蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

この手順の全体的な目標は、細胞遊走を研究するための接着性および可溶性の勾配を作成することです。これは、まず、非特異的な細胞接着を防ぐための表面である不動態化によって達成されます。2番目のステップは、マイクロコンタクト印刷からスタンプを製造することです。

次に、マイクロコンタクト印刷により、溶連菌の熱線で表面をパターン化します。ストラップ付きディンは、マイクロ流体デバイスの底部に取り付けられたディップペンリソグラフィーを使用してドットとして印刷することもできます。改質された表面は、ビオチンRGDの接着勾配の基礎として機能します。

最後のステップは、可溶性化学療法誘引剤勾配の存在下で、接着剤の手がかりで細胞を表面にロードすることです。最終的に、生細胞顕微鏡法を使用して、接着性および可溶性の両方の手がかりに応答した細胞移動を示します。トランズウェルやボイドチャンバーアッセイ、従来のマイクロ流体セットアップなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、表面パターンの崩壊したシステムであるマイクロ流体デバイスにより、空間的に制御された接着剤の手がかりと接着剤の勾配、および可溶性勾配に対する細胞の応答を同時に観察できることです。

さて、この方法は、細胞接着の重要性や、キナーゼGタンパク質共役受容体などのケモテキサス受容体とRINのような接着受容体との間の脳卒中を引き起こすなど、細胞移動分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、カバースリップを100%エタノールのラックに沈め、ラックをソンスケートウォーターバスに30分間入れて清掃します。ガラスカバーのスリップを空気中で乾かします。

次に、ガラスカバーを1モルの水酸化ナトリウムで30分間スリップします。その後、1リットル半のミリキューブ水で満たされたビーカーでラックを慎重に傾けて、ガラス表面をすすぎます。毎回、新鮮なミリキューブ水を使用してすすぎプロセスを3回繰り返します。

3回目のすすぎ乾燥後、ガラスカバーを摂氏60度のオーブンで約30分間滑ります。きれいなガラスカバースリップの半分を、部分的に水で満たされた24ウェルプレートで作られた湿ったチャンバーに個別に置きます。井戸は水で満たされ、ガラスカバースリップはイオンのために井戸の上に敷かれ、ポリリジンとポリエチレングリコールの共重合体が使用され、ペグ分子の20%がビオチンにグラフト化されています。

PLL Peg biotin と略され、各ガラスカバースリップにPBS中の15マイクロリットルのPLL Pegビオチンを滴下します。残りのきれいなガラスカバースリップの残りの半分を取り、PEG溶液を慎重に挟みます。カバースリップを湿気の多いチャンバーに1時間放置します。

1時間のスライド後、挟まれたカバーは、PEGコーティングされた表面をこすり落とすことなく、互いにゆっくりと滑り落ち、UE水ですすいでください。水はペグ処理された側で簡単に滑り落ちるはずです。必要に応じて。

ガラスカバーをペーパータオルに滑り込ませ、処理面を上に向けて風乾します。ガラスカバーは真空中で滑り落ち、さらに使用するまで乾燥させます。この作業に必要なシリコンマスターは、フォトリソグラフィーにより、PDMSエラストマー用のA-P-D-M-Sスタンプをシャーレ内のシリコンマスターに高さ約1cmまで鋳造し、マスターとPDMSの混合物を70°Cのオーブンで1時間硬化させます。

その後、PDMSスタンプをシリコンマスターから取り出し、マイクロコンタクト印刷技術を用いてタンパク質パターンを印刷するためのサイズにカットし、まずクリーニングを行い、オゾン処理場所の直後にパターン面をUVおよびオゾンクリーナーで処理することにより、PDMSスタンプをより親水性にします。そして、10マイクロリットルの剥がされたアディンをPDMSスタンプに広げます。蛍光顕微鏡で足跡が見えるようにするには、stripped avidやLOR three 50など、fluoro fourに結合したstripped Adenを使用します。

湿気の多い部屋に1時間放置します。スタンプから余分な連鎖球菌を取り除きます ティッシュペーパー、紙、空気で。スタンプを約1分間乾燥させます。

PLLペグビオチンコーティングガラスカバースリップにスタンプを軽く押し込みます。蛍光連鎖球菌Dinを使用した場合は、エピ蛍光顕微鏡でパターンを調べます。タンパク質パターンは、ディップペンリソグラフィーを使用して印刷することもできます。

まず、1ミリリットルあたり1ミリグラムの1部を混合し、ストリピンまたはストリップしたアビダンエリフフルーア3 50をグリセロールの10部と混合し、カンチレバーに混合物の5マイクロリットルをロードします。印刷速度を調整します。表面上のカンチレバーの接触時間、またはスポットサイズを小さくするためのカンチレバーの表面への垂直距離。

約5マイクロメートルで、ディップペンリソグラフィー機器店の取扱説明書に記載されているように印刷プロセスが開始されます。すべての印刷面は乾燥します。市販のマイクロ流体デバイスを使用して、表面の勾配を作成します。

このトリチウムコーティングまたはパターン化されたガラスカバーをデバイスの粘着性のある面に貼り付けて、数時間漏れがないことを確認します。デバイスの端を、温めたワセリンの薄層と、ワセリン1部とパラフィンワックス1部の混合物の2番目の層で密封します。デバイスのチャネルに6マイクロリットルのPBSを充填して、2つの対向する勾配を作成します。

