Name: 平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min
Description: 学ぶ平面支持二分子層の調製と単一分子蛍光顕微鏡の構築法。ニッケルキレート脂質を用いた膜タンパク質の固定化と全反射蛍光顕微鏡による高感度イメージング技術を解説します。

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MAは行財政支援のためのオーストリア科学基金（FWF、J3086-B11）と感謝のシュレーディンガーの交わりマックスプランク協会によってサポートされていました。 GSは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS13-030）によってサポートされていました。 JHは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS14-031）によってサポートされていました。

1.生成と平面のSLBの機能化<ol><li>脂質の混合<ol><li> 10％DGS NTA-Ni系/ 90％POPC脂質組成に到達するには、250ミリリットルの丸底フラスコに、クロロホルム中のPOPCおよび6.9 mgのDGS NTA-Niを45 mgを溶解します。次のステップでそれを蒸発させ、クロロホルム低い（ちょうどいくつかのミリリットル）のボリュームを維持します。 1％DGS NTA-Ni系/ 99％POPC脂質組成は49.5ミリグラムPOPCおよび0.69 mgのDGS NTA-Ni系を使用してください。 </li><li>ゆっくりロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを削除 - 周囲温度を超える上昇は必要ありません。代替的に、窒素またはアルゴンなどの不活性ガス気流中で化学フード内側に吹き飛ばします。これをやっている間、常に丸底フラスコの下半分に乾燥脂質の同等の堆積を可能にするために、フラスコを回します。 </li><li>クロロホルムの大部分が蒸発されると、定量的にクロロホルムを除去するために、O / Nを真空フラスコを接続します。 注：この手順は、汚染を避けるために重要です後の段階では毒性クロロホルムでタンパク質や細胞の脂質二重層の流動性を確保します。 </li></ol></li><li>乾燥した脂質の単層小胞（SUVの）の生成 注：小型単層小胞（SUVの）直径は20nmと100nmの間であり、容易に浴超音波処理することにより製造することができます。脂質押出し、別の方法では、押出成形のために適用されるフ​​ィルターの細孔サイズに応じて、SUV車を生じさせることができ、また、大単層小胞（LUVを）、サイズが100ナノメートル〜1000ナノメートルです。しかし、SUVがのSLBを形成するのに最適です。 <ol><li>バス超音波処理を通じてのSUV（ビデオに示されています）： <ol><li> PBS Degass。 10 mlの250 mlの乾燥した脂質混合物を懸濁さ丸底フラスコに、PBSを脱気しました。 </li><li> 、窒素やアルゴンなどの不活性ガスでフラスコを記入ストッパーで、それを閉じ、オートクレーブテープでフラスコを密封します。 </li><li>バス超音波処理器に密封されたフラスコを置き、脂質懸濁液aを超音波処理トン120 170 Wにそれが透明になるまで。これは、30〜60分かかります。 </li><li>小胞形成の分光測光法の進行状況を監視します。PBSと比較して、未希釈エマルジョンの吸収が（脂質濃度のおおよその指標として）234 nmで一定のまま、まだ原因を経由して減少し、光散乱（550nmで著しく低下する必要があることを結果として起きますより大きな粒子）。 </li><li>連続したSLBの形成を妨げる重い非単層小胞を、ペレットに、25℃で1時間150,000×gで遠心分離によって小胞懸濁液をペレット化した後、288,000×gで、4℃で8時間。 </li><li>孔径0.2μmのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。 </li><li>小胞の準備の明快さと脂質の残量を監視するために、234 nmおよび550 nmでODを測定します。 </li><li>アルゴンまたは窒素下で4℃で小胞を保管してください。必要に応じて、二層の製造のための小胞懸濁液を使用数ヶ月のために。 </li></ol></li><li>脂質押し出しを通じてのSUV： <ol><li>簡潔には、孔径0.1μmのフィルターを介して脂質懸濁液を数回通過します。かかわらず、製造方法、遠心ベシクル懸濁液の二倍（1H、15万グラム、25℃、その後8時間、4℃、288000グラム）重く、非単層小胞をペレット化します。 注：不活性ガス下で4℃で保存したとき、小胞は、数ヶ月のための二層の調製のために使用することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> SLBの形成とタンパク質と充電<ol><li>濃硫酸と30分間、30％過酸化水素水の3：1混合物で24×50mmの＃1.5ガラススライドを処理します。 注：これにより、混合物の積極的な性質のために特別な注意を払うビデオに示すように、すなわち白衣や安全ゴーグルを着用！ </li><li>噴出ボトルのうちのddH 2 Oの流れの下でガラススライドを洗浄します。テフロンスタンドにそれらを配置し、それらを乾燥させ10〜30分間。 </li><li> 、8または16ウェルチャンバーの底のガラススライドを削除するエポキシ接着剤で底を記入し、慎重に接着剤で覆われたチャンバーの底部に清潔で乾燥したスライドガラスを配置します。接着剤は、約10分間硬化してみましょう。下から余分な接着剤を除去します。 注：スライドガラスとチャンバとの間の気密シールはまた、容易に10〜30分以内に硬化する歯科用二成分シリコーンモデリングペーストを使用して達成することができます。このシールはエポキシ接着剤のようにしっかりとではなく、定期的な歪みに耐えます。実験後には容易に将来の実験において、次に再利用可能である、チャンバから除去することができます。 </li><li> 8（16）の各ウェルに10倍のPBSで希釈された脂質懸濁液のピペット120μL（60μL） - 20分とさせて二層形式（上記のように調製した）ウェルチャンバー。慎重に15ミリリットルPBSで2回二重層をすすぎます。二重層が形成されると、それは常にバッファ内に沈めなければならず、空気にさらされることはありません。 </LI&gt; <li> 330μl（8ウェルチャンバー）または165μl（16ウェルチャンバー）を脱いで、その後、PBSで各ウェルのすべての方法を入力します。ウェル内に残って（175μl）350μlのがあります。各ウェル（400または200μlの最終）にPBSで希釈したHisタグ化タンパク質を含むカクテル50μlの（25μlの）を追加し、暗所で60分間室温でインキュベートします。表面タンパク質の濃度は、このインキュベーション工程の間にタンパク質濃度を変えることによって調整することができます。 </li><li> 15ミリリットルPBSで2回各ウェルを洗浄します。 注：一般的には、SLBのは、彼らがタンパク質で充電した後、もはや6時間以上の実験で使用されるべきではありません。この期間中、光退色後の蛍光体回収率は95％まで残り、二重層関連タンパク質には損失を検出することはできません。