蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

この手順の全体的な目的は、細胞遊走を研究するための接着性および可溶性のグラジエントを作成することです。これはまず、非特異的な細胞接着を防ぐために表面をパッシベーションすることによって達成されます。次のステップでは、マイクロコンタクトプリンティングを用いてスタンプを作製します。

次に、マイクロコンタクトプリント法により、処理された表面にストレプトアビジン線を描画します。また、ディップペンリソグラフィーを用いて、マイクロ流体デバイスの底面にストレプトアビジンをドット状にプリントすることも可能です。このように修飾された表面は、ビオチンRGDの接着勾配を形成するための基盤として機能します。

最終ステップは、可溶性化学誘引物質の勾配が存在する状態で、接着性キューを有する表面に細胞を播種することです。最終的に、生細胞顕微鏡を用いて、接着性および可溶性の両方のキューに応答した細胞遊走を観察します。トランスウェル法やボイドチャンバーアッセイ、あるいは従来のマイクロ流体デバイスなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、表面パターニングを統合したマイクロ流体デバイスを用いることで、空間的に制御された接着性キュー、接着勾配、および可溶性勾配に対する細胞の応答を同時に観察できる点にあります。

この手法は、細胞接着の重要性や、受容体チロシンキナーゼ、Gタンパク質共役受容体、およびインテグリンのような接着受容体といった化学走性受容体間のクロストークなど、細胞遊走分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、カバーガラスをラックに入れ、100% ethanolに浸し、そのラックを超音波洗浄機に30分間入れて洗浄します。その後、ガラスカバーガラスを風乾させます。

次に、ガラスカバースリップを1 Mの水酸化ナトリウム中で30分間超音波処理します。その後、1.5 LのMilli-Q水で満たしたビーカーにラックを慎重に傾けて、ガラス表面を洗浄します。この洗浄工程を、毎回新しいMilli-Q水を用いて3回繰り返します。

3回目の洗浄後、ガラスカバースリップを60 °Cのオーブンで約30分間乾燥させます。洗浄済みのガラスカバースリップの半分を、水を部分的に満たした24ウェルプレートで作られた加湿チャンバーに個別に配置します。ウェルに水を満たし、その上にガラスカバースリップを置いて固定します。ポリリシンとポリエチレングリコールの共重合体を使用し、そのPEG分子の20%がビオチンにグラフトされています。

PLL Peg biotin（略称）のPBS溶液を、各ガラスカバースリップに15 µLずつ滴下します。残りの清潔なガラスカバースリップの半分を用い、PEG溶液を慎重にサンドイッチします。カバースリップを加湿チャンバー内で1時間放置します。

1時間後、挟み込まれたカバーガラス同士を、PEGコーティングされた表面をこすらないようにゆっくりと滑らせて離し、超純水で洗浄します。PEG処理された側では、水が容易に流れ落ちるはずです。必要に応じて洗浄を行ってください。

処理した面を上にして、ガラスカバースリップをペーパータオル上で風乾させます。その後、次回の使用時まで真空デシケーター内でガラスカバースリップを保管してください。本手順で使用するシリコンマスターはフォトリソグラフィーによって作製されています。ペトリ皿内のシリコンマスター上にPDMSエラストマーを高さ約1cmまでキャストし、オーブンを用いて70 °Cで1時間、マスターとPDMS混合物を硬化させます。

その後、PDMSスタンプをシリコンマスターから取り外し、マイクロコンタクトプリンティング法を用いてタンパク質パターンをプリントするために適切なサイズに切断します。まず、UVオゾンクリーナーでパターン面を1.5時間処理し、PDMSスタンプを洗浄して親水性を高めます。オゾン処理後すぐに、10 µLのストレプトアビジンをPDMSスタンプ上に滴下し、広げます。蛍光顕微鏡でトレースを確認する必要がある場合は、ストレプトアビジン-rhodamine 350などの蛍光色素が結合したストレプトアビジンを使用してください。

加湿チャンバー内で1時間放置します。スタンプ上の過剰なstrep dinをティッシュペーパーで拭き取り、空気にさらして除去します。スタンプを約1分間乾燥させます。

スタンプをPLLペグビオチンコートガラスカバースリップの上に軽く押し付けます。蛍光標識したstrep dinを使用した場合は、落射蛍光顕微鏡でパターンを確認してください。また、ディップペンリソグラフィーを用いてタンパク質パターンをプリントすることも可能です。

まず、1 mg/mLのstrippinまたはstripped avidan elif Fluor 3 50を1部と、グリセロール10部を混合し、その混合液5 µLをカンチレバーにロードします。印刷速度を調整してください。スポットサイズを小さくするには、カンチレバーの表面への接触時間、またはカンチレバーから表面までの垂直距離を調整します。

ディップペンリソグラフィー装置の操作マニュアルに従い、約5 µmのプリントプロセスを開始します。プリントしたすべての表面をデシケーター内で保存します。表面勾配の作成には、市販のマイクロ流体デバイスを使用します。

数時間にわたって漏れがないことを確実にするため、トリトンコートまたはパターン形成済みのガラスカバースリップをデバイスの粘着面に貼り付けます。デバイスの端を、温めた薄い層のVaselineで封止し、さらにVaselineとパラフィンワックスを1:1で混合したものを2層目に塗布して封止します。デバイスのチャネルに6 µLのPBSを満たし、2つの対向する勾配を作成します。

