Name: 光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の4次元画像再構成法。せん断応力がNotchシグナル伝達を活性化し心臓梁形成に関与する機序を可視化し、先天性心疾患の診断への応用可能性を示す。

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著者は人間を提供するためスタンフォード大学からウィリアム ・ タルボットに感謝の意を表したいと思いますNrg1cDNA とを提供するための UCSD からデボラ ・ Yelon、wea変異体。著者も感謝したいシンシア陳画像の取得で助けるため。この研究は (t. k. Hsiai) に NIH の HL118650 の補助金によって支えられました (t. k. Hsiai) に HL083015、HD069305 (ノースカロライナ州チーと t. k. Hsiai.) に、(t. k. Hsiai、ノースカロライナ州 Chi) に HL111437 (t. k. Hsiai) に HL129727、(r. r. Sevag パッカード) に T32HL007895 (V. メッサーシュ ミット) に HL 134613 と(J. リー) へ星をテキサス州の資金の大学.

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<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. 124 (2), 381-389 (1997).</li>
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<li>Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+enhancement+in+a+light-sheet-based+microscope+%28SPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM).</a> Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、我々 は 4 D イメージングを生体力学的力の変化に対応した骨梁ネットワークの発展を追跡する使用ことができることを示しています。特に、血管内皮細胞による経験豊富な剪断応力は、ノッチ シグナル伝達カスケードは、順番に肉を促進するを開始します。本稿では、我々 は、(1) gata1a MO 注入減少造血、したがってそれは壁面せん断応力を減少、抑制 (2) tnnt2a MO (3) wea と壁面せん断応力を減らすため心室の収縮機能を示されています。変異体を欠いて心房、心室、血行力減少がみられる。心臓壁のせん断応力を減らしては qRT PCR によって Notch シグナルを定量化し、減らされた WSS であることがわかった Notch シグナルを減少します。心内膜に欠けていたclo変異体は梁、さらに我々 の仮説を証明するために形作らないし、そのせん断応力は、Notch シグナル活性化を示した ADAM10 存在と拍動のせん断応力を血管内皮細胞にかけること。
共焦点顕微鏡など他のイメージング技術...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>.&#160;Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>. Additional&#160;author names were&#160;added, and an author affiliation was updated.

Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

血行動態のせん断応力などの生体力学的力は心臓の形態形成に密接に関与しています。血行動態のせん断力に対し、心筋の隆起部分および溝は房室 (AV) 弁1にわたってせん断応力の方向と配置で波のような骨梁ネットワークで開発します。心臓肉収縮機能と心筋質量2を増加する必要があります。Notch シグナルの突然変異の結果人間および他の脊椎動物3先天性心疾患。たとえば、 gata1a4 、 tnnt2a5 morpholino オリゴヌクレオチド (MO) は、エリスロポエチン (EPO) mRNA6とイソプロテレノール (ISO)7増加赤血球、赤血球を減らすために示されています。セルと心拍数, その壁せん断応力 (WSS)。さらに、ErbB2 下流シグナリング、ノッチ、促進する心筋細胞の増殖と分化、Notch シグナル8,9を起動収縮力を生成します。そのせん断応力が Notch シグナル心室開発の駆動肉を支配するをお勧めします。現在、さらに先天性心臓欠陥 (CHD)10、11,12につながる遺伝的プログラミング イベントを理解しようと多くの研究がありますが、ほとんどの調査はどのように機械力形成の心に影響を与えます。
機械の力を調査するために発達期間中に観察、心内膜に作用を実装する必要があります。しかし生体内で伝統的な顕微鏡13の内属のためサンプルを破っての質の良い画像を取得するために挑戦です。物理的な区分および染色はサンプル内で時間をかけて開発を観察するために、したがって、13,14,15を発生する必要。共焦点顕微鏡画像サンプル14,16の 3次元構造に用い、これらのイメージング システムの取得まだ遅いスキャン速度によって制限されます。
光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、動的イベント長い作業距離13で生体内での可視化を可能にするユニークなイメージング手法です。この技法は、サンプル17を光学セクションのライト シート蛍光顕微鏡を使用します。サンプルに光の薄いシートのみの照明、写真漂白、写真毒性13,18削減あります。ビューと長作動距離の大きい分野は、大きなサンプル画像13,14,17ありのままそのままをことができます。低倍率で、永い間、イメージを作成する大きい区域は、作動距離厚いサンプル信号対雑音比を損なうことがなくイメージを作成することができます。多くのグループ、画像全体胚17に LSFM を使用して脳14,18筋肉と心19他の組織の中で多様なイメージを作成することができますのサンプルを示します。
前の研究は、ゼブラフィッシュ心臓の流入または流出のトラックを遮蔽して減らされた血行力学的せん断力を実証、情報はもっぱら定性的です。それによって異常な第 3 室、減少心臓ループと障害弁形成20。4 D の LSFM 画像は、心臓組織の開発血行動態のせん断力に影響を与える方法に新しい視点を与えます。これらの機械力が敏感なシグナリング分子をアクティブにし、骨の隆起部分の形成を誘導します。4 D イメージングの追加時間の側面、ためこれまで見過ごされていた新しい啓示につながる可能性がリアルタイムでの変化を追跡することであります。ゼブラフィッシュ イメージング科学者は、細胞間の相互作用だけ対全体の脊椎動物を観察できるための理想的なモデルであります。酸素もなしに行われる血管システムに応じてとは異なり哺乳類の開発の開発を可能にする全体の胚を介して拡散します。ゼブラフィッシュ心臓 4 chambered 中心、肺の器官を欠いているにもかかわらず、ゼブラフィッシュと人間21の間保存されている心臓の遺伝子の数が多いがあります。
本稿では、ゼブラフィッシュの心のさまざまな状況で発展途上の梁をイメージさせるライト シート蛍光顕微鏡を使用する方法をについて説明します。まず、 gata1a4 tnnt2a5の注射 MOs は低血液粘度と WSS に使用されました。心臓の形態を記録しただった。魚の別のグループ、 EPO mRNA6またはイソプロテレノール7を管理することにより、WSS を増やし、結果を観察しました。異なる脈動や振動流量と細胞の調査を実施しました。各グループをイメージング、わかった WSS をノッチによる心内膜で感じたこと開始肉をシグナリングします。

