Name: 細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶSID4X-dCas9-KRABを用いた多重CRISPRエンハンサー干渉法で、特定遺伝子を制御するエンハンサーを同定する。ガイドRNA設計と細胞トランスフェクションの詳細なプロトコルを解説し、遺伝子発現制御メカニズムの解明に活用できる。

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この作品は、NIH/NHGRI R00 HG006922 と j. g. に NIH/NHGRI R01 HG008974 とハンツマン癌研究所によって支持されました。J.B.C. は、NIH の遺伝学 T32GM007464 トレーニング プログラムによって支えられました。

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li>
<li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
<li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li>
<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、物理的に dna 塩基配列を変えることがなく内因性の genomic 位置でエンハンサー機能を解剖するための簡単で柔軟なメソッドについて説明します。間 dCas9 KRAB27を使用して以前に発行された CRISPR 干渉プロトコルに概念で類似した、3 つの主要な方法でこれらのプロトコルが異なりますエンハンサー i。まず、エンハンサー i は、エンハンサーの非アクティブ化を達成するために MAD120の SIN3A の相互作用ドメインを利用しています。エンハンサーの非アクティブ化は、非アクティブ化の主要なメカニズムが HDAC 依存であることを示唆している HDAC の抑制剤を使用して救出することができます。DCas9 KRAB に CRISPR 干渉とは異なり、エンハンサー i は H3K9me3 の沈着に導かない。これは、エンハンサー i ガイド Rna、3 日間で収穫されて細胞をトランスフェクションの記事の一時的な導入に依存しているという事実のために可能性が高いです。CRISPR 干渉で 7 日間ポスト伝達12H3K9me3 の増加が観察されます。最後に、エンハンサー i プロトコルは、複数のサイトを同時にターゲットし、ターゲットの効率を監視するための戦略を提供します。モザイク seq17、dCas9 KRAB が複数エンハンサーを同時にターゲットに使用しますが、この手法で表現の変更を識別するために単一細胞 RNA シーケンスで利用され (エストロゲン応答遺伝子) など多くの遺伝子が低いのため探知されていなく行く単一細胞 RNA シーケンス エンハンサー-i の感度は、エンハンサーを個別に任意の遺伝子を組み合わせて研究を信頼性の高い方法を提供します。
エンハンサー i の最も重要なステップは、トランスフェクション興味の細胞ラインのために最適化する必要があります。ピューロマイシン transfected セルを豊かにするためにこのプロトコル依存しますが、可能な蛍光蛋白質及びフローサイトメトリーを使用して蛍光セルの並べ替えと共同 transfecting ガイド Rna は、いくつかの細胞への良い濃縮法証明するかもしれないタイプ。トラブルシューティングを行うし、トランスフェクションを確認する qPCR によるガイド Rna の発現レベルと SID4x-dCas9-KRAB の監視をお勧めします。ガイド RNA レベルが低いかどうか (サイクルしきい値 > 30)、ユーザーまた RNA の生産戦略の in vitro転写28など代替ガイドを検討する場合があります。高 gRNA レベルにもかかわらずガイド SID4x-dCas9-KRAB 蛋白質の RNA をターゲットすることは効率的ではありません、RNA シーケンスをガイドの場合異なる選択をする必要があります可能です。エンハンサー i 扱われる細胞クロマチンと融合タンパク質のチップ seq を実行すると、ターゲットの効率を監視できます。SID4x-dCas9-KRAB 関心の領域での高信号があり、その推定ターゲット遺伝子の表現の変更が検出されない場合、可能性が高い地域は検討した条件の下でその遺伝子の発現に影響しません。
