平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

このビデオでは、バイオ機能化された平面支持脂質二重層の作製と特性評価について解説します。また、単一分子検出能を備えた全内部反射顕微鏡の構成について詳細に説明します。さらに、脂質二重層の励起パワー密度、流動性、およびタンパク質密度を測定します。

平面ガラス支持脂質二重層に関する短い導入から始めましょう。小型単層小胞が清潔なガラス表面に接触すると、小胞が破裂して広がり、連続した脂質二重層を形成します。水クッション上では、通常、PALM材料を選択します。

Ole phosphocholine（POPC）は、室温および37 °Cにおいて流動的な脂質二重層を形成するため、主要な脂質として使用されます。機能化のために、ニッケルキレート頭部を持つ合成脂質であるnickel antioxを添加します。これにより、ポリヒスチジンタグ（poly histamine tag）タンパク質を結合させることができます。例として、共刺激分子B7-1、接着分子ICAM-1、およびここに示すT細胞認識用の蛍光標識ペプチド負荷MHC分子などが挙げられますが、この二重層システムは、原理的に様々な生物学的システムにおける全く異なるプロセスの解析に利用することが可能です。

平面システムの特性により、蛍光イベントを全内部反射モードでモニタリングすることができ、これにより細胞の背景光を大幅に低減できるため、単一分子蛍光顕微鏡法に非常に適しています。脂質の調製には、POPCとニッケルアントキサンの脂質、クロロホルム、および清潔な丸底フラスコが必要です。所定の比率で脂質をクロロホルムに溶解し、ここで示すように真空状態で乾燥させます。一晩の高真空処理後、脂質はフラスコの内壁にフィルムを形成します。脂質の再水和には脱気PBSを使用し、乾燥させた脂質混合物に10 mLの脱気PBSを加えます。

混ぜないでください。次に、脂質の酸化を防ぐため、フラスコに窒素またはアルゴンなどの不活性ガスを満たし、フラスコを回転させます。脂質は乳白色の懸濁液になります。

次のステップでのガス交換を防ぐため、分光光度計のブランクとして少量のサンプルを採取します。脂質懸濁液を含むフラスコを適切に密閉することが非常に重要です。密閉式超音波バスを用いて物理的な形成を行う際、空気から保護するために、オートクレーブテープなどの耐熱性粘着テープを使用してください。

フラスコを固定した後、最大出力170 Wでソニケーションを開始します。60分間ソニケーションを行います。物理的な形成により、濁度が大幅に低下しています。

これは550 nmでの分光光度計により確認できます。超音波処理前に採取した分注試料をブランクとして使用してください。脂質量を示す230 nmでの吸光度は、一定に保たれる必要があります。

ここで、小型超遠心チューブに1 mLの小胞懸濁液を満たし、卓上超遠心機のご定角ローターにセットします。脂質二重層を調製する際は、小型の単層小胞のみを使用することが非常に重要です。超音波処理中に形成される、より大きく密度の高い多層小胞は、二重層の流動性を妨げるため、遠心分離によって沈殿させ、除去する必要があります。

まず、室温で 150,000 G で1時間遠心分離します。得られた上清を、さらに4°Cで 288,000 G で8時間遠心分離します。脂質小胞を広げて連続的で流動的な二分子層を形成させるには、ガラススライドを非常に清潔にする必要があります。

この操作では、カバーガラスをテフロン製のマウンドに入れ、それをガラス容器に設置します。保護メガネ、保護手袋、および白衣を着用し、化学薬品用キャビネット内で細心の注意を払って作業してください。30%過酸化水素を1部加え、次に濃硫酸を3部加えることで、非常に反応性が高く酸化力の強いペロモノ硫酸を生成させます。

この混合物は、皮膚、目、衣類などの有機物と激しく反応します。直ちに発熱します。スライドを30分間インキュベートしてください。

ピンセットでカバーガラスを掴みます。きれいなカバーガラスの両面に付着している酸を、蒸留水または高品質の脱イオン水で十分に洗い流します。次に、スライドをテフロン製のスタンドに置き、一度に複数の個別の脂質二重層を作製できるよう、10分以内に乾燥させます。乾燥させたカバーガラスは、速乾性の接着剤で接着します。

2液性エポキシ接着剤を使用して、8ウェルまたは16ウェルのLabTechチャンバーに固定します。まず、元のLEPTガラススライドをフレームから慎重に取り除きます。2つの接着剤成分を1:1の比率で混合します。

チャンバーフレームの底部の溝に均一に塗布します。きれいなカバーガラスを、接着剤が塗られたチャンバーフレームの底に載せます。ガラススライドとプラスチックフレームの間に接着剤が均一に広がっていることを確認してください。

接着剤を30分間硬化させます。脂質物理懸濁液をPBSで10倍に希釈し、0.2 µmのフィルターでろ過します。この希釈液を、8ウェルチャンバーの各ウェルに120 µL、または16ウェルチャンバーの各ウェルに60 µLずつ分注します。ガラス表面全体が覆われていることを確認し、20分間待ちます。