<table><tbody><tr><td>クロンテック ハイファイ PCR プレミックス&nbsp;</td><td>タカラ&nbsp;</td><td>639298</td><td>PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td></tr><tr><td>Human Nrg1 cDNA</td><td>William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td><td>N/A</td><td>脳梁救助に使用 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td></tr><tr><td>CFX Connect&trade;リアルタイムPCR解析システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1855201</td><td>PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>pCS2+</td><td>GE mRNA</td><td></td><td> 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td></tr><tr><td>ヌクレオスピン精製キットの合成に使用&nbsp;&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>740609.25</td><td>DNA精製 1.1.2.3、1.1.2.4、1.1.6.2</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>2011A</td><td>PCR Ligation solution 1.1.2.5</td></tr><tr><td>ステラコンピテント細胞</td><td>Clontech</td><td></td> <td>636763E. coli 形質転換に使用される細胞 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Transfection reagent 1.1.4</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td>mRNA の合成に使用されるキット 1.1.6.3</td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td>Purifies RNA&nbsp; 1.1.6.4, 3.1.2</td></tr><tr><td>GeneTools 4.3.8</td><td>GeneTools</td><td>N/A</td><td>プライマーデザイン用ソフトウェア 1.2.1, 3.1.3</td></tr><tr><td>EPO cDNA</td><td>Creative Biogene</td><td>CDFH006026</td><td>WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td></tr><tr><td>AG1478</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4182</td><td>ErbB inhibitor 1.3.1</td></tr><tr><td>E3 培地</td><td></td><td></td><td>胚を成長させる 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5942</td><td>&gamma;-セクレターゼ阻害剤 1.3.2</td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>A9539</td><td>胚のマウントに使用 2.1.1.1</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT&nbsp;デジタルCMOSカメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td>C11440-42U</td><td>画像撮影に使用 2.1.1.2, 2.1.1.3</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>画像を3D、4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td></tr><tr><td>メシル酸トリカオン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>886-86-2</td><td>人道的に胚を鎮静または犠牲にするために使用される 3.1.1</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成キット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708890</td><td>cDNA 3.1.2</td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5424 微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-400-005</td><td>微量遠心分離機 4.1.1.3</td></tr><tr><td>GI254023X</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>260264-93-5</td><td>ADAM10阻害剤 4.1.2, 4.1.3&nbsp;</td></tr><tr><td>イソプレナリン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5627</td><td>イソプロテレノールは WSS を増加させる 5.1.5</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>心臓力学解析</td></tr></tbody></table>

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

血行動態の軍によって心臓の影響心臓開発、特に肉は、分岐増生心筋からのネットワークを形成する経験します。ノッチ シグナル伝達カスケードは心室欠損症左室非圧縮の心筋症や左心低形成症候群などに関与しているの欠陥の遺伝的プログラム.このプロトコルを使用して、それを決定できます駆動せん断応力肉と Notch シグナルは互いに関連しています。光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の開発の可視化は可能だった。本稿では、それは血行力 Notch シグナルによる肉の開始を調節してしたがって、収縮機能に影響を与えるかどうかが評価されたに発生します。質的・量的にせん断応力解析、4 D (3-D + 時間) ゼブラフィッシュ心臓の形態形成時に得られた画像と 4 D 同期統合光シート蛍光顕微鏡は心室拍動を捕獲しました。血液粘度ではそれにより、せん断応力を減少する - morpholino gata1a(MO) のオリゴヌクレオチド マイクロ射出成形を介してダウン調整ノッチ シグナル伝達と減衰の肉が減った。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、肉を復元するノッチ関連遺伝子を救出しました。Notch シグナルを駆動せん断応力影響肉を確認する心筋細胞の収縮はさらにtnnt2a経由で逮捕された -MO、それにより血行力を減らすために非 trabeculated を開発するノッチ標的遺伝子をダウン調整心筋。最後に、せん断応力応答ノッチ遺伝子の発現パターンの確証は、内皮細胞を拍動流に服従させることによって行なわれました。したがって、4 D ライト シート顕微鏡は非圧縮の心筋症に臨床的意義と Notch シグナルと肉を基になる血行力を発見しました。

