Name: 大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶ大人の皮膚組織からROCK阻害剤Y-27632を用いて効率的に一次ヒトケラチノサイトを単離する簡易プロトコル。この方法は細胞生物学と再生医療の研究に有用です。

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この作品は、キー研究と開発中国プログラム (2017YFA0104604)、国家自然科学基金の中国 (NSFC、81772093)、一般的なプログラムによって支持された科学および技術開発プログラムの蘇 (ZXL2015128)江蘇省 (BK20161241) の自然科学財団と山東省泰山学者賞 (tshw201502065)。

このプロトコルで使用される人間の組織は、金融機関の人間研究倫理委員会のガイドラインによると処理されている (NO.2015120401、日: 2015 年 5 月 12 日)。
1. 準備
<ol><li>冷たいダルベッコの 10 mL と 50 mL のチューブの病院で整形手術から破棄収集新鮮な大人の腹部皮膚組織のイーグル培地 (DMEM)、変更されました。供試体は、細胞生存率を大きく影響せず 72 h まで 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>下記のとおり、試薬、培地を準備します。<ol>
<li>(100 U/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (100 mg/L) の 1 mL を 50 mL のリン酸緩衝液 (PBS) 洗濯ソリューションを準備するのに追加します。</li>
		<li>酵素消化液の 2 つのセットを準備: (1) 当期 (DMEM で 2.5 mg/mL) の 50 mL を準備し、50 mL のタイプ I はコラゲナーゼ (DMEM で 2.5 mg/mL) 別に従来法;(2) 当期の混合物の 50 mL を準備し、コラゲナーゼをタイプ I (ディゾルブ 125 mg 当期粉末、125 mg の I 型コラゲナーゼ粉 DMEM の 50 mL の) 新しいメソッドの。 注: すべての酵素のソリューション必要がありますフィルタ リング 0.22 μ m ストレーナー付けや at4 ° C を保持</li>
		<li>両方のメソッドに対して消化ソリューションを準備: 0.05% トリプシンと 0.25% トリプシンに商業的に購入しました。10 mg/ml DNase 私私粉末の 5 mL の PBS、DNase の 50 mg を溶解することによりソリューション 0.22 μ m ストレーナーとフィルター、-20 ° C で保存</li>
		<li>酵素の消化力を中和するために媒体の 500 mL を準備: 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン DMEM 培。</li>
		<li>500 ml 接種培地 (成長因子を含む中、G の中と呼ばれる) の: 40 ng/mL の線維芽細胞成長因子 2 (FGF2) 20 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、40 μ g/mL fungizone 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM/F12 (3:1) 培地と2 %b27 を補足します。</li>
		<li>100 mm 細胞培養を前処理料理型を含むコーティング マトリックスの 2 mL の私部屋の温度で 30 分のコラーゲン。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 従来の方法
<ol><li>
皮膚組織の前処理方法
	<ol>
<li>皮膚組織の 1.5 cm2を取るし、それを洗って 1 x 10 の mL の PBS。30 の 70% エタノール 10 mL 洗い流し、s それを孵化と 10 ml の洗浄ソリューション (PBS 2% ペニシリンとストレプトマイシンを含む)、5 分の 2 倍。 注: すべての洗浄は、層流フードの内部 100 mm 細胞培養皿で行われます。</li>
		<li>100 mm 細胞培養ディッシュで皮下脂肪層を削除し、(重量はこのプロトコルでは 1 g) 皮膚組織を推し量る滅菌はさみで組織をトリミングします。 注: 十分なトリミングは真皮から表皮の効率的な分離のため非常に重要です。黄色の脂肪層は、視覚的に簡単に区別できます。</li>
		<li>ダウン組織を別 100 mm 滅菌皿真皮側に転送、その後、皮膚組織をメス刃を使用して 3-4 mm 幅の短冊状にカットします。 注: 脂肪層と真皮側が視覚的に認識されます簡単に。</li>
		<li>100 mm ディッシュの皮膚組織に 2.5 mg/mL 当期溶液 10 mL を追加し、その後、4 ° C (20 h 以上) で一晩中皿をインキュベートします。 注: 当期溶液の量は、組織の各グラムの消化のため当期溶液 10 mL を使用して計算できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
皮膚組織からの表皮の分離
	<ol>
<li>2 日目、良いピンセットを使用して真皮から表皮をはがします。 注: 表皮を剥がしにくい場合は、当期の消化が足りなかった、ティッシュの不十分なトリミングのため通常であります。この場合、組織より長い培養時間を必要があります。</li>
		<li>メス刃; を使用して組織液に細胞培養液 500 μ L で皮をむいた表皮をミンチします。10 mL を 50 mL チューブに 0.25% トリプシンとそれを再懸濁し、それの揺れで、37 ° c の水浴中 20 分を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コレクション、初代培養細胞の培養
	<ol>
<li>トリプシン活性を中和する中和液 (このプロトコルでは 10 mL) の等しい量を追加することによって。</li>
		<li>20 x 上下ソリューションを 10 mL の血清ピペットでピペッティングによる表皮細胞を分離し、残存組織の残骸を削除する 100 μ m セル ストレーナー携帯ソリューションを渡します。</li>
		<li>ろ過の後 200 x gで 5 分で細胞液を遠心分離します。洗浄用中和培地で細胞ペレットを再懸濁します、その後、細胞ペレットを取得する 200 x gで再度遠心。</li>