エンハンサー-i の 1 つの潜在的な制限は、あまりにも多くのサイトが同時に対象とした場合、オフターゲット効果が蓄積する可能性です。それにもかかわらず、ノックダウンの CRISPR 干渉戦略少数がある RNAi29よりターゲット効果を特に dCas9 KRAB を表現するポリクローナル セルラインを使用時。我々 は同時に 10 のサイトをターゲットにする場合 SID4X-dCas9-KRAB の標的をゲノム結合を見ていますが、ないそれらのバインド イベントの結果として遺伝子発現変動を同定しました。いくつかエンハンサーは複数のプロモーターおよび/または他のエンハンサーに連絡、遺伝子発現制御のこの形態は共通かは明らかではないが、多くの遺伝子が単一のエンハンサーのターゲット式に変更されることが可能です。式変化観察特定エンハンサーをターゲットことを確認していないターゲットに効果、ユーザーは非重複ガイド Rna ターゲットに同じ地域の 2 つの明瞭なセットとエンハンサー i を実行できます。また、ヌクレアーゼ有能な Cas9 を使用して、領域の遺伝子の欠失はさらに遺伝子発現に及ぼす影響を確認できます。
ヒストン脱アセチル化を介してエンハンサー i 機能としてその無効化能力のヒストンのアセチル化のレベルがかなり増強に制限が可能です。さまざまな可能性があります特定のエンハンサーをターゲットでより効果的な代替の抑圧的な融合があります。遠位エンハンサー30、ターゲット遺伝子の発現を抑える dCas9 への DNA メチルトランスフェラーゼ融合を使用できますが、この抑圧が一時的でよくないです。別の抑圧的な融合は、ヒストン H3 のリジン 27 トリメチルにつながる、さまざまな細胞ラインとプロモーター31dCas9 ボブと同様のレベルでの遺伝子発現を抑制する友人の GATA1 (噴霧試験 ※ 1) ドメインを使用します。興味深いことに、SID のドメインの単一のコピーがエンハンサー i で現在使用されている 4 つのコピーよりもより多くのエンハンサー非アクティブ化を提供することが示唆しているプロモーターで抑圧的な可能性を低減噴霧試験 ※ 1 のより多くのコピーを dCas9 に追加します。いくつかの遺伝子座上 dCas9 融合のさまざまな組み合わせによるデュアル ターゲットから寄与するかもしれないことが可能です。たとえば、安定した長期的な抑圧は dCas9 DNMT3a と dCas9 KRAB32の同時伝達によって達成できます。これらの抑圧的な融合のほとんどだけ、一度に単一の軌跡に対象となってにいるし、不明のままは、同時に複数のエンハンサーを操作するに最も効果的であります。
エンハンサー-i、一握りの遺伝子の増強物の組み合わせを研究するための適切な方法ながらまだ多少スループット ユーザーが何百もの遺伝子の推定エンハンサーを勉強したい場合限られます。この技術の将来のアプリケーションは、複数のサンプルに複数の遺伝子を同時に定量化するイメージング技術を組み込む予定します。重要なは、これらの技術は時間のかかる RNA の隔離の必要性を排除、ライセートから RNA 分子の直接検出と互換性が。これらの適応はエンハンサーの大きいセットの尋問を容易にするため。

大規模なエンコード1、ロードマップ早稲田2、ファントムなどプロジェクトのシーケンス3セルタイプの数百にわたる数百万の人間のゲノムの内で推定エンハンサーを識別しました。各プロモーターに関連付けます 4.9 エンハンサーの平均、各エンハンサーと交信 2.4 遺伝子3の平均遺伝子発現は頻繁複数分散規制相互作用の統合の結果であることを示唆するいると推定されます。重要な残りの課題だけでなく個々 のエンハンサーは、遺伝子発現に貢献を定義することですが表現に影響を与える結合方法しますが、。遺伝子解析、マウス5ショウジョウバエ4からのモデル生物のエンハンサーの間の関係を識別するために使用されます。しかし、これらの実験は時間がかかり、複数の遺伝子に複数のエンハンサーの研究の低スループットです。
大規模なエンハンサー機能を勉強するための 1 つのアプローチには、並列のレポーターの試金が含まれます。これらの試金 DNA シーケンス6レポーター遺伝子の発現をドライブする能力についての何千もの同時のスクリーニングを可能にします。これらのアッセイは、DNA シーケンスでは、遺伝子制御情報7を伝えるために十分なだけすることができます示されている、彼らはネイティブ クロマチンのコンテキストの外部で実行中の注意事項と異種プロモーター付属します。さらに、超並列レポーターの試金の分析対象の DNA シーケンスのサイズは通常関連する周囲のシーケンスを除外する可能性があります未満 200 ヒトです。重要なは、レポーターの試金はのみ、一度に 1 つのシーケンスの活性を測定ととることはありません考慮エンハンサーの間に存在することができます複雑な関係。したがって、並列レポーターの試金が DNA シーケンスの本質的な活動についての参考情報であるが、彼らはありません必ずしもお知らせゲノムのコンテキストでその DNA シーケンスの関数の。