これで二層膜が形成されました。残留物を除去するため、各ウェルを30 millilitersのPBSで洗浄します。ガラス表面が空気に触れないように細心の注意を払ってください。空気に触れると、二層膜が即座に破壊されます。次に行うタンパク質修飾ステップに向けて、各ウェルに同一量のバッファーが含まれるようにするため、各ウェルを完全に満たし、液面のドーム状の部分を取り除きます。

330 µLを取り出します。これにより、各ウェルに約350 µLが残ります。バイレイヤーをタンパク質で修飾するために、任意のポリヒスチジンタグ付きタンパク質を含むマスターミックスを調製し、各ウェルに50 µLずつ添加します。

結果の再現性を確保するため、タンパク質をダークリピッドのニッケル親和性ヘッドグループに結合させます。十分に、かつ慎重に混合し、未結合のタンパク質を除去するために必ず60分間インキュベートしてください。さらに30 mLのPBSで洗浄します。次に、顕微鏡のハードウェアについて説明します。

まず、対物レンズを用いたTURF顕微鏡法における全反射照明顕微鏡の要件について説明します。高開口数（NA）の油浸対物レンズが必要です。入射するレーザー励起光はダイクロイックミラーで反射され、2枚または3枚のレンズセットを介して、対物レンズの後焦点面にのみ集光されます。

次に、レーザー光がコリメートされたビームとして光軸に沿って対物レンズへと導かれます。これにより、蛍光試料の全深さにわたって照明が行われます。ビームを光軸に対して垂直に移動させると、ビームはコリメート状態を維持したまま、傾いた状態で対物レンズから射出されます。

翻訳を続けると、ガラスカバースリップと標本の界面でビームが全反射する臨界角に到達します。その結果生じるエバネッセント波の強度は指数関数的に減衰し、界面から数百ナノメートルの至近距離にある底面の細胞のみが励起されます。ここでは、レーザービームを手動で対物レンズの後焦点面に集光させる方法を説明します。

2枚または3枚のレンズを使用し、最初の2枚のレンズでレーザービームの直径を拡大させます。これらのレンズの焦点距離の比によって、試料面における照射スポットの大きさが決定されます。ビームを平行に保つため、これらのレンズ間の距離を両者の焦点距離の和と等しくなるように調整してください。

3番目のレンズは、広げられたビームを対物レンズの後焦点面に集光させるために使用されます。このレンズの焦点距離は、顕微鏡本体および付随するペリスコープの寸法に適合させる必要があるため、本ケースではかなり長く、75 cm 程度となります。レンズ2とレンズ3の間の距離は、ビームの特性に影響しません。

したがって、その間の無限遠空間を利用することで、歪みなく定義された方法でビームを修正できます。例えば、アパーチャを挿入して試料面に正確に投影させることが可能です。本質的に、3つのレンズではなく2つのレンズを用いることで、同様の結果を得ることができます。

2レンズ系は定義が不十分ですが、レンズ収差を少なく抑えられます。絞りのような単純な機能であっても、時間変調のために十分に実装可能です。例えば、ガスレーザー、鉄レーザー、または固体レーザーを、メカニカルシャッターや光学モジュレーターなどのミリ秒範囲のシャッターの前に配置してください。

優れた代替案としてダイオードレーザーが挙げられます。これは電子的に変調可能であり、外部シャッターを必要としません。2枚のミラーがあれば、ビームを任意の場所および任意の方向に向けることができます。前述のように、2枚のレンズはビームを拡光し、顕微鏡対物レンズの後焦点面に集光させるために使用されます。

光学レール上のペリスコープの下部ミラーを移動させることで、タフ構成のためにビームを転送できます。画像検出には、高感度カメラを使用します。例えば、電子倍増電荷結合素子（em CCD）などが挙げられます。また、異なる波長の2番目のレーザービームをビーム光路内にアライメントすることも可能です。

ミラーとダイクロイックフィルターを使用します。2色の同時検出を行うため、放出光路に市販のビームスプリッターを配置します。実験においては、2つの独立した励起光路を設けることが非常に有用です。

例えば、1つをターフイメージングに、もう1つを標的部位の光退色または活性化に使用します。これは、一組の50/50ビームスプリッターを実装することで容易に実現できます。図に示すように、2つの異なるレンズおよびミラー調整システムにより、2つの独立したビームプロファイルとビーム角度が得られます。

例えば、芝生（ターフ）のイメージング用に広げたものと、非芝生領域での退色または活性化用に絞ったものを使い分けます。非芝生領域のビームにアパーチャを配置することで、退色または活性化スポットを精密に成形できます。さらに、各ビームパスに1つずつ配置された2つのシャッターにより、レーザービームを独立して制御してオン・オフすることができ、対物レンズを傾斜のない直線的なパスに保持できます。

パワーメーターの電源を入れ、対応するレーザー波長に調整します。対物レンズにおけるレーザー光の強度を測定し、記録します。次に、顕微鏡背面のミラーを移動させ、対物レンズに向かうレーザービームをターフ位置に傾けます。

