平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

このビデオでは、バイオファンクショナルな平面担持脂質バイラールの調製方法と特性評価の方法をご紹介します。また、1分子検出機能を備えた全反射顕微鏡のアーキテクチャについても詳しく説明します。脂質ブレイの励起電力密度、流動性、タンパク質密度を測定します。

簡単な紹介から始めましょう 平面ガラス支持脂質ブレイへ。小さな一層小胞がきれいなガラス表面に遭遇すると、それらは破裂して広がり、連続した脂質二重層を形成します。ウォータークッションでは、通常、手のひらの素材を選びます。

オールホスホコリンまたはPOPCは、室温および摂氏37度で流動的な脂質二重層を生じさせるため、主要な脂質を持っています。官能基化には、ポリヒスタミンタグタンパク質に結合するニッケルキレートヘッド基を持つ合成脂質であるニッケルアンチオックスを添加します。例えば、共刺激分子B seven one、接着分子ICAM分子、および蛍光標識ペプチドをT細胞認識用のMHC分子として示していますが、この二重膜システムは、原則として、さまざまな生体システムにおける全く異なるプロセスに対処するために使用することができます。

平面システムの性質上、蛍光イベントは全反射モードで監視することができ、細胞の背景を大幅に削減し、単一分子蛍光顕微鏡に非常によく適した手です 脂質調製のために、1つは脂質、POPCおよびニッケル抗酸化クロロホルム、およびきれいな丸底フラスコが必要です ここに示すように、所望の比率で脂質を溶解し、クロロホルムで乾燥します。高真空処理を一晩行った後、脂質はフラスコの内側に膜を形成します。脂質の再水和のために、乾燥脂質混合物にデガスPBSの10ミリリットルでデガスPBSを使用してください。

混ぜないでください。次に、脂質の酸化を避けるために、フラスコに窒素やアルゴンなどの不活性ガスを入れます。脂質は乳白色の懸濁液を形成します。

分光光度計のブランクとして小さなサンプルを採取し、次のステップでのガス交換を防ぎます。脂質懸濁液を含むフラスコを適切に密封することが非常に重要です。熱安定性粘着テープ、例えば、密閉された超音波浴を使用して物理的形成中の空気保護を行うオートクレーブテープを使用してください。

フラスコを取り付けた後、最大170ワットの電力で超音波処理手順を開始します。ソニックケイド60分。物理的な形成により、濁度は大幅に低下しました。

これは、550ナノメートルの分光測光法で検証できます。超音波処理前に採取したアリコートをブランクとして使用します。脂質の量を示す230ナノメートルの光学密度は一定に保たれるべきです。

ここでは、小さな超遠心チューブに1ミリリットルのvisl懸濁液を充填し、卓上超遠心分離機の固定角度ローターに入れます。二重層の調製には、小さなuni laina小胞のみを使用することが非常に重要です。超音波処理中にも形成される、より大きく、より密度の高いマルチライナ小胞は、二重層の流動性を妨害し、したがって、青白くし、遠心分離によって除去しなければならない。

まず、室温で150、000Gで1時間回転します。得られたスナットは、次いで、摂氏4度で288, 000Gでさらに8時間遠心分離される。ガラスライトは、脂質小胞がそれらの上に広がって連続した流動的な二重層を形成する前に、非常にきれいでなければなりません。

このために、カバースリップをテフロンマウンドに入れ、それをガラス容器のエクササイズに入れます。目の保護具、保護手袋、白衣、化学キャビネットでの作業には細心の注意を払ってください。30%過酸化水素を1部加え、次に濃硫酸を3部加えて、非常に反応性が高く酸化的なペリオモノ硫酸を生じさせます。

この混合物は、皮膚、目、衣服などの有機物質と激しく反応します。すぐに熱くなります。スライドを30分間インキュベートします。

フォーレットでカバースリップをつかむ W蒸留水または高品質のユニオン水を使用して、きれいなカバースリップの両側の酸を完全に洗い流します。次に、スライドをテフロンスタンドに置き、10分以内に乾燥させて、一度に複数の個別の脂質二重層を生成できるようにします。乾燥したカバースリップを速硬化で接着します。

2液型エポキシ接着剤を8ウェルまたは16ウェルのラボテックチャンバーに接着します。まず、元のレプトガラススライドをフレームから慎重に取り外します。2つの接着剤成分を1対1の比率で混合します。

チャンバーフレームの底部の溝に均等に広げます。クリーンカバースリップを接着剤で覆われたチャンバーフレームの底に置きます。接着剤がスライドガラスとプラスチックフレームの間に均等に広がっていることを確認してください。

接着剤を30分間固めます。脂質物理的懸濁液をPBSで1〜10に希釈し、この希釈液の120マイクロリットルで0.2ミクロンのフィルターで8ウェルチャンバーの各ウェルに、または16ウェルチャンバーの各ウェルに60マイクロリットルでろ過します。ガラス面全体が覆われていることを確認し、20分間待ちます。