タンパク質濃度は、（下記参照）は、実験に先立って決定されるべきです。 </li><li>オプションのステップ：SLBを含むタンパク質DGS NTA-Ni系の非特異的結合について試験するために、PBSを300mMのイミダゾールを含有する一回SLBを洗います。プロテインは完全にオフに来る必要があります。 </li></ol></li></ol> 2.顕微鏡のセットアップ<ol><li>単一蛍光色素の蛍光を検出することができる顕微鏡システムを構築するための導入に記載された勧告を参照してください。 </li></ol> 3.パワー測定注意：フルオロフォアは、容易に過剰な励起光を飽和させることができます。これは、発光の無い、さらにゲインで退色加速ので、避けるべきです。試料照明を最適化するために、励起パワー密度は、試料において直接測定されるべきです。このような測定は、将来の実験のための基準として機能することができます。光は撮像システムで失われる場合に評価する際にさらに、入力および出力のレーザパワーとの比を知ることは有用です。 <ol><li>それは90°角度で目標を残すように直立位置に励起ビームを移動します。 </li><li>トップOに電力計のヘッドを配置ビームfおよびビーム（= P）の電力を測定します。その結果を文書化します。 </li><li>潜望鏡を使用して、全反射位置とイメージそのまま均質な蛍光二重層にビームを向けます。漂白およびCCD信号飽和の場所を回避するために、中性密度（ND）励起光路内に2〜3の光学密度（OD）を用いて濾過します。 <ol><li>全体の照明視野（=私は合計 ）の統合されたカウント数を測定します。また、照明領域（= 合計 ）の大きさを測定します。最大限に照らさ中心スポットだけでなく、スポット（= 中央 ）のサイズの積算計数値（= I・センター）を測定します 。 </li></ol></li><li>ピクセルあたりの背景信号を測定する（= B）のいずれか照射領域外またはサンプル照明なし。 </li><li> 3での測定結果）からのバックグラウンド信号を減算します。背景に質問（全体照明領域または中央スポット）内の領域の画素数を乗じてこれを行いますピクセル当たりのカウント。 （=私は合計 - 総 .Bと私の中心 - 中心 .B）を。 </li><li>割り統合されており、背景には、照明のフィールド全体の統合とバックグラウンド補正された信号によって中央スポットの信号を修正しました。 注：結果は、中心スポット（=（I センター - センター .B）/（私は合計 - 総 .B））内に位置する総電力の割合を示しています。 2で測定された電力Pと、この結果の乗算）光照射の中心スポットのパワーの結果。 </li><li>スポットμm² の中央のサイズを決定します。これは、対物レンズの倍率によってμm単位でカメラの画素サイズを分割するために、ピクセルあたりμm²として結果の二乗を取ります。 <ol><li>あるいは、顕微鏡上に配置されたマイクロメータスライドを使用して、画像内のピクセルサイズを測定し、画素あたりの面積と結果の二乗を取ります。 MULTiplyセンタースポット内に位置する画素数で、この値は、照射スポットのエリアに到達します。 </li></ol></li><li>センタースポットセンターの大きさで、中心スポットを照射する電力Pを分割し、μmの2あたり照明強度を計算するμm²。一例が図6に示されています。 </li><li>非TIRF照明で測定された電力密度の値は、典型的には、レーザ光 ​​が全反射される正確な角度に依存するTIRF照明13内に存在するものよりも低いです。 TIRF照明下で現在の電力密度に到達するには、画像非TIRFとTIRFの両方では0.1μm径の蛍光ビーズをキャリブレーション。 TIRF非TIRFモードで測定されたビーズの蛍光強度の比は、TIRF照明（式1）の下で効果的なものに測定された電力密度値の変換を可能にする変換係数Cに達します。 電力密度 </eM&gt; TIRF = C•電力密度非TIRF（式1） Cと=ビーズ強度T IRF /ビーズ強度非TIRF </li></ol> 4.密度測定<ol><li>二層に位置して、個々の蛍光体の平均信号を決定します。蛍光性ペプチドを負荷した二層付MHC分子は、タンパク質ので、この目的のために理想的である：ラベルの化学量論は、1つのです。視野内の二層に必要な漂白剤は、すべてのラベルの場合、蛍光は、単一の蛍光色素分子を可視化するために回復しましょう​​。 <ol><li>立て続けに記録する画像（例えば、ストリーミング取得プロトコルを適用）と、複数のフレームの上に単一分子の移動を監視します。詳細については、図7を参照してください 。 </li></ol></li><lI&gt;マークROIとして二重層内の中央照明スポット。 ROIを測定し、（蛍光強度に比例する）照明の電力密度の分散は15％以上、理想的に小さくする必要があります。 <ol><li>これだけROI内の単一分子とバルク蛍光を決定します。単一エミッタの点広がり関数の99％以上を捕捉するのに十分な大きさのROIの信号を統合します。 （メーカーのカメラ仕様に記載された）16-20ミクロンの画素サイズを有するカメラを用いる場合、100倍の倍率に等しいまたは1.45より大きい開口数を有する対物レンズを備えた7画素で7領域を取ります広場の中央に位置する強度ピーク。 </li><li>バックグラウンド信号を決定するために、蛍光シグナルが含まれていない隣の7 7ピクセルの正方形の数を統合します。単一分子フッ素ための補正値を決定するために、単一分子のシグナルからバックグラウンドを差し引きますescence。まだ次のフレームに表示されている信号のみを選択します。 </li></ol></li><li>数百倍に手順を繰り返し4.2 50。バックグラウンド補正された信号を平均します。所望の場合、ヒストグラムとして単一分子強度値をプロットします。オプション：オープンソース・ソフトウェア・パッケージの適切なプラグイン（例えば、ImageJの）を利用するか、市販のソフトウェア（例えばをMetamorph、Molecular Devices）を使用してデータを処理します。経験豊富なユーザーは、MATLABなどのソフトウェアパッケージで、独自の解析プログラムを書き込むことができます。 </li><li>励起経路に2以上の減光フィルタを配置し、同じフルオロフォアで標識されたタンパク質を含む蛍光二重層の画像を撮影します。単一分子の強度の測定に使用されるのと同じROI内の平均ピクセル強度を記録します。バルク蛍光測定の露光時間を記録します。バックグラウンド減算のための照明なしで同じ場所を測定します。 </li><li> BI内のタンパク質濃度を決定するために、層は、平方ミクロン当たりのピクセル（例えば41.5）、100（2のODとNDフィルターを使用した場合）、または千数（場合によりステップ4で決定した背景補正されたバルク蛍光平均画素強度を掛けるND 3のODのフィルタを使用した）と露光時間がステップ2で使用し、ステップ3で決定された平均一分子信号で割り、露光時間は、ステップ2で使用され、タンパク質あたりの蛍光体の数。 </li></ol> 5.テスト二層の整合性<ol><li>蛍光二重層を準備し、上記のように顕微鏡のステージ上に置きます。 </li><li>フォーカスを調整し、全反射モードでの二重層の画像を取ります。小さな円盤状のROI内の蛍光を除去するために、非TIRFモードで短いが強烈な漂白剤パルスを適用します。 </li><li>蛍光回復の速度を監視するために、すぐに漂白し、その後、5〜10秒後に低強度のTIRFモードで二重層の画像を取ります。 </li><li>モー二層の異なる領域にVEの、ステップ2と3は、漂白剤のパルスの後に低強度TIRFモードで5分を別の画像を取るに従ってください。次のように不動の割合（IF）を計算するために（何の漂白が発生していないはずです）、実験の開始時に、I 0を漂白する前に、私は漂白剤領域に漂白剤を投稿強度を決定し、強度にそれを比較します： 不動の分画（％）=（I 0 -私は漂白剤を投稿 ）IF /（I 0 -背景）は、×100 適用されていない励起光のROI内の背景=測定された強度を持ちます IFは、10％未満（理想的には5％未満）であるべきです。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利害関係を有していないことを宣言します。

