大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法
2018年8月25日
大人の皮膚組織からプライマリ ヒト角を効率的に分離するためのプロトコルをご紹介します。このメソッドは、自発的に皮膚細胞から表皮細胞を分離する接種培地で岩阻害剤の Y-27632 を使用して従来の手順を簡素化します。
このビデオの一般的な目標は、成人の皮膚組織からヒト初代表皮細胞を分離して培養する新しい簡単な方法を紹介することです。この高度な方法は、実験室と臨床の両方のアプリケーションで、高可能性の表皮細胞を多数作製するのにより適しています。秤量する前にティッシュをPBSで洗ってください。
電子スケールで皮膚組織の重量を量ります。皮膚組織を70%エタノールで30秒間すすぎます。PBS中の組織を抗生物質と2回、毎回5分間インキュベー
トします。組織を別の滅菌皿に移し、メスの刃を使用して完全に均質化します。ティッシュを濡らしたままにするために、5分ごとに200マイクロリットルのPBSを追加します。均質化された組織を50ミリリットルのチューブに移します。
皮膚組織1グラムごとに10ミリリットルの酵素混合物を追加します。均質化された組織と酵素を完全に混合します。混合物を摂氏37度の水浴中で振とうしながらインキュベートします。
その後、0.25%トリプシンの1/5の容量を追加します。摂氏37度の水浴中で30分間インキュベーションを続けます。Dnase I溶液を1対100の比率で混合物に加えます。
その後、さらに5分間インキュベートします。同量の中和媒体を追加して、消化プロセスを停止します。溶液を約20回上下にピペットで動かします。
解離した細胞を100μmのセルストレーナーでろ過し、組織の破片を取り除きます。200 gで5分間遠心分離します。チューブの底にあるペレットを観察します。
上清を取り除き、細胞ペレットを10ミリリットルの中和培地で洗浄します。その後、200 gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを10マイクロモルのROCK阻害剤を含む接種培地に再懸濁します。
100mm培養皿に6個目の細胞を10回2回プレートします。3日後、接種培地を無血清ケラチノサイト培地と交換します。メディアは2日ごとに交換してください。
細胞が密度の約80%に達したら、細胞を継代します。細胞をPBSで洗浄します。必要に応じて、2分間トリプシンし、PBSで細胞を洗浄して、汚染された真皮細胞を取り除きます。
同量の中和媒体を追加します。200 gで5分間遠心分離します。最後に、上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁します。
ヒト皮膚組織から単離されたケラチノサイトを、2つの方法によって別々にインキュベートしました。従来の方法は、2日間の手順を含む2段階の消化です。対照的に、新しい方法はワンステップの消化で、実行には約3時間かかります。
3日目には、従来の方法ではこのような現象は起こらないのに対し、新しい方法では培養された多くの細胞クラスターを簡単に見つけることができます。5日目には、新しい方法により大量の初代細胞が産生されることが観察されました。培養ケラチノサイトの分化状態を調べるために、基底細胞マーカーK5と終末分化マーカーロリクリンを解析しました。
その結果、全細胞の90%がK5陽性であったが、3代目でロリクリンを発現した細胞は10%未満であり、未分化のケラチノサイトであることが示された。真皮線維芽細胞に発現するビメンチンの発現を確認し、単離時の真皮細胞の汚染を調べました。その結果、最初の継代では約3%の真皮細胞が出現したが、3代目では約0.02%しか検出されず、継代後の表皮細胞の純度が高いことが示された。
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概要
この記事では、成人皮膚組織から一次ヒトケラチノサイトを分離するための簡略化されたプロトコルを紹介します。この方法は、ROCK阻害剤Y-27632を使用して、表皮細胞と真皮細胞の分離を促進します。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 皮膚科学
- 再生医療
背景
- 一次ヒトケラチノサイトは様々な研究応用に不可欠です。
- 従来の分離方法は複雑で時間がかかる場合があります。
- ROCK阻害剤Y-27632の使用は、より効率的なアプローチを提供します。
- 分離されたケラチノサイトは、研究室および臨床設定の両方で使用できます。
研究目的
- 表皮細胞を分離するためのより効率的な方法を開発すること。
- 高ポテンシャルの表皮細胞の収率を向上させること。
- 皮膚細胞を用いた研究および臨床応用を促進すること。
使用された方法
- 計量前に、PBSで皮膚組織を洗浄します。
- 電子スケールを使用して皮膚組織を計量します。
- 組織を70%エタノールで30秒間すすぎます。
- 組織を抗生物質入りPBSで5分間ずつ2回インキュベートします。
主な結果
- このプロトコルは、一次ケラチノサイトの分離に成功しました。
- 生存可能な表皮細胞の高収率が得られました。
- この方法は再現可能で効率的です。
- 分離された細胞は様々な応用に使用できます。
結論
- この方法は一次ケラチノサイトの分離を簡略化します。
- この分野の研究者にとって信頼できるアプローチを提供します。
- ROCK阻害剤の使用は細胞収率と生存率を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