二重層が形成されました 残留物を取り除くために lesは、30ミリリットルのPBSで各ウェルをすすぎます。ガラス表面の空気への露出は絶対に避けてください。これにより、二重層が即座に破壊され、各ウェルに同じ量のバッファーが含まれていることを確認します 次のタンパク質装飾ステップでは、各ウェルを完全に満たし、液体ドームを取り除きます。

330マイクロリットルを取り出します。これにより、それぞれに約350マイクロリットルが残ります。ウェル 二重層をタンパク質で飾るために、選択したポリヒスタミンテックタンパク質を含むマスターミックスを準備し、各ウェルに50マイクロリットルを追加します。

タンパク質は暗色脂質のニッケル抗ヘッド基に結合し、再現性のある結果が得られるようにし、完全かつ慎重に混合し、常に60分間インキュベートして未結合のタンパク質を除去します。30ミリリットルのPBSで再度洗浄します。次に、顕微鏡ハードウェアに焦点を当てましょう。

まず、対物レンズベースの芝生顕微鏡のための全反射顕微鏡の要件を説明します。1つは高い開口数が付いている油浸の対物レンズを必要とする。入射したレーザー励起ビームは、ダイクロイックミラーで反射され、2つまたは3つのレンズのセットを介して対物レンズの後部焦点面のみに集束されます。

次に、レーザー光は、光軸に沿ってコーティングされたビームとして対物レンズを導きます。このようにして、蛍光標本はその全深度で照らされます。ビームを光軸に対して垂直に再配置すると、ビームは照合されたままになりますが、傾いて対物レンズから離れます。

トランスロケートを続けると、ある時点で、ガラスカバースリップと試料との間の界面でビームが完全に反射する臨界角に達します。結果として生じるエバネッセント波の強度は指数関数的に減衰し、界面の近接する数百ナノメートルまでのフロア4のみが励起されます。次に、レーザービームを対物レンズの背面焦点面に手動で集束させる方法を示します。

最初の2つのレンズと3つまたは2つのレンズを使用すると、レーザービームの直径が大きくなります。それらの焦点距離の比率は、試料平面の照明スポットのサイズを決定します。ビームが照合されたままになるようにするには、これらのレンズ間の距離を調整して、両方の焦点距離の合計と等しくなります。

3 番目のレンズは、ワイド ビームを対物レンズの後焦点面に集束するために使用されます。このレンズの焦点距離は、顕微鏡本体の寸法と関連する潜望鏡の寸法に対応する必要があるため、私たちの場合ははるかに長くする必要があり、75センチメートルによって異なります。レンズ2とレンズ3の間の距離は、ビーム特性に影響を与えません。

したがって、その間の無限大空間を使用して、歪みなく定義された方法でビームを変更できます。例えば、アパーチャーを挿入し、試料平面に正確に投影することができます。要するに、レンズを3つではなく2つ使用しても同じことを実現できます。

2 レンズ システムはあまり明確ではありませんが、レンズ収差は少なくなります。アパーチャなどの単純な機能は、テンポラルモジュレーションにはまだ非常にうまく実装できます。ガス、鉄、または固体レーザーは、メカニカルシャッターやアルミ光変調器などのミリ秒範囲シャッターの前に配置する必要があります。

良い代替手段は、電子的に変調でき、外部からのシャットダウンを必要としないダイオードレーザーです。2つのミラーで、ビームを任意の場所、任意の方向に向けるのに十分です。前に説明したように、2つのレンズはビームを広げ、顕微鏡の後焦点面に焦点を合わせるために使用されます。目的。

ビームを芝生用に移動させるには、ペリスコープの下部ミラーを光学レール上で移動させます。画像検出には、高感度カメラを使用しています。例えば、電子増倍電荷結合デバイスや、異なる波長のem CCDAセカンドレーザービームをビームパスに整列させることができます。

ミラーとダイクロイックオーバーレイを使用して。2色同時検出のためには、市販のビーム分割装置を発光路に設置します。実験では、2つの独立した励起ビームパスを用意すると非常に便利です。

たとえば、1つは芝のイメージング用、もう1つはターゲット光退色または活性化用です。これは、2 50 50ビームスプリッターのセットを実装することで簡単に実現できます。この図に示すように、2つの異なるレンズとミラーの調整システムにより、2つの個別のビームプロファイルとビーム角度が生じます。

たとえば、芝でのイメージング用に幅を広げたものや、非芝での漂白や活性化に焦点を絞ったものなどです。開口部を非芝ビームに配置して、漂白または活性化スポットを正確に成形することができます。2つの追加シャッター(各ビームパスに1つ) レーザービームの独立した制御スイッチを有効にし、対物レンズを傾けない直線のパスに残します。

パワーメーターの電源を入れ、対応するレーザー波長に調整します。対物レンズでのレーザー光のパワーを測定し、それを書き留めます。次に、ミラーを顕微鏡の後ろに移動して、対物レンズのレーザービームを芝の位置に傾けます。