		<li>低カルシウム、無血清ケラチノ サイト媒体 (SFM) の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。このソリューション総細胞数をカウントし、コーティングのマトリックスで前処理した 100 mm 細胞培養皿に SFM の 10 mL で約 2 x 10 の6セルをプレートの 10 μ L を取る (を含むタイプ I コラーゲン)。 注: コーティングは、従来の方法に必要なステップです。</li>
		<li>培養培地ごとの 2 d を変更します。 注: は前に、と培養液を変更した後、顕微鏡の下で細胞粘着をチェックします。</li>
		<li>通路、細胞の約 80% に達すると合流。 注: すべての培養皿はコーティング行列で前処理しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 新しい方法
<ol><li>
皮膚組織の前処理方法
	<ol>
<li>組織に従って上記 (ステップ 2.1) 従来の方法を収集します。</li>
		<li>皮膚組織 1 を洗って 10 ml の PBS の x (重量はこのプロトコルでは 1 g 程度) 電子スケールで滅菌したプラスチック容器の重さと。 注: このプロトコルに必要な組織の最小重量は 0.1 g 使用組織標本が小さすぎる場合、十分な細胞数を得ることが困難だからです。オペレーターの処理能力に依存する最終的にこのプロトコルのための組織の最大重量はありません。</li>
		<li>鉗子を使用して、30 の 70% エタノール 10 mL で皮膚組織を洗浄する s。</li>
		<li>2 組織をインキュベート洗浄ソリューション (2.1.1 の手順で準備)、5 分の各時間の 10 ml x。 注: 上記すべての洗浄手順は、100 mm 細胞培養皿 (ティッシュ文化フード) の層流フードの内部で実行されます。</li>
		<li>滅菌 100 mm セル ディッシュを別組織に転送します。</li>
		<li>メスのブレードを使用すると、すると、組織は組織スラリーに徹底的にミンチします。</li>
		<li>濡れている組織を維持する 200 μ L の PBS 5 分ごとを追加します。 注: は、手順 3.1.5 - 3.1.7 約 15 分かかります。上記のすべての手順は、部屋の温度で行われます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
皮膚組織の消化
	<ol>
<li>50 mL チューブに均質化組織ソリューションを転送します。皮膚組織のすべての 1 g の酵素の混合物の 10 mL を追加します。均質化組織に酵素を徹底的にミックスします。</li>
		<li>1 h の 37 ° C の水浴の揺れとの混合物を孵化させなさい。</li>
		<li>37 ° C の水浴中で 30 分間別消化混合物に 1/5 量 0.25% トリプシン (このプロトコルで 2.5 mL) を追加します。</li>
		<li>DNase を追加私ソリューション 1: 100 (v/v) 比率 (このプロトコルで 250 μ L) で酵素の混合し、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コレクション、初代培養細胞の培養
	<ol>
<li>1:1 の比率で中和中 12.5 mL を追加することによって消化力プロセスを停止します。約 20 x、10 mL の血清ピペットを使用してセルを分離するソリューションを上下にピペットします。</li>
		<li>ティッシュの残骸を削除する 100 μ m セル ストレーナー解離細胞をフィルターします。200 x gで 5 分間観察チューブの下部にペレットで上清を遠心します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、200 x g細胞を収集するために 5 分間で 10 mL、中和中、遠心力で細胞ペレットをもう一度洗浄します。</li>
		<li>10 mL 接種培地 (G ステップ 1.2.5 から媒体) の Y-27632 の 10 μ m で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>総セル数をカウントし、100 mm 細胞培養ディッシュに G の中の 10 mL で約 2 x 10 の6セルをプレートに溶液 10 μ L を取る。 注: プリコートのステップは新しいメソッドに必要ななく、真皮層の除去は不要ですか。</li>
		<li>3 d の後、接種培地を低カルシウム SFM 媒体に置き換えます。培養培地ごとの 2 d を変更します。 注: は前に、と媒体を変更した後に細胞接着をチェックします。</li>
		<li>通路、細胞の約 80% に達すると合流。 注: 必要に応じて、2 分の 0.05% トリプシンで細胞を前処理し、表皮細胞をトリプシン前に皮膚細胞を汚染する PBS のセルを洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細胞の継
<ol><li>メディアを取り出して、洗浄、pbs セルと、(各 100 mm 皿) あたり 0.05% トリプシンの 2 mL を加えます。</li>
	<li>5 分のためのインキュベーター (5% CO2と 37 ° C) のセルを孵化させなさい。</li>
	<li>すべての細胞が培養皿から切り離されるかどうかを確認する顕微鏡を使用しているセルを確認します。</li>
	<li>10 %dmem の 8 mL を加えて酵素反応を中和し、15 mL チューブに細胞を収集し、FBS。</li>
	<li>200 x g細胞ペレットを取得する 5 分間の遠心分離機します。</li>
	<li>ゆっくりと上澄みを除去、その後、SFM 培地 10 ml 細胞ペレットを再懸濁し、セルの数をカウントします。</li>
	<li>1 x 10 の6セルは、各セル 100 mm 皿に SFM の 10 mL でプレートします。</li>
	<li>媒体ごとの 2 d を変更します。</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+BIology%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).</li>
<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