2つのリザーバーのうち一方に70 µLのビオチン化フルオレセインを、もう一方に70 µLのビオチン標識RGDペプチド（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）を満たし、サンプルを室温・暗所で1時間インキュベートします。マイクロ流体デバイス内のビオチン、RGD、およびビオチン含有液の洗浄は、気泡が混入してマイクロコンタクトプリントされたトラックが乱されるリスクがあるため、本手順で最も困難な工程となります。確実に成功させるためには、ビオチンおよびPBSを慎重にゆっくりと除去する必要があります。

ビオチン溶液を除去し、マイクロ流体デバイスに装着したまま、表面をPBSで2回慎重に洗浄します。蛍光標識した細胞をマイクロ流体デバイスにロードする前に、接着剤グラジエントの方向をマークしておきます。細胞数をカウントし、同数の細胞が2本のチューブに分かれるように分けます。

洗浄および再懸濁を行います。1本の細胞チューブを化学誘引物質を含む培地（10% FBS含有低グルコースDMEMなど）で懸濁し、もう1本の細胞チューブを化学誘引物質を含まない培地（0% FBS含有DMEMなど）で懸濁します。各チューブの最終的な細胞濃度は5×10⁵ cells/mLとしてください。

マイクロ流体デバイスからすべての溶液を取り除き、予熱された顕微鏡の上に設置します。0% FBS DMEMで再懸濁した細胞 70 µLを一方のリザーバーにロードします。10% FBS DMEMで再懸濁した細胞 70 µLをもう一方のリザーバーにロードします。

蒸発を防ぐため、リザーバーの上にテープを緩めに貼ります。マイクロ流体デバイスのチャネルが視野に入っており、細胞にピントが合っていることを確認してください。露光時間や蛍光フィルターなどの画像取得パラメータを選択します。

明視野および蛍光の画像シーケンスにおいて、細胞とトラック、ならびにタイムポイントと記録時間を設定し、画像取得プログラムを開始します。本ビデオでは、接着性と可溶性の競合する勾配を持つ環境内で遊走する細胞のライブセルイメージング手法について実演します。蛍光標識strippinおよびビオチン化RGDを含む接着トラックは、マイクロコンタクトプリンティングまたはディップペンリソグラフィーを用いて作製されました。

マイクロコンタクトプリンティングが成功したかは、トラックを横断する蛍光強度のラインプロファイルで判断でき、接着トラックと防汚領域が明確に区別できれば成功です。ディップペンリソグラフィーでプリントされたドットが、涙型ではなく丸みを帯びていれば、プリンティングプロセスが成功したことを示しています。この例では、行と列の間隔を10～15 µmに設定し、ドットを直線状にプリントしました。

この距離は、ドット同士が融合するのを防ぐのに十分であると同時に、単一の視野で複数のドットを観察することを可能にします。ほとんどの顕微鏡設定において、単純なマイクロ流体デバイスを用いて、プリントされたトラック上に接着キューの勾配を作成しました。これは、マイクロ流体チャンバーパネルの反対側にbiotin four fluoresceinとbiotin RGDをロードすることによって行われました。

Aは、合計画像長3072 µmで撮影された60枚のモザイク画像を示しています。パネルBでは、モザイク全体の長さにわたって蛍光強度を測定しました。チャネル内のRGD勾配を示すために、蛍光強度に線形トレンドラインを適合させました。

ビオチンおよびビオチンRGD溶液を除去した後、同じチャンバーを使用して可溶性勾配を導入することができます。パネルAは、T=0におけるPBSおよびフルオレセイン充填リザーバー付近、およびチャネルを横切るフルオレセイン染料の蛍光強度を示しています。パネルBは、可溶性因子の蛍光強度を示しています。

16時間のインキュベーション後、得られた同等の結果は、グラジエントが少なくとも16時間安定していたことを示しています。この方法を用いて、相反するグラジエントを持つマイクロ流体チャンバー内での細胞遊走が観察され、その代表的な動画をここに示します。接着グラジエントにはstrep avidanトラック上に固定化したRGDを用い、可溶性グラジエントには0から10%FBSを用いました。

画像は15分ごとに、計20時間にわたって撮影されました。表示されている画像の遷移速度は毎秒8フレームです。この2つ目の動画は、FBS源に向かって移動する単一のheli cellを示しています。

表示されている画像の遷移は1秒あたり8フレームです。細胞の軌跡を示す青い線は、細胞トラッキングソフトウェアを用いて取得されました。最後のグラフィックは、最初の動画内の画像から得られた細胞の軌跡を示しています。

水溶性FPSの高濃度側へ遊走した細胞の軌跡を赤色で、接着性RGDの高濃度側へ遊走した細胞の軌跡を黒色で示しています。これらの軌跡から、接着性RGDの高濃度側よりも、化学誘引物質の供給源に向かってより多くのHeLa細胞が遊走したことが分かります。この手順を行う際は、接着勾配の調製およびタイムラプスイメージング中に、マイクロ流体デバイス内のPBSまたは培地が蒸発することを避けるのが重要です。必要に応じて粘着テープを使用し、この手順に従ってマイクロ流体デバイスのすべての入口を塞いでください。

細胞遊走中のタンパク質による細胞骨格のバイオメカニクス、焦点接着タンパク質、および受容体などの追加的な疑問を解決するために、トランスフェクションやハイブリッド溶液顕微鏡法などの他の手法を実施することができます。