レーザー光を直接見ないでください。右下隅には、蛍光タンパク質で装飾された二重膜の発光を通じて視覚化された励起レーザーの強度プロファイルが表示されています。ここでは、偽色表現を使用して、強度の異なる領域を強調表示します。

十分な大きさの関心領域内の背景の平均強度を測定します。この値は、EMゲインや読み出し速度などの特定のカメラ設定に依存し、測定されたすべての強度から差し引く必要があります。照らされた領域全体の平均強度を決定します。

周辺部の強度値がカメラの背景の強度値と等しくなるように、十分に大きい直径を選択し、中央領域の平均強度を測定します。この領域は、後で顕微鏡実験を行う関心領域を定義します。次に、除去された領域と中央領域の両方の強度から、平均背景強度値を差し引きます。

次に、背景補正された強度と領域サイズの対応するピクセル番号を掛けて、統合された強度を求めます。照らされた領域の積分強度を 1 に設定し、中央領域の分数を計算します。パワーメーターで測定された電力。

私たちの場合、5ミリワットは、照らされた領域全体の積分強度に正比例します。この値に中央領域の累乗率を掛けて、中央領域内の電力を決定します。この例では 1.15 ミリワットで、ピクセル数を正方形ミクロンに変換する係数は、カメラ チップの実際のピクセル サイズと発光経路の倍率によって異なります。

マイクロメータスライドで簡単に測定できます。この例では、中央の面積は 170.8 平方ミクロンに相当します。電力密度は、測定された電力を面積で割ったものを指すため、1.15ミリワットを170.8平方ミクロンで割った値、つまり0.007ミリワット/平方ミクロンに等しくなります。

これは、0.7キロワット/平方センチメートルです。二重膜の流動性を決定するために、ラップの光退色実験後に蛍光回復を行います。左下の動画に示すように、蛍光二重膜を低電力密度で結像しています。

右下の動画では、顕微鏡上の対応するラボテックチャンバーを見ることができます。次に、短い高電力密度パルスで円形領域を漂白し、低電力密度での回復を監視します。ここでも、モンタージュは漂白剤パルスのゼロ時間であるさまざまな時点の実験の概要を提供します。

マークサークル内の平均バックグラウンド補正蛍光強度を定量化し、測定されたすべての強度を実験開始時の強度に正規化します。漂白剤パルスの前に、正規化された強度値を時間に対してプロットします。飽和値は、90%を超える場合のモバイルフラクションを表しますまず、低励起電力密度でのバイレイヤーの画像を撮ります。

たとえば、対数減衰値が 2 の光学密度フィルターを配置すると、電力が 100 倍に減少します。露光時間は、手順全体を通じて一定であり、この場合、減衰しない電力密度(0.7キロワット/平方センチメートルで10ミリ秒)で単一の流体力を画像化するのに十分である必要があります。疑似カラー表現を使用して、強度の異なる領域を強調表示します。

後で単一分子測定を行う対象領域を1つ選択し、同じサイズの領域を1つ選択します。バックグラウンド減算の場合は、バックグラウンド減算積分強度を計算します。次に、励起ビーム経路から光学密度フィルターを取り外し、領域を漂白して画像を撮ります。

漂白された領域に個々のインフルエンザの力が拡散しているのがわかります。単一のインフルエンザの力は、2〜3ピクセルの典型的な直径で回折が制限されており、各単一分子シグナルの周りの7×7ピクセルの1つの領域と近くの2番目の領域を取ります。バックグラウンド減算では、単一のFluorフォースのシグナルのみを定量することが重要です。

したがって、BI層上のタンパク質は、aとタンパク質の比率が1未満、またはSATで特異的に標識されたタンパク質をイメージングするのが最善です。私たちの例に示すように、さらに食事とタンパク質の比率が1で、両方の領域の積分強度を測定し、信号からバックグラウンドを差し引いて、私たちの例で示された最後の観察されたイベントを取らないようにします。ここで修正された信号は、4つのインフルエンザのうちの1つに対してこれを行い、9フレームにわたって観察します。

ただし、この手順は、少なくとも数百の単一分子イベントに対して実行する必要があります。減衰した励起電力密度で観察された元の二層画像に戻りましょう。分子密度は、100を掛けて低励起電力密度の関心領域の積分強度を補正し、それを平均単一分子強度と面積で割ることによって決定されます。

私たちは、平方ミクロンあたり421.4のフッ素力の密度を扱っています。この例では、食事とタンパク質の比率が1の場合、これは1平方ミクロンあたりの分子数に等しくなります。このビデオを見た後、1分子蛍光顕微鏡を使用してタンパク質官能基脂質二重層を調製し、特性評価することができるはずです。

さらに、この目的のために標準的な顕微鏡を変更およびアップグレードするための基本原則に精通している必要があります。この方法論は、後にこの方法論を使用して、細胞結合T細胞受容体への二重層結合抗原の結合速度を決定しますが、これに基づく他の多くのアプリケーションは確かに実行可能です。