最近内因性遺伝子座でエンハンサーの削除ができるよう、開発した CRISPR/Cas9 ツール8が遺伝子発現制御の研究を促進しました。ゲノム不安定性につながる可能性があります複数のエンハンサーを同時に削除するし、それは単一セルラインで連続エンハンサー削除を生成する時間がかかる。さらに、修復、削除のサイトで新しいゲノム配列が作成され、このシーケンスは、調節機能を得ることができます。9,10を活性化または抑制 Cas9 のヌクレアーゼ欠損形態に11,12ドメインの融合に依存する遺伝子発現を調節することのために特別開発した Cas9 の代替バージョン(dCas9)。これらの融合蛋白質は、彼らは物理的に DNA シーケンスを変更し、代わりに規制地域を調査するためにエピジェネティクスを調節すると同時に複数の遺伝子座の勉強に最適です。最も広く使われている抑圧的な融合は、抑圧のヒストン H3 のリジン 9 のトリメチル (H3K9me3)13の堆積を促進 KAP1 コリプレッサー複合体を募集する KRAB です。dCas9-KRAB、として知られているまた CRISPR 干渉14、遺伝子発現15,16; への貢献ターゲットと画面の個々 の増強に使用されていますただし、同時に複数の地域をターゲットにしない最適化されています。エンハンサー、モザイク seq17、多重 CRISPR 干渉の影響の 1 つのバージョンは、読み出しとして単一細胞 RNA シーケンスを使用しますが、この技術は高価で、単一細胞の感度が低いため高発現遺伝子の研究にのみ適してRNA シーケンス
我々 はエストロゲンに転写応答のコンテキスト内で組合せエンハンサー機能解剖 CRISPR 干渉に基づく手法を開発しようとしました。エストロゲン応答遺伝子の約半分が含まれて 2 つ以上エンハンサー縛られてエストロゲン受容体 α (ER)18、近くに複数のエンハンサーのエストロゲン応答に参加して規制のロジックが必要になりますを理解可能性があることを示唆しています。同時に複数のエンハンサーを対象とします。プロモーターに CRISPR 干渉を用いた初期の研究は、すべてのプロモーターは KRAB 仲介抑圧19に均等に敏感ことを示唆と私たちは dCas9 への抑圧的なドメインの追加が非活性化を促進するかもしれないと判断多様なエンハンサー。我々 は選んだ Sin3a の相互作用ドメインの Mad1 (SID)20それヒストン脱アセチル化酵素21の採用につながると転写活性に関連付けられているヒストンのアセチルのグループを削除します。重要なは、SID のドメイン dCas922と23の物語に融合遺伝子の発現を減らすことで有効であったし、Sin3a 様々 なエンハンサー シーケンス コンテキスト24で強力な抑圧的な共同の要因であることが示されています。我々 は ER によってバインドされている 10 の異なるエンハンサーを対象とする SID4x-dCas9-KRAB (エンハンサー-i) を使用し、4 遺伝子18エストロゲン転写反応に必要な小胞体結合部位 (ERB) を識別します。またエストロゲン転写応答の生産に協力するサイトを識別するエンハンサーの組み合わせを取り上げた。その 50 サイトまですることができます潜在的の対象になる同時に検出可能な遺伝子発現変動がわかった。チップ seq と RNA シーケンスを使用して、エンハンサー i が複数エンハンサーを同時に研究のための特異性の高い技術であることを示しました。
このプロトコルではエンハンサー-i、ティッシュ文化の設定で同時に複数のエンハンサー機能研究をできる柔軟な技術を実行するための手順をについて説明します。エンハンサー i 遺伝子欠失との相関が大きいが、ヒストン脱アセチル化酵素 (Hdac) に依存している一時的な不活性化を提供します。ガイドを提供する Rna ウイルスベクターによる安定した統合ではなく一過性トランスフェクションを介して堆積と H3K9me3 の潜在的な広がりこのプロトコルを回避できます。このプロトコルの詳細ガイド RNA デザインとクローニングのトランスフェクション ギブソン アセンブリを介してガイド リポフェクションを使用して Rna と qPCR による結果の遺伝子発現の解析を変更します。我々 はゲノムとトランスクリプトームのレベルを対象にしたエンハンサー i の特異性を評価する方法があります。この手法を研究開発した小胞体遺伝子はひと癌細胞株におけるエンハンサーをバインド、すべての哺乳類のエンハンサーの解剖にも適用可能です。