LSFM は、高解像度の 2 D と 3 D の画像を取得するためにこの原稿で使用されました。図 1 aおよび1 bに見られるように照明レンズはサンプルで光シートを指示します。光シートの薄さ、ため 1 つの平面だけが点灯します。検出レンズ照明レンズに垂直に配置されたは、照らされた面 (図 1 b) に焦点を当てた。照明レンズから光のシートは、左から右 (図 1) のサンプルを検索します。スキャン写真漂白、写真-毒性となっており低い信号対雑音比。
LSFM は急速なスキャン (&gt; 30 s) ボクセル解像度を持つ × 0.65 0.65 の x 1 μ m 単一平面照明のためによりTg(cmlc2a:gfp)胚全体の心臓...

4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch シグナルをアクティブに示します。

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

この方法は、4Dライトシート顕微鏡を使用したノッチシグナル伝達による心臓線維柱帯のせん断応力の調節など、発生心臓メカノバイオロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、サンプルの薄い部分を5ミクロンの平面で照らすため、光の漂白や写真の損傷が少なくなることです。さらに、私たちの計算アルゴリズムにより、4Dで鼓動するゼブラフィッシュの心臓を再構築することができます。この技術の意味は、初期発達段階から後期の表現型に至るまでの心線維柱帯のinvivo逐次視覚化を可能にするため、先天性心疾患の診断にまで及びます。一般的に、この手法に不慣れな人は、時間の経過とともに3次元で考えることを想像するのが難しいことに気付くでしょう。また、システムを作成し、正確に位置合わせするには時間がかかります。まず、ゼブラフィッシュのオスとメスを飼育水槽で仕切りを使って分けます。次に、仕切りを持ち上げて、オスとメスのゼブラフィッシュが繁殖するのを待ちます。ゼブラフィッシュの胚を採取し、モルフォリノオリゴを胚に注入して線維柱帯を抑制します。次に、100ミリリットルの蒸留水に1グラムのアガロースを加えて1%のアガロースゲルを調製し、アガロース全体が溶解するまで加熱します。アガロースを冷ましてから、20マイクロリットルのピペットを使用して、準備した胚とアガロースの1つを小さなプラスチックチューブにロードします。チューブを顕微鏡ステージに固定し、テンx対物レンズを使用します。ノブを使用して、胚の上部に焦点が合うように対物レンズを調整します。5ミクロンの薄いシートの厚さを使用して、複数の心拍サイクルにわたって魚の胚全体の画像を撮影します。露光時間を 10 ミリ秒にして 500 xy フレームを収集します。次に、zアクセスのステージを1ミクロン移動して新しいレイヤーに移動し、イメージング手順を繰り返します。心臓全体が完全にイメージ化されるまで、z 平面あたり 500 フレームを想像し続けます。次に、画像処理ソフトウェアを開き、画像を3Dに積み重ね始めます。これを行うには、まずオープンデータをクリックします。ここでは、3D に積み重ねるすべての画像を選択し、[読み込み] を選択します。次に、0.65 x 0.65 x 1ミクロンのボクセルサイズを追加し、[OK]をクリックします。正しいボクセルサイズを入力することは、3D画像を正確に解析するために重要です。次に、マルチプレーナービューボックスをクリックして、3D画像を視覚化します。青いスライスの 1 ドットの tiff ボックスを右クリックし、[表示] を選択して、[volran] をクリックします。編集メニューで、オプションを選択し、カラーマップを編集します。ボックスを使用して色を調整し、[OK]をクリックします。画像処理ソフトウ

light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ライトシート蛍光顕微鏡は、胚発生をイメージングするための優れたツールです。これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録できます。私たちは、広い時空間スケールでのゼブラフィッシュの眼の発達のイメージングへの応用を実証し、マルチビューデータセットの融合とデコンボリューションのパイプラインを提示します。...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。...

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

光シート蛍光顕微鏡で 生体内...

ゼブラフィッシュ胚における高速心臓ダイナミクスの光シート顕微鏡

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。...

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

生理学的および病理学的圧力の条件に心臓弁組織を施すことのできる周期的圧力のバイオリアクターを設計されています。...

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

我々は、ヒト血清からの低分子量タンパク質およびペプチドの選択的回収のためのメソポーラスシリカ薄膜に基づいて技術を開発しました。私たちのメソポーラスチップの物理化学的性質を細かくペプチド濃縮の実質的な制御を提供し、その結果、診断のため血清プロテオームのプロファイリングをするように調整されました。...

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

このビデオプロトコルでは、改良された2光子顕微鏡の軌道追跡法を使用して、生細胞内の蛍光標識されたリソソームを高速かつ3次元で追跡します。...

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

学ぶ光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の4次元画像再構成法。せん断応力がNotchシグナル伝達を活性化し心臓梁形成に関与する機序を可視化し、先天性心疾患の診断への応用可能性を示す。

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

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