単一分子顕微鏡は、それらの天然の細胞環境内のタンパク質の挙動を研究するユニークな機会を提供します。分子イメージングは​​、広範な科学界に、したがって、ますます魅力的になり、まだ多くの生命科学者はまだ離れて技術とノウハウの初期投資を敬遠。自分のイメージングシステムの組み立てに起因する主な利点は、それが容易に誰の特定のニーズに合わせることができるということです。 本明細書に示唆されるように、非TIRF励起光が容易に既存のTIRF光路に加えて実施することができ、フルオロフォアおよびリガンドの迅速で定義された光退色（または-活性化）が望まれる場合、例えば実行FRAPまたはリガンドアンケージング実験14 。放射ビームスプリッタの導入は、少なくとも二つの、いくつかのケースでは4つの蛍光チャンネルまでの同時録音が可能になります。拡張子のリストは、本質的にのみによって制限されています自分の想像力。 例えば、放射パスに電動式発光フィルタホイールを実装する最大10個の異なる蛍光チャネル間の高速スイッチングが可能になります。直列に（それぞれ10フィルタスロットを装備した）は、2つの電動発光フィルタホイールを組み合わせる場合、最大18の蛍光チャネルを読み出すことができます。 TIRFベースのイメージングは​​、キセノンまたは水銀ランプ励起経路の統合後のカルシウム動員の測定値と干渉反射顕微鏡（IRM）で補完することができます。 IRMは、ガラス表面またはSLBに結合している細胞及びTIRFベースの撮像データを解釈するとき、従って、重要な情報を提供することができる程度を視覚化するために選択される方法です。シンプルなダイクロイックミラーを使用すると、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）または確率的光学再構築顕微鏡（STORM）を実施できますnmで405の追加のレーザー、すなわち2 superresolutに広がった励起ビームの確立可視光15,16の回折限界以下の位置精度でイオン方法。 しかし、実験の成功だけでなく、適切なハードウェアの問題です。ノイズ低減TIRFベースのイメージングを最大限に活用するために、細胞は、細胞表面上の制約を課すか、それはその形質膜の生理機能に干渉しないやり方で表面に接触する必要があります。すべてのSLB-埋め込みリガンドは、横方向に、移動され、結合および分離ダイナミクスを受容体に応答して、二重層内での横方向の位置を調整するため、細胞接着のための適切なタンパク質で官能のSLBは、この目的によく適している超えます。 再現可能な方法でのSLBを製造するためには、高純度のSUV車でスタートするのがベストです。本明細書に記載されるように、これらのIのような2つの超遠心分離工程においても、超音波処理の間に生成された多重膜小胞を除去することが重要です高い流動性を特色に連続するのSLBの形成とnterfere。唯一のきれいなガラス表面上に高品質のフォームののSLB。一度洗浄したガラススライドは、直ちに使用または真空に格納する必要があります。これは彼らの混乱につながるとして重要なのは、SLBのは、空気にさらされてはなりません。 SLBの洗浄はこの保存はなく、時間を節約する手順だけではないように、バッファは血清学的ピペットを使用してすすぎ、示されるように、関与します。 SLB常駐タンパク質の回収および精製中に界面活性剤の使用は避けるべきです。ときに微量に存在する界面活性剤があっても有意にタンパク質の移動性が低下するからです。すべて一緒に洗剤の必要性を回避するために、分泌されたポリヒスチジンタグを搭載したリガンドの可溶性発現は、哺乳動物細胞や昆虫細胞で推奨されています。大腸菌封入体からのリフォールディングが必要な場合は、注意が彼らの不およびリフォールディングの前に封入体から効果的に界面活性剤を除去するために適用する必要があります。 具体的には、細胞活性化および細胞接着のために与えられた受容体 - リガンド相互作用の役割を分析することができ、それらのモジュール式reconstitutive自然からのSLB結果を採用する主な利点は、。これに関して、DGS NTA-NiはNTA-NI結合部位について競合するタンパク質を防止するために、SLB内の10％に存在するべきであることを言及することは重要です。わずか1％または2％のDGS NTA-Ni系、与えられたポリヒスチジンタグ融合タンパク質種は未発表（第2ポリヒスチジンタグ付きタンパク質種の量の増加を同時インキュベートする場合は特に、気づいたことができるの関連の減少を保有するSLBを使用する場合観察）。 10％DGS NTA-Ni系を搭載したのSLBで作業する場合、この現象は見られません。 我々はDGS NTA-Niを含むのSLBに試験したいずれのポリヒスチジンタグ融合タンパク質の非特異的結合を観察したことがないものの、初めてのタンパク質を導入する際に、この可能性をテストする必要があり、この目的のために、我々はDGS NTA-Ni系（タンパク質が結合してはならない）を欠いているのSLBの使用をお勧めします。 DGS NTA-Niを含むSLBを使用した場合第二に、タンパク質は、PBSを300 mMイミダゾールを含有するSLBを洗浄した後、完全にオフに来る必要があります。 SLBを採用する別の重要な利点は、一時的な相互作用およびシグナル伝達事象を高める時空間解像度17-19で監視することができるということです。三次元的な結合プロセスは、本質的に2つの撮像寸法に縮小されるので、これはノイズ弱毒TIRFモードで記録する場合は特に、少なくとも部分的にあります。 SLBを使用すると、単一分子信号検出、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）または確率的光学再構築顕微鏡（STORM）の前提条件と、回折限界15,16以下の解像度を持つ、すなわち超解像顕微鏡と互換性があります。これらの特別なイメージングモダリティは、単一分子フェルスター共鳴エネルギートラを有効にシナプス環境20内の個々のタンパク質-タンパク質相互作用を可視化するために設計さnsfer実験。このアプローチは、21「FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して結合TCR-のpMHCの測定」と呼ばれるJoveの出版にかなり詳細に説明されています。 SLBベースの実験を解釈すると1は常に生細胞の形質膜のないすべてのプロパティは、SLBのことで紹介されています心に留めておくべきであり、欠けている資質のいくつかは調査中の生理機能に影響を与える可能性があります。結局、SLB-埋め込 ​​まれたタンパク質は、自由に拡散し、その細胞カウンターパートのほとんどは5,6,22であるため膜マイクロドメインに組織化されていません。ある程度の生細胞の細胞膜構造を節約する接着性細胞に由来する固定化された原形質膜シートは、正常Bリンパ球23によって膜に埋め込 ​​まれた抗原の取り込みを研究するために使用されてきました。しかし、このような膜は、非常に動的な細胞骨格と相互作用し、それらは硬質ガラス面でサポートされているとして何の柔軟性を備えていません。これらの不一致を考慮して調整可能な柔軟性の面で、または局所的に適用される光パルスに応じてその剛性を変更する面でサポートされている定義された方法でタンパク質を区分するための手段を提供し、エンジニアリングのSLBの必要性が明らかに存在します。