<table><tbody><tr><td>ZR 96-well Quick-RNA Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII 制限酵素</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>プロメガ</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA クリーン&コンセントレータキット</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Human: Ishikawa cells ECACC</td><td></td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac rabbit polyclonal</td><td>Active Motif&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3ウサギポリクローナル</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAGマウスモノクローナル</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ERアルファウサギポリクローナル</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puroプラスミド</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVectorプラスミド</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 ピューロマイシンプラスミド</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB プラスミド</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads</td><td>Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo研究</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>クイックロードパープル2ログDNAラ</td><td>ダーNEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞を用いた多重 crispr ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

複数エンハンサーはしばしばある特定の遺伝子を調節する、まだほとんどの遺伝子は不明のまま、エンハンサーは、遺伝子の発現に必要などのようにこれらの増強物結合転写応答を生成します。エンハンサーの何百万人を特定したとゲノム規模でエンハンサー機能を決定する高スループット ツールが必要です。エンハンサー機能を研究するための現在の方法は、ヌクレアーゼ熟練した Cas9 を使用して遺伝的削除ですが複数の連続したクローンの細胞が必要としてこのテクニックを使用して複数のエンハンサーの組合せの効果を検討することは困難生成されます。エンハンサー-i、その内因性遺伝子座で同時に複数のエンハンサー機能の尋問は、CRISPR 干渉ベースの方法を紹介します。エンハンサー i ターゲット遺伝子ヒストンの脱アセチル化を介してエンハンサーを非アクティブ化を達成するために Cas9、SID および KRAB、ヌクレアーゼ欠損に溶ける 2 つの抑圧的なドメインの使用になります。このプロトコルは利用ガイド対象地域の一時的な不活性化を有効にする Rna のトランスフェクションと組織文化の設定で刺激誘導型転写応答をブロックで特に効果的です。エンハンサー i は、ゲノムをターゲットとグローバル遺伝子発現への影響の両方非常に固有です。このプロトコルから得られた結果は、エンハンサーが遺伝子発現の出資の大きさと他の近くのエンハンサーでの貢献の影響に貢献しているかどうかを理解を助けます。