培養主 HKCs は、3 年以上の診療所で傷を治療するために広く利用されているし、その時間以来常にタイムリーで効率的に臨床応用のための細胞の十分な数を取得することが重要です。したがって、実習では、真皮から表皮の分離を必要とする従来の分離法が難しく細胞と成体細胞を通過する低能力の低収量のためのこれらの要求を満たすために。ここでは、効率的に研究室と臨床応用の両方より適している前レポート13,14、に基づいて成体組織から HKCs を取得するため開発した新しい手法について述べる.
新しい方法で最良の結果を達成するために次の重要な手順に注意を支払わなければなりません。まず、均質化の手順は重要な手順です。破砕不足は明らかに解離細胞の低収量で酵素消化の効率に影響を与えます。第二に、トリプシン消化手順は、; 30 分以上を服用してはいけませんそうでなければ、解離細胞の生存率が低下します。第三に、解離細胞を効率的に収集するには、ろ過用セル ストレーナーの細孔径が 100 μ m に...

目標は、臨床応用の特に成体からプライマリ人間ケラチノ サイト (HKCs) を分離する簡単で効率的なプロトコルを開発することでした。皮膚表皮幹細胞、皮膚の基底層に局在を持って増殖し区別するため、皮膚1,2,3,の機能を維持するケラチノ サイトを提供する可能性の高い4. HKCs 組織は皮膚組織工学と再生のために特に痛んだ肌の修復と遺伝子治療臨床応用5,6広く皮膚から分離しました。HKC ベースのアプリケーションにとって重要な問題は、効率的に分離し、高い潜在的な体外7,8で HKCs の大きな数字を展開することです。これらのメソッドは時々 時間がかかり、実行および低細胞収率と皮膚標本の種類によって限定されているなど、その他の制限に関して複雑なさまざまな研究グループは、幹のような HKCs の文化を生産する方法を開発しているが、9を使用します。例えば、皮膚組織中の HKCs を分離する従来の方法は、6真皮から表皮の分離と 2 段階の酵素消化を含まれます。そのメソッドは通常新生児の組織のためによく働くが、成体組織から細胞を分離するために使用するとき非常に困難します。
Y-27632、Rho 関連キナーゼ (ロック) の阻害剤は、表皮幹細胞の分離と植民地成長10、11,12の効率を大きく向上する報告されています。以前の研究では、我々 は Y-27632 は表皮細胞のクローナルな増殖が容易になりますが、特異的接着分子13式を制御することによって皮膚細胞の収量が減少を発見しました。また、G の中、成長と一次表皮細胞の収量をサポートすると呼ばれる新しいエアコン接種媒体を確立しました。Y-27632 を G の中を組み合わせることによりこの手法自発的に表皮真皮分離13,14のステップを除去する酵素の消化力の後表皮及び真皮細胞を区切ることができます。大人の皮膚組織から HKCs を分離するこの新しい方法の詳細な手順を述べる今以前の報告に基づき、.