<table><tbody><tr><td>#1.5スライドガラス</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>250ml 丸底フラスコ</td><td>VWR</td><td>201-1357</td><td></td></tr><tr><td>50:50 ビームスプリッターキューブ</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td></td></tr><tr><td>音響光学変調器 C1205-2</td><td>アイソメット</td><td>は</td>、<td>変調できないCWレーザーを使用する場合のみ必要</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Life technologies</td><td>A-20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-NHS</td><td>Lifeテクノロジー</td><td>A-20009</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-NHS</td><td>Life</td><td>テクノロジーA-20006</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブテープ</td><td>VWR</td><td>489-1312</td><td>またはその他の熱安定性粘着性テーブ</td></tr><tr><td>Avanti Mini-Extruder Avanti</td><td>Lipids</td><td>610000</td><td>バスソニケーター</td></tr><tr><td>の代替品 バスソニケーター QSONICA Q700</td><td>QSONICA</td><td>Q700</td><td></td></tr><tr><td>ビームスプリッター</td><td>ケアン</td><td>P280 / 210 / MLS</td><td></td></tr><tr><td>のB&uuml;カイロータリーエバポ</td><td>レーターVWR</td><td>531-0837</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td>代替<td>案の原稿テキストを参照してください</td></tr><tr><td>concentarted 過酸化水素</td><td>ロス</td><td>9683.1</td><td></td></tr>濃縮<tr><td>硫酸</td><td>ロス</td><td>X944.2</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ接着剤</td><td>ウーフー45705</td><td></td>ウー<td>フープラスsofortfest 2分</td></tr><tr><td>フィルターホイール</td><td>サッター機器</td><td>ラムダ10-2LabTek</td><td></td></tr><tr><td>チャンバーVWR734-2062</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー&nbsp;</td><td>Toptica</td><td>の</td><td>異なるバリアント(波長375 - 785 nm)が利用可能です</td></tr>レンズ<tr><td></td><td>Thorlabs、Newport-DGS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NTA-Ni(脂質)</td><td>Avanti Lipids</td><td>790404C</td><td>は、すでにChoroform-解決されたnicekl塩バリアントの配信バージョン</td></tr>に<tr><td>POPCです(脂質)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850457C</td><td>は、すでにChoroformに解決された配信バージョンをお勧めします</td></tr><tr><td>顕微鏡 ツァイス Axiovert 200</td><td>ツァイス</td><td>ミラー</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>光学フィルター</td><td>AHF、彩度、セムロック</td><td></td><td>フィルターセットは、染料オ</td></tr><tr><td>シロスコープ</td><td>BK Precision&nbsp;</td><td>2120C</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー14190-136</td><td>脱気使用</td></tr><tr><td>ペリスコープ</td><td>Thorlabs</td><td>RS99 / M</td><td></td></tr><tr><td>picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>13001000</td>エポキシ<td>接着剤</td></tr><tr><td>パワーメーターLasermate-Q</td><td>コヒーレント</td><td>-</td><td>使用されるスペクトル範囲で敏感な任意のパワーメーターの代替品を行います</td></tr><tr><td>パルス発生器</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SRS DG535&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>空間フィルター</td><td>Thorlabs</td><td>KT310/M</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター 0.2&micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 対応アポクロマート対物レンズ 100x, NA 