プロトコルで説明したワークフローの模式図を図 1に示します。エストロゲン調節遺伝子MMP17、チップ seq (図 2 a) で定義されている近隣 3 の結合部位を持っている近い ER バインド エンハンサーの貢献ガイド Rna を決定するため、地域ごとに設計されました。ガイド Rna シーケンスの各小胞体を周囲の 600-900 bp ウィンドウを設計するには、興味の結合部位は選択されガイド RNA デザイン プログラムに入れています。ガイド、その結果 RNA 配列 0-2 BLAT を使用して人間のゲノムに一直線に並んだサイト ターゲットを予測します。4 非重複ガイド Rna チップ seq によって定義される領域を指すと DNaseI の過敏症 (図 2 b) をターゲットに選ばれました。追加シーケンス (表 1) は、下流のクローン作成と結果 59 ヌクレオチド断片が命じられた容易に各端に追加されました。到着後、ガイド Rna は希釈され、サイト、および短い PCR によってプールだった実行ギブソン アセンブリ前に相同領域を追加できます。図 2 59 basepair の両端にシーケンスの 20 ヒトを追加"U6_internal"プライマー (表 1) を使用して短い PCR 後予想されるガイド RNA 製品ガイド RNA 断片、〜 100 basepair シーケンスの結果を示しています。ギブソン アセンブリこれらガイド RNA プールが細菌に変身した、プラスミド minipreps は、次の一日を用意しました。図 2 Dエンハンサー-i を使用して組み合わせ、エンハンサー解剖実験により, MMP17の近くに複数のエンハンサーを単独で対象との結果を示しています。エンハンサー i の対象となるサイトは、黒い六角形で示されます。示されているサイトをターゲット ガイド RNA プラスミド安定に発現する SID4X-dCas9-KRAB エストロゲンを奪われた石川細胞ラインに導入させた。2 日後はメディアが変更され、ピューロマイシン transfected セルの豊かを追加しました。次の日セルを 8 h 10 nM エストラジ オール投与収穫されました。RNA が分離され、ワンステップ qPCR を行った。この例ではサイト 1 と 2、 MMP17の完全なエストロゲン応答に必要なサイト 3 は (図 2 D、車線 ii 〜 iv) これらの条件の下で含まれません。2 または 3 サイトのみがアクティブなとき (vi と vii) エストロゲン応答は、サイトがないようアクティブ (viii)、これらのサイトが独立して貢献できないことを示唆しています。(V)、それ自体でいくつかの表現を貢献できるサイト 1、サイト 1 と 2 がアクティブなとき最大の活動が見られる (iv)。
同時に 4 つの異なる遺伝子の近く 10 エンハンサーを操作する (図 3 a) の複雑なプール ガイド Rna 42 エンハンサー ガイドと 16 のプロモーターのガイドを含む生成されました。ガイド RNA oligos 初期ガイド RNA 拡張子 PCR (ステップ 3.3) の前にプールと結果として得られる PCR の製品は精製されギブソンのアセンブリを使用して空ピューロマイシン U6 クローニング ベクトルと組み合わせます。次のギブソン アセンブリ複数の独立した変換は実行されメッキします。プレートは LB に盗用され、maxiprep の前に 2-4 時間を育つことができます。図 3Bは qPCR によるに遺伝子発現のこれらガイド RNA プールは安定に発現する SID4X-dCas9-KRAB エストロゲンを奪われた石川細胞ラインに導入され (図 2 D) 上記のように扱われるとき代表的な削減を示します。エンハンサー i からの削減は、推定標的遺伝子のプロモーターをターゲットによって得られるものに似ています。図 3は、エンハンサー i を用いたエストロゲン応答低減に関する Rna ガイドの希釈の効果を示しています。1:50 G0S2まだ近くエンハンサーをターゲット ガイド RNA プールの希釈生成遺伝子発現、エンハンサー i を 50 までを対象とする使用ことができることを示唆しているの大幅な削減は一度にサイトします。しかし、こと何百ものサイトの対象にはできません同時により敏感な検出方法を採用しない限りを示す、非アクティブ化、薄くことが。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> 図 1。プロトコル エンハンサー i. を使用して多重エンハンサー解剖図ガイド Rna (赤と青) は、e カリカリと UCSC のゲノムのブラウザーを使用して選択したを使用して設計されています。4 ガイド Rna にまたがる地域 (転写因子結合部位チップ seq で定義された) 選択されます。(赤と青) 関心領域にプールされてガイド RNA オリゴヌクレオチドは、ギブソン アセンブリおよび変換する前の相同領域 (オレンジ) を追加する PCR を受けます。SID4X-dCas9-KRAB を安定に発現する細胞株や SID4X-dCas9-KRAB プラスミドと共に野生型細胞に、結果プラスミド プールはリポフェクション経由で導入しました。