レーザー光を直接覗き込まないでください。右下には、蛍光タンパク質で修飾された脂質二重層の発光を通じて可視化された、励起レーザーの強度プロファイルが表示されています。ここでは、強度の異なる領域を強調するために擬色表示を用いています。

十分な大きさの関心領域（ROI）内で、背景の平均強度を測定します。この値は、EMゲインや読み出し速度などの特定のカメラ設定に依存するため、すべての測定強度から差し引く必要があります。次に、照明が当たっている全領域内の平均強度を決定します。

周辺部の強度値がカメラの背景値と同等になる十分に大きな直径を選択し、中心領域の平均強度を測定します。この領域が、後の顕微鏡実験で用いる関心領域（ROI）として定義されます。次に、除外領域と中心領域の両方の強度から、平均背景強度値を差し引きます。

次に、背景補正後の強度に領域サイズの対応するピクセル数を掛け合わせ、積分強度を算出します。照射領域の積分強度を1とし、中心領域の分率を計算します。電力はパワーメーターを用いて測定します。

本ケースでは、5ミリワットは照射領域全体の積分強度に正比例します。この値に中心領域のパワー分率を乗じて、中心領域内のパワーを決定します。本例では1.15ミリワットとなります。ピクセル数を平方ミクロンに変換するための係数は、カメラチップの実際のピクセルサイズおよびエミッションパスの倍率によって決まります。

これはマイクロメーター定規を用いて簡単に決定できます。本例では、中心領域は170.8平方ミクロンに相当します。パワー密度は、測定された電力を面積で割った値であり、したがって1.15ミリワットを170.8平方ミクロンで割った値、すなわち0.007ミリワット/平方ミクロンとなります。

これは1平方センチメートルあたり0.7 Kilowattに相当します。脂質二重層の流動性を決定するために、光退色後蛍光回復（FRAP）実験を行います。左下の動画に示すように、低パワー密度で蛍光二重層をイメージングします。

右下の動画では、顕微鏡上の対応するラボテクチャンバーを確認できます。次に、短時間の高パワー密度パルスを用いて円形領域を退色させ、低パワー密度での回復をモニタリングします。ここでも、モンタージュによって異なる時点における実験の概要が示されており、0秒時点が退色パルスのタイミングとなります。

マークされた円内の背景補正後平均蛍光強度を定量し、すべての測定強度を実験開始時の強度で規格化します。漂白パルスの前に、規格化された強度値を時間に対してプロットします。飽和値は、本ケースにおける移動分率を表しており、90%を超えています。まず、低励起パワー密度で脂質二重層の画像を撮影します。

例えば、対数減衰値が2の光学密度フィルターを配置することで、出力を100分の1に低減できます。露光時間は全工程を通じて一定である必要があり、かつ減衰させていない出力密度において単一の流体力をイメージングするのに十分な時間（本例では、0.7 kilowatt per square centimeterで10 milliseconds）に設定してください。擬似カラー表示を用いて、強度の異なる領域を強調してください。

後に単分子測定を行う関心領域を1箇所、および同サイズの領域をもう1箇所選択します。背景減算のために、背景減算後の積分強度を算出します。次に、励起光路から光学密度フィルターを取り除き、当該領域を光退色させ、画像を撮影します。

脱色領域内で拡散する個々の蛍光分子が観察されます。単一の蛍光分子は回折限界にあり、典型的な直径は2〜3ピクセルです。各単一分子信号の周囲に7×7ピクセルの領域を1つ、およびその近傍に2つ目の領域を設定します。背景減算においては、単一の蛍光分子の信号のみを定量化することが重要です。

したがって、タンパク質をBI層上でイメージングする場合、タンパク質に対する比率を1未満にするか、特にSATで標識されたタンパク質を用いることが最適です。例に示したように、タンパク質との比率を1として、両領域の積分強度を測定し、信号からバックグラウンドを差し引きます。露光中に漂白が起こった可能性があるため、例に示した最後に観察されたイベントは採用しないでください。ここでは、9フレームにわたって観察した4つのフルオレセインについて、補正後の信号を算出します。

ただし、この手順は少なくとも数百回の単一分子イベントに対して行われる必要があります。減衰させた励起光パワー密度で観察した元のバイレイヤー画像に戻ります。分子密度は、低励起光パワー密度における関心領域の積分強度を100倍して補正し、それを単一分子の平均強度と面積で除することで決定します。

ここでは、1平方ミクロンあたり421.4個の蛍光分子という密度を扱っています。この例において、脂質対タンパク質の比率が1である場合、これは1平方ミクロンあたりの分子数と同数になります。このビデオを視聴することで、単分子蛍光顕微鏡を用いて、タンパク質機能化脂質二重層を調製し、その特性評価を行うことができるようになります。

さらに、この目的のために標準的な顕微鏡を改造およびアップグレードするための基本原理に習熟しておく必要があります。後ほど、この手法を用いてバイレイヤー結合抗原と細胞結合T細胞受容体の結合キネティクスを決定しますが、これに基づく他にも多くの応用が十分に可能です。