1.46</td><td>Zeiss</td><td>440782-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロメタン/クロロホルム</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 超遠心分離用ポリカーボネート 1.00 mm, 11 mm x 32 mm&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー45237</td><td></td></tr><tr><td>ソルバル超遠心分離機&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーRCM150GX</td><td></td></tr><tr><td>超遠心ローター</td>サー<td>モフィ</td><td>ッシャーS120-AT2UV</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計Nanodrop2000c</td><td>サーモフィッシャー</td><td>真空</td><td></td></tr><tr><td>ポンプ</td><td>VWR181-0248</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

たった10年の間に、単一分子顕微鏡は、光学とレーザー物理学の強力なバックグラウンドを持つ物理学者だけが共有する孤立した領域から、今ではあらゆる場所の生命科学者によって鮮やかな注目を集める学問へと変化しました。これは、1分子イメージングが、生細胞内のタンパク質のin situ挙動を明らかにし、可視光の回折限界2を下回る前例のない解像度で細胞組織を明らかにする独自の可能性を秘めているためです。ガラス支持平面脂質二重膜(SLB)は、懸濁液中で増殖する細胞をスライドガラスに十分に近づけて、ノイズ低減された全反射照明モードで容易に画像化できるようにする強力なツールです3,4。これらは、細胞間接触形成、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、免疫認識など、さまざまな原形質膜関連イベントにおけるタンパク質ダイナミクスの研究に非常に有用です。移動性の高いタンパク質機能SLBを再現性のある方法で作製する方法、タンパク質内の移動度を測定する方法、および1分子検出を使用してタンパク質密度を測定する方法など、簡単な手順が紹介されています。TIRF照明機能を備えたコスト効率の高い1分子顕微鏡システムを構築する方法と、それを実験で操作する方法を示します。

単一分子蛍光顕微鏡システムのアーキテクチャは 、図2にかなり詳細に概説されている。このような光学部品やその他のハードウェアコンポーネントなどの個々の部品は、導入部で説明されています。 TIRFと非TIRF照明に定義された方法で生じる光学的励起ビーム経路は、示され、5〜図3で説明されています。に位置する第1のペリスコープ鏡の前で50:50のビームスプリッタの位置に注意してください。マイクロメートル翻訳可能な段階（ 図5）。このビームスプリッタは、（緑色で表示）イメージングに使用TIRFビームと（赤で示した）非TIRFビーム（ 図3で説明したように）漂白またはローカル開口定義の光媒介サンプルの活性化のために使用を重畳します。 （オレンジ色で示された図5）合成された光路が反転MICRの背面ポートに二潜望鏡のミラーを介して反射され、oscope。 図4で説明し、 図2に概説したように、2つ、または3つの凸レンズの実装では、レーザビームプロファイルを広げ、TIRFで試料を照射する2平行ビームを生じさせるために対物レンズの後焦点面にレーザ光 ​​を集光しそれぞれ、非TIRFインチ試料上の電力密度を計算するために必要な測定された強度値の一例は、図6に示されている。平均背景信号（画像化のために使用される）照明され、中央部に測定された強度から減算されるように、内の領域において決定されますレーザー光（ ここでは7089カウント）によって照明されていない視野。点灯（1684カウント）、中央エリア（4830カウント）のバックグラウンド補正後の平均強度が、その後積分強度を生じさせるために対応する領域のサイズを乗算している（1.471照射された領域のための ×10 8カウントと中央エリアの3.424×10 7カウント）。中央と照らされた領域内の積分強度の比は、中央エリア（0.23または23％）を照明する全体の電力の割合をもたらします。映画の中で示されるように、全体的なパワーは、非TIRF照明モードでパワーメータを用いて客観的に決定されなければなりません。この例では、このように中央領域内の5ミリワットのx 0.23 = 1.15ミリワットの電力を生じさせる、5ミリワットに調整されます。 1〜2μm程度の例で41.5ピクセル量は、中央領域が7089ピクセル/41.5ピクセル×μmの2 = 170.8 平方 μmの大きさを有しています。このエリア（170.8 平方 μm）により中央エリア（1.15 MW）を照射する光のパワーを分割すること、平均電力が得られ中央エリア内の0.7キロワット/ cm 2の密度。 図7は 、画像や（すなわち10ミリ秒の時間枠で、毎秒100フレーム）迅速に連続して取得し、単一の蛍光色素分子の対応する強度結果を提供しています。強度の定量化のための蛍光シグナルをカバー7（= 49）画素、7つの矩形領域の平均信号は、決定されます。また、バッ​​クグラウンドの平均シグナルは、単一分子信号に近接して7 7ピクセルの矩形領域内で決定されます。バックグラウンド補正された平均値信号（太字で示される）単一分子シグナルを生じる領域内の画素の数（= 49）が乗算されます。 SLBに関連した蛍光標識タンパク質の移動度を評価するために設計された代表的なFRAP実験は図8に示されている。 図8Aに repeti注広がった低強度のイメージングビームと0秒の時点でより狭く、迅速な蛍光色素の切除のための開口部に定義された高強度の光第二の単回使用の的を使用。前漂白剤パルスに初期の平均強度値で規格化された黄色の円内のバックグラウンドを差し引いた平均強度は、蛍光が回復した先の速度と程度を記録するための時間に対して、図8（b）にプロットされています。図に示すように、最初の二層強度の90％以上が（緑の線で示される）蛍光色素アブレーション、次の75秒以内に回復しました。結果として示さSLBに埋め込まれたタンパク質の10％未満は不動です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig1.jpg" /> SLBシステムの概略1.概要図。 （A）のSLBは、POPC（百分の90から99）と合成脂質DGS NTA-Nで作られていますI（1〜10％）。きれいなガラス表面は、対応する脂質からなるSUV車で充電しているとき、彼らが自発的に形成される。（B）一旦形成されると、これらのSLBは、簡単に可溶性タンパク質で装飾することができますいずれかのCまたはのための12個のヒスチジン（12Hを含むN末端 ​​タグで拡張例共刺激分子B7-1および接着分子ICAM-1）または6個のヒスチジン各（2x6H、例えばαβMHCクラスII二量体）を含む二つのタグで拡張タンパク質二量体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig1large.jpg" target="_blank">これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig2.jpg" /> 励起および発光ビーム経路の図2の概要。