ガイド RNA プラスミド プールは、一度に、または同時に複数のサイトを対象とする組み合わせで、1 つのサイトを対象とする個別にトランスフェクションすることができます。Transfected セルは、ガイド Rna を含むセルを豊かに抗生物質で治療されます。~ 72 h ポスト トランスフェクションでセルを収穫しています。QPCR、RNA シーケンスまたはチップ シーケンスの核酸を抽出できる<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> 図 2。RNA のデザインとエンハンサーの郭清MMP17のためのガイドです。(A)ゲノム ブラウザーのスクリーン ショット近く対象とする ER α バインド エンハンサー (グレー) MMP17.この図は、カールトン、らから変更されています。18. (B)ガイド RNA の結合サイト183 デザインします。チップ seq によって定義されている小胞体の結合部位は、ターゲット、および 4 ガイド Rna タイルをこの地域全体です。ガイド RNA デザインのターゲット シーケンスを定義する結合部位にまたがる、DNaseI 感度信号を使用もできます。チップ seq と DNaseI HS データの両方は、1 h. (C)代表的なガイド rna の相同領域を追加する短い PCR を受けたギブソン アセンブリの準備が 10 nM エストラジ オール石川細胞から得られました。(D) MMP17の相対的な表現は qPCR エンハンサー i と 8 h10 nM エストラジ オール処理で特定の地域のターゲット設定、次を介して測定。式は、エストラジ オールと扱われない細胞におけるMMP17のCTCFと表現のレベルに対して相対的です。Rna をターゲットのプロモーター制御ガイドIL1RN.すべての誤差範囲を表す SEM、二重アスタリスクを示すp &lt; 0.01 と単一アスタリスクを示すp &lt; t 検定で 0.05。この図は、カールトンから変更されているら。18.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> 図 3。エンハンサー i. をプールと同時に異なる遺伝子の近くの複数のエンハンサーをターゲット(A)結合部位とプールされたエンハンサー i における対象とするプロモーターの模式図。(B)式エンハンサー i プラスミド プール (緑)、プロモーター i プラスミド プール (青) または制御 gRNAs (ホワイト)18をトランスフェクトした石川セル E2 処理後の qPCR による測定に及ぼす影響。エンハンサー i すべての遺伝子に重要な減少が観察されます。この図は、カールトンから変更されたら。18. (C)石川細胞 E2 治療後G0S2発現量に及ぼす影響をトランスフェクトしたガイドG0S2のターゲット Rna の量が異なる。ガイド RNA の少量でも大幅な削減を見ることができる (1:50 希釈)、まで示唆 50 サイトが同時に対象とします。すべての誤差範囲を表す SEM、二重アスタリスクを示すp &lt; 0.01 と単一アスタリスクを示すp &lt; t 検定で 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>シーケンス</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。ガイド RNA 拡張機能とシーケンス、qPCR、融合タンパク質の検出に使用されるプライマー。

このプロトコルでは、デザインを多重化融合タンパク質として知られているエンハンサー干渉 (エンハンサー-i) SID4X-dCas9-KRAB にエンハンサーのターゲットを実行するために必要な手順について説明します。このプロトコルにより、遺伝子発現調節エンハンサーの同定と共通のターゲット遺伝子を調節するエンハンサー関係の解剖が容易になります。

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