2つのリザーバー(1つは70マイクロリットルのビオチン、4つのフルオレセイン、もう1つはビオチン化ペプチドアルギニングリシンスパギン酸またはRGDに結合した70マイクロリットルのビオチン)で満たし、サンプルを室温で1時間暗所でインキュベートします。マイクロ流体デバイスのビオチン、RGD、ビオチンフィットのすすぎは、気泡を閉じ込めてマイクロコンタクトプリントされたトラックを乱すリスクがあるため、この手順の最も難しい側面です。成功を確実にするためには、ビオチンとPBSを慎重かつゆっくりと除去する必要があります。

ビオチン溶液を取り出し、マイクロ流体デバイスに付着したまま、PBSで表面を2回慎重にすすぎます。蛍光標識細胞をマイクロ流体デバイスにロードする前に、接着勾配の方向をマークします。セルを数え、セル番号が等しい2つのチューブに分割します。

洗って再診します。10%FBS洗浄液を使用した低グルコースDMEMや培地中の細胞のもう1つのチューブなど、化学療法誘引剤を含む培地で細胞の1つのチューブを懸濁します。0%FBSのDMEMのような化学療法誘引剤を使用しない場合、各チューブ内の細胞の最終濃度は、1ミリリットルあたり5番目の細胞の10の5倍になるはずです。

マイクロ流体デバイスからすべての溶液を取り出し、予温顕微鏡に置きます。ステージは、70マイクロリットルの細胞を0%F-B-S-D-M-E-Mに再懸濁して1つのリザーバーにロードします。70マイクロリットルの細胞を10%F-B-S-D-M-E-Mに再懸濁して別のリザーバーにロードします。

蒸発を防ぐために、リザーバーにゆるくテープを貼ります。マイクロ流体デバイスのチャネルが視野内にあり、細胞に焦点が合っていることを確認します。露光時間や蛍光フィルターなどの画像取得パラメータを選択します。

細胞や追跡する明視野や蛍光の画像配列、時間点、記録長などにより、画像取得プログラムが開始されます。このビデオでは、競合する接着性および可溶性の勾配を持つ環境で移動する細胞のライブセルイメージングの方法を示しています。蛍光ストリピンとビオチン化RGDを含む接着トラックは、マイクロコンタクト印刷またはディップペンリソグラフィーで作成されました。

マイクロコンタクトプリンティングの成功は、粘着トラックと防汚領域を明確に区別できるトラック全体の蛍光強度のラインプロファイルによって示されます。ディップペンリソグラフィーで印刷されたドットは、裂け目ではなく丸みを帯びて表示され、印刷プロセスが成功したことを示しています。この例では、ドットは行と列の間隔が 10 から 15 マイクロメートルに設定された行に印刷されています。

この距離は、ドットが互いにマージされるのを防ぐのに十分ですが、1 つの視野で複数のドットを表示することができます。ほとんどの顕微鏡設定では、プリントされたトラック上の接着キューのGradyは、シンプルなマイクロ流体デバイスを使用して作成されました。ビオチン4フルオレセインとビオチンRGDをマイクロ流体チャンバーパネルの反対側にロードします。

Aは、画像総長3072マイクロメートルで撮影された60枚のモザイク画像を示しています。パネルBでは、蛍光強度をモザイク全体の長さにわたって測定しました。線形トレンドラインを蛍光強度に当てはめて、チャネル内のRGD勾配を示しました。

ビオチン、ビオチンRGD溶液を除去した後、同じチャンバーを使用して可溶性グラジエントを導入できます。パネルAは、PBSおよびフルオレセイン充填リザーバーの近く、およびTがゼロに等しいチャネル全体のフルオレセイン色素の蛍光強度を示しています。パネルBは、可溶性手がかりの蛍光強度を示しています。

16時間のインキュベーション後、同等の結果は、グラジエントが少なくとも16時間安定していたことを示しています。彼は、この方法を使用して、反対の勾配を持つマイクロ流体チャンバー内の細胞移動を観察し、代表的な動画をここに示します。接着勾配は連鎖球菌アビダントラックに固定化RGDされ、可溶性勾配はゼロから10%FBSでした。

画像は15分ごとに合計20時間撮影されました。表示される画像遷移は 8 フレーム/秒です。この2番目の動画は、1つのヘリセルがFBSソースに向かって移動する様子です。

表示される画像遷移は 8 フレーム/秒です。細胞の軌跡を表す青い線は、細胞追跡ソフトウェアを介して取得されました。この最後の図は、最初の動画の画像からの細胞の軌跡を示しています。

高濃度の可溶性FPSに向かって移動した細胞の軌跡は、高濃度の接着性RGDに向かって移動した赤血球の軌跡を黒で示しています。これらの軌跡は、高濃度の付着性RGDよりも、より多くのhela細胞が化学療法誘引剤の供給源に向かって移動したことを示しました。この手順を試みることは重要ですが、接着勾配の準備およびライフスタイルイメージング中にマイクロ流体デバイス内のPBSまたは媒体が蒸発しないように覚えておくことが重要ですが、必要に応じて粘着テープを使用してマイクロ流体デバイスのすべての入口を覆いますこの手順に従います。

トランスフェクションやハイブリッド溶液顕微鏡などの他の方法を実施して、タンパク質が作用する細胞骨格の生体力学、細胞遊走中の局所接着タンパク質、受容体などの追加の質問に答えることができます。