ガスイオンレーザー（例えば、アルゴンやKr + +）は、音響光学MOを用いて高速遮断する動作させることができます<html> dulators。レーザーダイオードは、多くの波長で、今日利用可能であり、それらが電子的にマイクロ秒、怒りに変調することができるような優れた代替手段を表します。レーザビームは容易に2つ（ダイクロイック）ミラーと分割して調整し、二つ以上のビーム経路を生じさせるために、単純なビームスプリッタの使用と組み合わせることができます。この例では、TIRFイメージングビーム（イベントを監視するため）および（漂白剤フルオロフォアまたは開口部に定義された方法で、フォトアクティブケージ分子のいずれかに）漂白ビームが使用されています。両方の励起経路は、追加のシャッターを使用することによって互いに独立して動作させることができます。ペリスコープは、サンプルのTIRF照明を生成するために、対物レンズの後焦点面内で集束レーザ光を変換することができます。蛍光画像は、分光超高感度カメラ（例えば、EM-CCDまたは科学CMOSカメラ）を用いて取得する前に放射ビームスプリッタを使用して分割することができます。.COM /ファイル/ ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig3.jpg" /> 図3の対物の後焦点面内で集束ビームを変換することによってTIRF照明を調整するレーザ光 ​​の焦点位置を示すように、ビームの移動を介して周囲の中心から対物レンズの後焦点面内でずれています（潜望鏡ミラー構成を使用して）。臨界角は、全内部反射が起こるに到達するまで、結果として平行ビームが傾いた照明で対物レンズを残します。エバネッセント場は、全反射が生じるガラス・メディア・インターフェースで生成される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig3large.jpg" target="_blank">このFiのの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a><html>グレ。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig4.jpg" /> 図4.単純な光学系は、対物レンズの後焦点面にレーザビームを集束させる。3つまたは二つのレンズは、レーザビームを広げるとTIRF対物レンズの後焦点面上に焦点を合わせるために必要とされます。二つのレンズシステムは、三レンズ系よりも少ないレンズに関連するエラーを含むとTIRFイメージングビームを生成するために適している可能性があります。定義されたビームの広がりとシャープなエッジを持つ照明スポットを目指したときに光活性化または-bleachingを採用した研究のために必要とされるであろうように、3つのレンズは、望ましいかもしれない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53158fig5.jpg &quot;/&gt; 図5は、蛍光顕微鏡の背面にあるビーム経路の写真を注釈付き。既に図2に 1杖を概説するように簡単に示されている（非TIRFモード（緑色で示されている）他の2つの励起光、TIRFに1を実装赤）。これらは、50：50ビームスプリッタ（B​​S）を使用して重ねなります。凸面レンズ（L1及びL2）は、対物レンズの後焦点面にそれらを集中するために、それぞれのビームに配置されている（図示せず）。二つのミラー（M1とM2）からなる潜望鏡は、顕微鏡へのエントリのポートを介して両ビームを案内します。第1のミラー（M1）は、TIRF位置にビームの一方を移動させるための（示されるようにマイクロメータねじを回すことにより）平行移動ステージ（TS）を使用して移動させることができます。 TIRFが確立されると、（ここでは赤で示される光退色または - 活性化のために使用される）第2のビームは、非TIRF対物を残す独立TIRFビームを調整することができモード。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig6.jpg" /> 図6は、照明スポットの中央領域内の電力を測定する。示されたようなイベントは、後に記録される背景を反映して、関心の適当な領域、全体の照明領域（IA）および中央エリア（CA）を、選択しました。 IAおよびCAの記録されたものからバックグラウンド値を減算し、各領域（=積分強度）内に存在する画素数で補正平均強度を乗じて強度を統合します。 CA（：23％この例では）を照射するビームパワーの割合に到達するために、IAのそれによってCAの積分強度を分割します。 5メートル：ここで全体的なビームパワーを（乗算して、CAを照射​​する光のパワーを決定します0.23）：CA（ここでは照明割合はW）。 （：1 / 41.5μmの2ピクセル-1ここ）ピクセル・ツー・エリアサイズ変換係数で：中央領域のサイズを決定するために（7089ピクセルここ）面積を掛けます。 CAを照射励起光の平均電力密度に到達するために、電力分割：（ここで：170.8μmの2）は、CAの大きさ（ここでは1.15 MW）を。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig7.jpg" /> 単一分子信号の図7.定量。（A）SLB上の単一のフルオロフォアの時間経過。関心領域（ROI、イエロー）の7×7画素サイズの領域を定量するための信号の周りに配置されています。バックグラウンドは、隣接する7×7画素から決定されます。ROI（緑）。（B）定量化し、平均ピクセル強度が表示されます。単一分子の信号を決定するために、バックグラウンド値（緑ROI）が1の蛍光体の単一分子強度を時間に対してプロットされた信号値（黄色ROI）から減算し、49（C）で乗算されます。フルオロフォアが漂白の過程にあるよう90ミリ秒の時点が省略されていることに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53158/53158fig8.jpg" /> SLBの完全性を決定するために（FRAP）解析を光退色後蛍光回復8.図。 （A）に示した実験の（A）は、FRAP実験の全ての10番目の画像が表示されているIEK / MCC-アレクサフルオロ647を担持する二重層について実施した。（B）FRAP定量。値は、漂白前の初期強度（I 0）で割った値（A）に示す黄色のROI内の平均強度（I）を示しています。レッドデータポイントは緑色の線は、元の強度の0.9回復を示し、（A）に表示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53158/53158fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