この方法は、複数の遺伝子調節領域(エンハンサーとも呼ばれる)がどのように連携して転写を制御するかなど、ゲノミクスと遺伝子調節の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子調節に関与する領域を迅速に特定するために、複数の異なる遺伝子の近くにある複数のエンハンサーを同時にテストできることです。ガイドRNA設計を開始するには、まずテキストプロトコルに記載されているようにDNA配列を生成します。生成されたDNA配列にE-CRISPなどのプログラムを使用して、オフターゲットの少ないガイドRNAを見つけます。ガイドRNAは、S.pyogenes由来のdCas9のNGGの形をとるプロトスペーサー隣接モチーフの上流にある20ヌクレオチドで構成されています。E-CRISPのウェブサイトで、ドロップダウンメニューを使用して目的の生物を選択します。ゲノムアセンブリは、種名の右側に表示されます。[Input is FASTA sequence] ラジオ ボタンを選択します。上からFASTAシーケンスをコピーして、ダイアログボックスに貼り付けます。各シーケンスに FASTA ヘッダーが含まれていることを確認します。[medium] ラジオ ボタンを選択し、ドロップダウン メニューで [Single design] を選択します。「単一gRNA検索を開始」ボタンをクリックします。新しいブラウザタブが開き、結果が表示されます。「Download an Excel formulated tabular report for all query sequences together」ボタンをクリックして、候補シーケンスをダウンロードします。次に、UCSCゲノムブラウザを使用して、候補の完全長ガイドRNA配列をゲノムにBLATします。ブラウザで、UCSC ゲノム ブラウザの Web サイトに移動します。[ツール]セクションで、BLATという単語を見つけてクリックします。BLAT 検索ツールが開きます。BLAT 検索ゲノムテキストの下にあるドロップダウンメニューを使用して、目的の生物とゲノムアセンブリを選択します。E-CRISPで作成した表形式のレポートからガイドRNA配列をコピーし、ダイアログボックスに貼り付けます。各配列に一意のFASTAヘッダーがあることを確認してから、ダイアログボックスの下部にある[送信]をクリックします。BLAT検索結果ページには、各ガイドRNA配列のアラインメントが表示され、各行がアラインメントを表します。理想的には、各ガイドRNAに1つのアラインメントがあり、そのガイドRNAの一意性を示す必要があります。可能であれば、ゲノム内の複数の場所にマッピングするガイドは避けてください。関心領域内のガイドRNAの局在と分布を調べるには、クエリされたガイドRNAの1つのActionsセクションの下にあるブラウザリンクをクリックします。ゲノムブラウザが表示され、選択したガイドRNAを中心とします。ページ上部のズームアウトボタンを使用して、E-CRISPによって同定された他のガイドRNAの関心領域内の分布を視覚化します。目的領域全体に分布する4つの(できれば重複しない)ガイドRNAを選択します。関心領域が 600 塩基対を超える場合は、ガイドを 1 つまたは 2 つ追加することを検討してください。ホモポリマーの伸張性や極端なGC含量を持つガイドRNAは、ガイドRNAのクローニングプロセスを妨げ、ガイドRNAのターゲティング効率を低下させる可能性があるため、避けてください。ガイドRNAオリゴを最終濃度100マイクロモルの超純水で再構成します。各目的領域には、少なくとも4つの別々のガイドRNAオリゴが存在する必要があります。関心領域ごとに、関心領域に対応するすべてのオリゴのプールを作成します。エッペンドルフチューブで、各領域の個々の再構成ガイドRNAオリゴを5マイクロリットル組み合わせます。ボルテックスでプールをよく混ぜてから、1マイクロリットルを取り出し、このエロクワットを超純水で1〜200に希釈します。USICSプライマーを用いて短いPCRを行い、テキストプロトコールに詳述されているように、相同性領域をオリゴに結合します。各オリゴに約40塩基が添加され、両端にUSICスペクターとの相同性が十分に含まれる約100塩基対の生成物が得られます。次に、氷上でギブソンアセンブリ反応を設定します。20マイクロリットルの反応で、50ナノグラムの消化ベクターと7ナノグラムのインサートを使用します。また、50ナノグラムのベクターを使用して消化ベクターのみのGibson Assembly反応を設定し、インサートを水と交換します。ギブソンアセンブリ反応を摂氏50度で15分間インキュベートし、続いて摂氏4度で保持します。組み立てた製品を氷に移した後、氷上の超純水で1:4に希釈します。たとえば、5マイクロリットルのギブソンアセンブリ製品を15マイクロリットルの超純水に追加します。次に、希釈したGibson Assembly製品を変換します。高効率のコンピテントセルを氷上に落下させ、形質転換ごとに25マイクロリットルのエロコートを作ります。複数の部位を標的とする複雑なプールが必要な場合は、十分な数の細胞を異なるチューブに落下させて、複数の独立した形質転換を行います。