大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

このビデオの一般的な目標は、成人の皮膚組織からヒト初代表皮細胞を分離して培養する新しい簡単な方法を紹介することです。この高度な方法は、実験室と臨床の両方のアプリケーションで、高可能性の表皮細胞を多数作製するのにより適しています。秤量する前にティッシュをPBSで洗ってください。

電子スケールで皮膚組織の重量を量ります。皮膚組織を70%エタノールで30秒間すすぎます。PBS中の組織を抗生物質と2回、毎回5分間インキュベー

組織を別の滅菌皿に移し、メスの刃を使用して完全に均質化します。ティッシュを濡らしたままにするために、5分ごとに200マイクロリットルのPBSを追加します。均質化された組織を50ミリリットルのチューブに移します。

皮膚組織1グラムごとに10ミリリットルの酵素混合物を追加します。均質化された組織と酵素を完全に混合します。混合物を摂氏37度の水浴中で振とうしながらインキュベートします。

その後、0.25%トリプシンの1/5の容量を追加します。摂氏37度の水浴中で30分間インキュベーションを続けます。Dnase I溶液を1対100の比率で混合物に加えます。

その後、さらに5分間インキュベートします。同量の中和媒体を追加して、消化プロセスを停止します。溶液を約20回上下にピペットで動かします。

解離した細胞を100μmのセルストレーナーでろ過し、組織の破片を取り除きます。200 gで5分間遠心分離します。チューブの底にあるペレットを観察します。

上清を取り除き、細胞ペレットを10ミリリットルの中和培地で洗浄します。その後、200 gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを10マイクロモルのROCK阻害剤を含む接種培地に再懸濁します。

100mm培養皿に6個目の細胞を10回2回プレートします。3日後、接種培地を無血清ケラチノサイト培地と交換します。メディアは2日ごとに交換してください。

細胞が密度の約80%に達したら、細胞を継代します。細胞をPBSで洗浄します。必要に応じて、2分間トリプシンし、PBSで細胞を洗浄して、汚染された真皮細胞を取り除きます。

同量の中和媒体を追加します。200 gで5分間遠心分離します。最後に、上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁します。

ヒト皮膚組織から単離されたケラチノサイトを、2つの方法によって別々にインキュベートしました。従来の方法は、2日間の手順を含む2段階の消化です。対照的に、新しい方法はワンステップの消化で、実行には約3時間かかります。

3日目には、従来の方法ではこのような現象は起こらないのに対し、新しい方法では培養された多くの細胞クラスターを簡単に見つけることができます。5日目には、新しい方法により大量の初代細胞が産生されることが観察されました。培養ケラチノサイトの分化状態を調べるために、基底細胞マーカーK5と終末分化マーカーロリクリンを解析しました。

その結果、全細胞の90%がK5陽性であったが、3代目でロリクリンを発現した細胞は10%未満であり、未分化のケラチノサイトであることが示された。真皮線維芽細胞に発現するビメンチンの発現を確認し、単離時の真皮細胞の汚染を調べました。その結果、最初の継代では約3%の真皮細胞が出現したが、3代目では約0.02%しか検出されず、継代後の表皮細胞の純度が高いことが示された。