このビデオでは、バイオ機能化された平面支持脂質二重層の作製と特性評価について解説します。また、単一分子検出能を備えた全内部反射顕微鏡の構成について詳細に説明します。さらに、脂質二重層の励起パワー密度、流動性、およびタンパク質密度を測定します。平面ガラス支持脂質二重層に関する短い導入から始めましょう。小型単層小胞が清潔なガラス表面に接触すると、小胞が破裂して広がり、連続した脂質二重層を形成します。水クッション上では、通常、PALM材料を選択します。Ole phosphocholine（POPC）は、室温および37 °Cにおいて流動的な脂質二重層を形成するため、主要な脂質として使用されます。機能化のために、ニッケルキレート頭部を持つ合成脂質であるnickel antioxを添加します。これにより、ポリヒスチジンタグ（poly histamine tag）タンパク質を結合させることができます。例として、共刺激分子B7-1、接着分子ICAM-1、およびここに示すT細胞認識用の蛍光標識ペプチド負荷MHC分子などが挙げられますが、この二重層システムは、原理的に様々な生物学的システムにおける全く異なるプロセスの解析に利用することが可能です。平面システムの特性により、蛍光イベントを全内部反射モードでモニタリングすることができ、これにより細胞の背景光を大幅に低減できるため、単一分子蛍光顕微鏡法に非常に適しています。脂質の調製には、POPCとニッケルアントキサンの脂質、クロロホルム、および清潔な丸底フラスコが必要です。所定の比率で脂質をクロロホルムに溶解し、ここで示すように真空状態で乾燥させます。一晩の高真空処理後、脂質はフラスコの内壁にフィルムを形成します。脂質の再水和には脱気PBSを使用し、乾燥させた脂質混合物に10 mLの脱気PBSを加えます。混ぜないでください。次に、脂質の酸化を防ぐため、フラスコに窒素またはアルゴンなどの不活性ガスを満たし、フラスコを回転させます。脂質は乳白色の懸濁液になります。次のステップでのガス交換を防ぐため、分光光度計のブランクとして少量のサンプルを採取します。脂質懸濁液を含むフラスコを適切に密閉することが非常に重要です。密閉式超音波バスを用いて物理的な形成を行う際、空気から保護するために、オートクレーブテープなどの耐熱性粘着テープを使用してください。フラスコを固定した後、最大出力170 Wでソニケーションを開始します。60分間ソニケーションを行います。物理的な形成により、濁度が大幅に低下しています。これは550 nmでの分光光度計により確認できます。超音波処理前に採取した分注試料をブランクとして使用してください。脂質量を示す230 nmでの吸光度は、一定に保たれる必要があります。ここで、小型超遠心チューブに1 mLの小胞懸濁液を満たし、卓上超遠心機のご定角ローターにセットします。脂質二重層を調製する際は、小型の単層小胞のみを使用することが非常に重要です。超音波処理中に形成される、より大きく密度の高い多層小胞は、二重層の流動性を妨げるため、遠心分離によって沈殿させ、除去する必要があります。まず、室温で 150,000 G で1時間遠心分離します。得られた上清を、さらに4°Cで 288,000 G で8時間遠心分離します。脂質小胞を広げて連続的で流動的な二分子層を形成させるには、ガラススライドを非常に清潔にする必要があります。この操作では、カバーガラスをテフロン製のマウンドに入れ、それをガラス容器に設置します。保護メガネ、保護手袋、および白衣を着用し、化学薬品用キャビネット内で細心の注意を払って作業してください。30%過酸化水素を1部加え、次に濃硫酸を3部加えることで、非常に反応性が高く酸化力の強いペロモノ硫酸を生成させます。この混合物は、皮膚、目、衣類などの有機物と激しく反応します。直ちに発熱します。スライドを30分間インキュベートしてください。ピンセットでカバーガラスを掴みます。きれいなカバーガラスの両面に付着している酸を、蒸留水または高品質の脱イオン水で十分に洗い流します。次に、スライドをテフロン製のスタンドに置き、一度に複数の個別の脂質二重層を作製できるよう、10分以内に乾燥させます。乾燥させたカバーガラスは、速乾性の接着剤で接着します。2液性エポキシ接着剤を使用して、8ウェルまたは16ウェルのLabTechチャンバーに固定します。まず、元のLEPTガラススライドをフレームから慎重に取り除きます。2つの接着剤成分を1:1の比率で混合します。チャンバーフレームの底部の溝に均一に塗布します。きれいなカバーガラスを、接着剤が塗られたチャンバーフレームの底に載せます。ガラススライドとプラスチックフレームの間に接着剤が均一に広がっていることを確認してください。接着剤を30分間硬化させます。脂質物理懸濁液をPBSで10倍に希釈し、0.2 µmのフィルターでろ過します。この希釈液を、8ウェルチャンバーの各ウェルに120 µL、または16ウェルチャンバーの各ウェルに60 µLずつ分注します。ガラス表面全体が覆われていることを確認し、20分間待ちます。これで二層膜が形成されました。残留物を除去するため、各ウェルを30 millilitersのPBSで洗浄します。ガラス表面が空気に触れないように細心の注意を払ってください。空気に触れると、二層膜が即座に破壊されます。次に行うタンパク質修飾ステップに向けて、各ウェルに同一量のバッファーが含まれるようにするため、各ウェルを完全に満たし、液面のドーム状の部分を取り除きます。330 µLを取り出します。これにより、各ウェルに約350 µLが残ります。バイレイヤーをタンパク質で修飾するために、任意のポリヒスチジンタグ付きタンパク質を含むマスターミックスを調製し、各ウェルに50 µLずつ添加します。結果の再現性を確保するため、タンパク質をダークリピッドのニッケル親和性ヘッドグループに結合させます。十分に、かつ慎重に混合し、未結合のタンパク質を除去するために必ず60分間インキュベートしてください。さらに30 mLのPBSで洗浄します。次に、顕微鏡のハードウェアについて説明します。まず、対物レンズを用いたTURF顕微鏡法における全反射照明顕微鏡の要件について説明します。高開口数（NA）の油浸対物レンズが必要です。入射するレーザー励起光はダイクロイックミラーで反射され、2枚または3枚のレンズセットを介して、対物レンズの後焦点面にのみ集光されます。次に、レーザー光がコリメートされたビームとして光軸に沿って対物レンズへと導かれます。これにより、蛍光試料の全深さにわたって照明が行われます。ビームを光軸に対して垂直に移動させると、ビームはコリメート状態を維持したまま、傾いた状態で対物レンズから射出されます。翻訳を続けると、ガラスカバースリップと標本の界面でビームが全反射する臨界角に到達します。その結果生じるエバネッセント波の強度は指数関数的に減衰し、界面から数百ナノメートルの至近距離にある底面の細胞のみが励起されます。ここでは、レーザービームを手動で対物レンズの後焦点面に集光させる方法を説明します。2枚または3枚のレンズを使用し、最初の2枚のレンズでレーザービームの直径を拡大させます。これらのレンズの焦点距離の比によって、試料面における照射スポットの大きさが決定されます。ビームを平行に保つため、これらのレンズ間の距離を両者の焦点距離の和と等しくなるように調整してください。3番目のレンズは、広げられたビームを対物レンズの後焦点面に集光させるために使用されます。このレンズの焦点距離は、顕微鏡本体および付随するペリスコープの寸法に適合させる必要があるため、本ケースではかなり長く、75 cm 程度となります。レンズ2とレンズ3の間の距離は、ビームの特性に影響しません。したがって、その間の無限遠空間を利用することで、歪みなく定義された方法でビームを修正できます。例えば、アパーチャを挿入して試料面に正確に投影させることが可能です。本質的に、3つのレンズではなく2つのレンズを用いることで、同様の結果を得ることができます。2レンズ系は定義が不十分ですが、レンズ収差を少なく抑えられます。