<table><tbody><tr><td>Countess 全自動セルカウンター</td><td>Invitrogen Inc.&nbsp;</td><td>C10227</td><td>自動セルカウント&nbsp;</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>細胞インキュベーション用</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>細胞遠心分離機</td></tr><tr><td>恒温シェーカー</td><td>上海ボックスン</td><td>150036</td><td>ウォーターバス用</td></tr><tr><td>電子スケール</td><td>ハルビン中輝</td><td>1171193</td><td>組織計量用</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>エッペンドルフ</td><td>30702115</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>50ml 遠心チューブ</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>細胞遠心分離用</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>コーニング社製</td><td>431792</td><td>細胞ろ過</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Solarbio Life Science&nbsp;</td><td>P1020-500</td><td>洗浄液</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>中和培地の成分</td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>表皮細胞培養培地</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>バイオロジカルインダストリー</td>ズ <td>04-001-1AC5</td><td>HKC</td></tr>解離0.25%トリプシンのための中和媒体<tr><td>0.05%トリプシン</td><td></td><td>ライフ</td><td>テクノロジー25300-062</td></tr>の成分<tr><td>&nbsp;</td><td>北京ソーラーバイオサイエンス&技術</td><td>T1350-100</td><td>HKC解離</td></tr><tr><td>用 コーティングマトリックスキット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ R-011-K</td><td>コーティングマトリックス</td></tr><tr><td>用 ディスパーゼ</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>HKC分離</td></tr><tr><td>用 コラゲナーゼI型</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 17100-017</td><td>HKC分離用</td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼI</td><td>シグマ</td><td>9003-98-9</td><td>HKC分離</td></tr><tr><td>用 F12栄養ミックス、ハム</td><td>ライフサイエンス</td><td>31765035</td><td>G-mediumの成分</td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>ライフサイエンス</td><td>17504044</td><td>G-mediumの成長因子</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>G-mediumの成長因子</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK阻害剤</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>EGF組換えヒトタンパク質</td><td>の調製 Gibco</td><td>PHG0311</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>細胞増殖および細胞毒性アッセイ</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトサイトケラチン5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>HKCの</td></tr><tr><td>分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用ウサギ抗ヒトロリクリン</td><td>コーヴァンス</td><td>PRB-145p</td><td>HKCsの分化マーカーを確認するための免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトビメンチン</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3390</td><td>真皮線維芽細胞の免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>インテグリン&アルファ;6(GOH3)</td><td>サンタクルス&nbsp;</td><td>SC-19622</td><td>HKCs</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruzの</td>フローサイトメトリー解析&nbsp;<td>SC-2831</td><td>&αの陰性対照抗体;6-インテグリン&nbsp;フローサイトメトリー分析&nbsp;</td></tr></tbody></table>

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

新鮮な皮膚組織とその拡大培養から分離されたプライマリ ヒト角は実験室の研究および臨床応用、広く使用されています。ヒト角化従来の分離方法は、低細胞回収率、減らされた細胞による成体組織から細胞を生成する効率的に証明されている 2 つの連続酵素消化手順生存率。我々 は最近、媒体の Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632 を活用した皮膚組織中の人間の主な表皮の前駆細胞を分離する高度な方法を報告しました。従来のプロトコルと比較して、この新しいメソッドは、単純な簡単に、そして少ない時間のかかる、上皮幹細胞収量が増加し、その幹細胞の特性が向上します。さらに、新しい方法論は真皮から表皮の分離を必要としないし、したがって、異なったタイプの大人のティッシュからの細胞を隔離するために適しています。この新規分離培養手法は従来の方法の主な欠点を克服、高能室と臨床応用の両方表皮細胞の大量生産に適しています。ここでは、詳細に新しい手法について述べる。

(図 1 b) の従来の方法と新しい方法 (図 1 a) の回路図は図 1に示した。従来は、2 日目の手順を必要とする 2 段階の消化です。対照的に、新しいメソッドは、実行に約 3 時間かかりますワンステップ消化です。重要なは、ワンステップの新しいメソッドは接種培地に Y-27632 の存在に依存する同時に 2 つの集団 (表皮および真皮細胞) を取得できます。また、初期文化時間約 80% に到達する表皮細胞に、同じ数のセルは分離後接種した場合に合流で最低 3 日間より少なく従来の方法よりも通常かかります。
新しいメソッドは、コロニー形態で育つ他の主の表皮細胞を生成します。G の中で組織が接種された人間の皮膚から分離された HKCs Y-27632 を含みます。同じ数のセルは...