形質転換細胞を50マイクロリットルにプレートし、プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。個々の部位を標的とするプールのミニプレップでは、アンピシリンまたはカルベニシリンを含む3〜5ミリリットルのLBブロスに細胞を直接入れます。細胞を250rpm、37°Cで振とうしながら一晩インキュベートします。大規模な図書館の場合は、プレートスクレーパーを使用して、個々のプレートからすべてのコロニーを1つのマキシプレップに収集します。これは、適切な抗生物質を含む約5ミリリットルのLBを15ミリリットルのファルコンチューブに注ぎ、コロニーをチューブにこすり落とすことによって促進できます。トランスフェクションの前日に、細胞を24ウェルプレートに30〜50%の密度でプレート化します。トランスフェクションを重複して実施できるように十分な細胞をプレート化し、コントロールガイドRNAでトランスフェクションするウェルを含めます。細胞のめっき後にプレートを静かに振ることにより、細胞がウェル全体に均一に分布していることを確認します。最初の15分間は5分ごとに振ってください。翌日、選択したトランスフェクション試薬の指示に従ってトランスフェクションを調製します。Ishikawa細胞の場合、24ウェルプレートの各ウェルに550ナノグラムの全プラスミドを使用します。プラスミドを無血清培地で最終濃度020μg/miliLに希釈します。DNA1マイクログラムにつき3マイクロリットルのトランスフェクション試薬を使用し、穏やかにボルテックスし、室温で5〜10分間インキュベートします。各ウェルに25マイクロリットルの最終混合物を追加します。1%β-メルカプトエタノールを含む十分な量の溶解バッファーを調製します。真空吸引器を使用してメディアを吸引します。細胞を等量の1x PBSで一度洗浄し、吸引してできるだけ多くのPBSを除去します。マルチチャンネルピペットを使用して、300マイクロリットルの溶解BME溶液を各ウェルに加えます。溶解液を8〜10回ピペットで上下させ、氷上のディープウェルプレートまたは1.7ミリリットルのエッペンドルフチューブに移します。RNAはすぐに抽出することも、ライセートを摂氏マイナス80度で凍結して将来の処理を行うこともできます。ガイドRNAの設計は、MMP17の近くの3つの転写因子結合部位について示されています。標的領域は、ChiP-seqで定義されるERαの結合部位であり、4つのガイドRNAはこの領域を横切ってタイリングします。ここに示されているのは、USICの内部プライマーを使用した短時間のPCR後に予想されるガイドRNA産物です。この反応により、59塩基対ガイドRNAフラグメントの各末端に20塩基対の配列が追加され、約100塩基対の配列が得られます。MMP17でのEnhancer-I実験からの定性的PCR結果が示されています。Enhancer-Iが対象とするサイトは、黒い六角形で示されます。サイト1と2はMMP17の完全なエストロゲン反応に必要ですが、サイト3は寄与しません。サイト1はそれ自体で何らかの表現に貢献できますが、最大の活動はサイト1と2がアクティブになっているときに見られます。目的の細胞株に最適化されると、この手法は適切に実施されれば、5〜7日で実行できます。このビデオを見れば、Enhancer-IのガイドRNAの設計方法、ガイドRNAの複雑なプールの作成とトランスフェクション、トランスフェクションされた細胞の採取方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、無菌の組織培養環境を維持し、RNaseおよびDNaseを含まない材料を使用することが重要です。この手順に続いて、ChiP-seqやRNA-seqなどの他の方法を使用して、Enhancer-Iがゲノムのどこに結合しているか、それが全体的な遺伝子発現にどのように影響しているかなどの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、研究者がエピソームレポーターを使用する代わりに、ヒトゲノムの内因性遺伝子座でエストロゲン誘発性遺伝子調節を探索する道を開きました。哺乳類の組織培養環境での作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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細胞を用いた多重 CRISPR ベースエンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

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