正確に位置合わせするには時間がかかります。

まず、ゼブラフィッシュのオスとメスを飼育水槽で仕切りを使って分けます。次に、仕切りを持ち上げて、オスとメスのゼブラフィッシュが繁殖するのを待ちます。ゼブラフィッシュの胚を採取し、モルフォリノオリゴを胚に注入して線維柱帯を抑制します。

次に、100ミリリットルの蒸留水に1グラムのアガロースを加えて1%のアガロースゲルを調製し、アガロース全体が溶解するまで加熱します。アガロースを冷ましてから、20マイクロリットルのピペットを使用して、準備した胚とアガロースの1つを小さなプラスチックチューブにロードします。チューブを顕微鏡ステージに固定し、テンx対物レンズを使用します。

ノブを使用して、胚の上部に焦点が合うように対物レンズを調整します。5ミクロンの薄いシートの厚さを使用して、複数の心拍サイクルにわたって魚の胚全体の画像を撮影します。露光時間を 10 ミリ秒にして 500 xy フレームを収集します。

次に、zアクセスのステージを1ミクロン移動して新しいレイヤーに移動し、イメージング手順を繰り返します。心臓全体が完全にイメージ化されるまで、z 平面あたり 500 フレームを想像し続けます。次に、画像処理ソフトウェアを開き、画像を3Dに積み重ね始めます。

これを行うには、まずオープンデータをクリックします。ここでは、3D に積み重ねるすべての画像を選択し、[読み込み] を選択します。次に、0.65 x 0.65 x 1ミクロンのボクセルサイズを追加し、[OK]をクリックします。

正しいボクセルサイズを入力することは、3D画像を正確に解析するために重要です。次に、マルチプレーナービューボックスをクリックして、3D画像を視覚化します。青いスライスの 1 ドットの tiff ボックスを右クリックし、[表示] を選択して、[volran] をクリックします。

編集メニューで、オプションを選択し、カラーマップを編集します。ボックスを使用して色を調整し、[OK]をクリックします。画像処理ソフトウェアでファイルをクリックし、時系列データを開きます。

ロードをクリックして作成したばかりの3D tiffを選択し、前と同じボクセルサイズを入力します。青いスライスの 1 ドットの tiff ボックスを右クリックし、[表示]、[volran] の順に選択します。次に、[編集]をクリックします。

オプションを選択します。次に、[カラーマップの編集]を選択します。ボックスを使用して色を調整し、[OK]をクリックします。

次に、時系列コントロールを右クリックし、ムービーメーカーをクリックし、再生ボタンを押してムービーを視聴します。最後に、ファイル名、フレームサイズ、フレームレート、品質を1に追加し、monoscopicと入力します。次に、[適用] をクリックします。

最後に、ビデオをエクスポートします。血行動態のせん断応力などの生体力学的力は、心臓の形態形成に密接に関与しています。ここでは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用して、受精後75時間で心室内腔に突き出た海綿梁を視覚化しました。

受精後100時間で、小柱網がはっきりと見えます。gata1aMOマイクロインジェクションで処理した胚では、造血と粘度が90%減少します。この粘度の低下により、血行動態のせん断応力が減衰し、開始が遅れ、線維柱帯網の密度が低下しました。

この線維柱帯ネットワークの遅延と密度は、ノッチ関連遺伝子発現をアップレギュレーションすることで回復することができ、受精後75時間および受精後100時間で線維柱帯形成を救いました。したがって、gata1aモルホリノオリゴヌクレオチドは血行動態の力を減少させ、ノッチシグナル伝達のダウンレギュレーションをもたらし、一方、Nrg1-mRNAはノッチ関連遺伝子をレスキューアップし、線維柱帯を再開しました。このイメージング技術は、一度習得すれば、適切に行えば約2時間で完了することができます。

開発後、この技術は、ゼブラフィッシュの線維柱帯の適切な形成に関与するノッチ遺伝子の因子を研究するための心臓発生分野の研究者への道を開きました。このビデオを見れば、選択的平面照明顕微鏡を使用して画像を取得し、4D画像ファイルを作成する方法を十分に理解できるはずです。レーザーでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。

また、この手順では、適切な眼鏡を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があります。