大人の皮膚組織からプライマリ ヒト角を効率的に分離するためのプロトコルをご紹介します。このメソッドは、自発的に皮膚細胞から表皮細胞を分離する接種培地で岩阻害剤の Y-27632 を使用して従来の手順を簡素化します。

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

このビデオの一般的な目標は、成人の皮膚組織からヒト初代表皮細胞を分離して培養する新しい簡単な方法を紹介することです。この高度な方法は、実験室と臨床の両方のアプリケーションで、高可能性の表皮細胞を多数作製するのにより適しています。秤量する前にティッシュをPBSで洗ってください。電子スケールで皮膚組織の重量を量ります。皮膚組織を70%エタノールで30秒間すすぎます。PBS中の組織を抗生物質と2回、毎回5分間インキュベートします。組織を別の滅菌皿に移し、メスの刃を使用して完全に均質化します。ティッシュを濡らしたままにするために、5分ごとに200マイクロリットルのPBSを追加します。均質化された組織を50ミリリットルのチューブに移します。皮膚組織1グラムごとに10ミリリットルの酵素混合物を追加します。均質化された組織と酵素を完全に混合します。混合物を摂氏37度の水浴中で振とうしながらインキュベートします。その後、0.25%トリプシンの1/5の容量を追加します。摂氏37度の水浴中で30分間インキュベーションを続けます。Dnase I溶液を1対100の比率で混合物に加えます。その後、さらに5分間インキュベートします。同量の中和媒体を追加して、消化プロセスを停止します。溶液を約20回上下にピペットで動かします。解離した細胞を100μmのセルストレーナーでろ過し、組織の破片を取り除きます。200 gで5分間遠心分離します。チューブの底にあるペレットを観察します。上清を取り除き、細胞ペレットを10ミリリットルの中和培地で洗浄します。その後、200 gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを10マイクロモルのROCK阻害剤を含む接種培地に再懸濁します。100mm培養皿に6個目の細胞を10回2回プレートします。3日後、接種培地を無血清ケラチノサイト培地と交換します。メディアは2日ごとに交換してください。細胞が密度の約80%に達したら、細胞を継代します。細胞をPBSで洗浄します。必要に応じて、2分間トリプシンし、PBSで細胞を洗浄して、汚染された真皮細胞を取り除きます。同量の中和媒体を追加します。200 gで5分間遠心分離します。最後に、上清を取り除き、細胞ペレットを再懸濁します。ヒト皮膚組織から単離されたケラチノサイトを、2つの方法によって別々にインキュベートしました。従来の方法は、2日間の手順を含む2段階の消化です。対照的に、新しい方法はワンステップの消化で、実行には約3時間かかります。3日目には、従来の方法ではこのような現象は起こらないのに対し、新しい方法では培養された多くの細胞クラスターを簡単に見つけることができます。5日目には、新しい方法により大量の初代細胞が産生されることが観察されました。培養ケラチノサイトの分化状態を調べるために、基底細胞マーカーK5と終末分化マーカーロリクリンを解析しました。その結果、全細胞の90%がK5陽性であったが、3代目でロリクリンを発現した細胞は10%未満であり、未分化のケラチノサイトであることが示された。真皮線維芽細胞に発現するビメンチンの発現を確認し、単離時の真皮細胞の汚染を調べました。その結果、最初の継代では約3%の真皮細胞が出現したが、3代目では約0.02%しか検出されず、継代後の表皮細胞の純度が高いことが示された。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。...

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髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

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新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

人間の皮膚は外部環境に対する防御の最初の行として機能します。大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を分離する手法を提案します。これらの孤立したケラチノ サイトは、多数の実験のセットアップに便利、皮膚の生物学の in...

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

このプロトコルの目的は、分子生物学、生化学、蛍光活性化細胞選別、一次インビトロ用途(例えば、クロノジェニック)などの様々な下流アプリケーションのために、成体マウスの後皮から表皮ケラチノサイトを分離することです。ケラチノサイト)。...

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

ここでは、3D懸濁液培養における表皮スフェロイドの系統的培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な上皮組織タイプで使用し、いくつかのヒト疾患および状態のモデリングのための幅広い用途を有する。...

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

本プロトコルは、成人マウス口蓋に由来する経口角化細胞の分離および培養について説明する。免疫染色を用いた評価方法も報告されている。...

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

筋骨格損傷に関連する創傷治癒の研究は、しばしば、シュワン細胞(SC)、ケラチノサイト、および線維芽細胞間の インビトロ 相互作用の評価を必要とする。このプロトコルは、ヒト包皮からのこれらの初代細胞の単離、培養、および特性評価を記述している。...

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

このプロトコールは、生細胞イメージングで使用するための新たに得られた(継代0)ケラチノサイトの培養を概説しています。...

ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

学ぶ大人の皮膚組織からROCK阻害剤Y-27632を用いて効率的に一次ヒトケラチノサイトを単離する簡易プロトコル。この方法は細胞生物学と再生医療の研究に有用です。

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