絞りのような単純な機能であっても、時間変調のために十分に実装可能です。例えば、ガスレーザー、鉄レーザー、または固体レーザーを、メカニカルシャッターや光学モジュレーターなどのミリ秒範囲のシャッターの前に配置してください。優れた代替案としてダイオードレーザーが挙げられます。これは電子的に変調可能であり、外部シャッターを必要としません。2枚のミラーがあれば、ビームを任意の場所および任意の方向に向けることができます。前述のように、2枚のレンズはビームを拡光し、顕微鏡対物レンズの後焦点面に集光させるために使用されます。光学レール上のペリスコープの下部ミラーを移動させることで、タフ構成のためにビームを転送できます。画像検出には、高感度カメラを使用します。例えば、電子倍増電荷結合素子（em CCD）などが挙げられます。また、異なる波長の2番目のレーザービームをビーム光路内にアライメントすることも可能です。ミラーとダイクロイックフィルターを使用します。2色の同時検出を行うため、放出光路に市販のビームスプリッターを配置します。実験においては、2つの独立した励起光路を設けることが非常に有用です。例えば、1つをターフイメージングに、もう1つを標的部位の光退色または活性化に使用します。これは、一組の50/50ビームスプリッターを実装することで容易に実現できます。図に示すように、2つの異なるレンズおよびミラー調整システムにより、2つの独立したビームプロファイルとビーム角度が得られます。例えば、芝生（ターフ）のイメージング用に広げたものと、非芝生領域での退色または活性化用に絞ったものを使い分けます。非芝生領域のビームにアパーチャを配置することで、退色または活性化スポットを精密に成形できます。さらに、各ビームパスに1つずつ配置された2つのシャッターにより、レーザービームを独立して制御してオン・オフすることができ、対物レンズを傾斜のない直線的なパスに保持できます。パワーメーターの電源を入れ、対応するレーザー波長に調整します。対物レンズにおけるレーザー光の強度を測定し、記録します。次に、顕微鏡背面のミラーを移動させ、対物レンズに向かうレーザービームをターフ位置に傾けます。レーザー光を直接覗き込まないでください。右下には、蛍光タンパク質で修飾された脂質二重層の発光を通じて可視化された、励起レーザーの強度プロファイルが表示されています。ここでは、強度の異なる領域を強調するために擬色表示を用いています。十分な大きさの関心領域（ROI）内で、背景の平均強度を測定します。この値は、EMゲインや読み出し速度などの特定のカメラ設定に依存するため、すべての測定強度から差し引く必要があります。次に、照明が当たっている全領域内の平均強度を決定します。周辺部の強度値がカメラの背景値と同等になる十分に大きな直径を選択し、中心領域の平均強度を測定します。この領域が、後の顕微鏡実験で用いる関心領域（ROI）として定義されます。次に、除外領域と中心領域の両方の強度から、平均背景強度値を差し引きます。次に、背景補正後の強度に領域サイズの対応するピクセル数を掛け合わせ、積分強度を算出します。照射領域の積分強度を1とし、中心領域の分率を計算します。電力はパワーメーターを用いて測定します。本ケースでは、5ミリワットは照射領域全体の積分強度に正比例します。この値に中心領域のパワー分率を乗じて、中心領域内のパワーを決定します。本例では1.15ミリワットとなります。ピクセル数を平方ミクロンに変換するための係数は、カメラチップの実際のピクセルサイズおよびエミッションパスの倍率によって決まります。これはマイクロメーター定規を用いて簡単に決定できます。本例では、中心領域は170.8平方ミクロンに相当します。パワー密度は、測定された電力を面積で割った値であり、したがって1.15ミリワットを170.8平方ミクロンで割った値、すなわち0.007ミリワット/平方ミクロンとなります。これは1平方センチメートルあたり0.7 Kilowattに相当します。脂質二重層の流動性を決定するために、光退色後蛍光回復（FRAP）実験を行います。左下の動画に示すように、低パワー密度で蛍光二重層をイメージングします。右下の動画では、顕微鏡上の対応するラボテクチャンバーを確認できます。次に、短時間の高パワー密度パルスを用いて円形領域を退色させ、低パワー密度での回復をモニタリングします。ここでも、モンタージュによって異なる時点における実験の概要が示されており、0秒時点が退色パルスのタイミングとなります。マークされた円内の背景補正後平均蛍光強度を定量し、すべての測定強度を実験開始時の強度で規格化します。漂白パルスの前に、規格化された強度値を時間に対してプロットします。飽和値は、本ケースにおける移動分率を表しており、90%を超えています。まず、低励起パワー密度で脂質二重層の画像を撮影します。例えば、対数減衰値が2の光学密度フィルターを配置することで、出力を100分の1に低減できます。露光時間は全工程を通じて一定である必要があり、かつ減衰させていない出力密度において単一の流体力をイメージングするのに十分な時間（本例では、0.7 kilowatt per square centimeterで10 milliseconds）に設定してください。擬似カラー表示を用いて、強度の異なる領域を強調してください。後に単分子測定を行う関心領域を1箇所、および同サイズの領域をもう1箇所選択します。背景減算のために、背景減算後の積分強度を算出します。次に、励起光路から光学密度フィルターを取り除き、当該領域を光退色させ、画像を撮影します。脱色領域内で拡散する個々の蛍光分子が観察されます。単一の蛍光分子は回折限界にあり、典型的な直径は2〜3ピクセルです。各単一分子信号の周囲に7×7ピクセルの領域を1つ、およびその近傍に2つ目の領域を設定します。背景減算においては、単一の蛍光分子の信号のみを定量化することが重要です。したがって、タンパク質をBI層上でイメージングする場合、タンパク質に対する比率を1未満にするか、特にSATで標識されたタンパク質を用いることが最適です。例に示したように、タンパク質との比率を1として、両領域の積分強度を測定し、信号からバックグラウンドを差し引きます。露光中に漂白が起こった可能性があるため、例に示した最後に観察されたイベントは採用しないでください。ここでは、9フレームにわたって観察した4つのフルオレセインについて、補正後の信号を算出します。ただし、この手順は少なくとも数百回の単一分子イベントに対して行われる必要があります。減衰させた励起光パワー密度で観察した元のバイレイヤー画像に戻ります。分子密度は、低励起光パワー密度における関心領域の積分強度を100倍して補正し、それを単一分子の平均強度と面積で除することで決定します。ここでは、1平方ミクロンあたり421.4個の蛍光分子という密度を扱っています。この例において、脂質対タンパク質の比率が1である場合、これは1平方ミクロンあたりの分子数と同数になります。このビデオを視聴することで、単分子蛍光顕微鏡を用いて、タンパク質機能化脂質二重層を調製し、その特性評価を行うことができるようになります。さらに、この目的のために標準的な顕微鏡を改造およびアップグレードするための基本原理に習熟しておく必要があります。後ほど、この手法を用いてバイレイヤー結合抗原と細胞結合T細胞受容体の結合キネティクスを決定しますが、これに基づく他にも多くの応用が十分に可能です。

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