細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

この方法は、複数の遺伝子調節領域(エンハンサーとも呼ばれる)がどのように連携して転写を制御するかなど、ゲノミクスと遺伝子調節の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子調節に関与する領域を迅速に特定するために、複数の異なる遺伝子の近くにある複数のエンハンサーを同時にテストできることです。ガイドRNA設計を開始するには、まずテキストプロトコルに記載されているようにDNA配列を生成します。

生成されたDNA配列にE-CRISPなどのプログラムを使用して、オフターゲットの少ないガイドRNAを見つけます。ガイドRNAは、S.pyogenes由来のdCas9のNGGの形をとるプロトスペーサー隣接モチーフの上流にある20ヌクレオチドで構成されています。E-CRISPのウェブサイトで、ドロップダウンメニューを使用して目的の生物を選択します。

ゲノムアセンブリは、種名の右側に表示されます。[Input is FASTA sequence] ラジオ ボタンを選択します。上からFASTAシーケンスをコピーして、ダイアログボックスに貼り付けます。

各シーケンスに FASTA ヘッダーが含まれていることを確認します。[medium] ラジオ ボタンを選択し、ドロップダウン メニューで [Single design] を選択します。「単一gRNA検索を開始」ボタンをクリックします。

新しいブラウザタブが開き、結果が表示されます。「Download an Excel formulated tabular report for all query sequences together」ボタンをクリックして、候補シーケンスをダウンロードします。次に、UCSCゲノムブラウザを使用して、候補の完全長ガイドRNA配列をゲノムにBLATします。

ブラウザで、UCSC ゲノム ブラウザの Web サイトに移動します。[ツール]セクションで、BLATという単語を見つけてクリックします。BLAT 検索ツールが開きます。

BLAT 検索ゲノムテキストの下にあるドロップダウンメニューを使用して、目的の生物とゲノムアセンブリを選択します。E-CRISPで作成した表形式のレポートからガイドRNA配列をコピーし、ダイアログボックスに貼り付けます。各配列に一意のFASTAヘッダーがあることを確認してから、ダイアログボックスの下部にある[送信]をクリックします。

BLAT検索結果ページには、各ガイドRNA配列のアラインメントが表示され、各行がアラインメントを表します。理想的には、各ガイドRNAに1つのアラインメントがあり、そのガイドRNAの一意性を示す必要があります。可能であれば、ゲノム内の複数の場所にマッピングするガイドは避けてください。

関心領域内のガイドRNAの局在と分布を調べるには、クエリされたガイドRNAの1つのActionsセクションの下にあるブラウザリンクをクリックします。ゲノムブラウザが表示され、選択したガイドRNAを中心とします。ページ上部のズームアウトボタンを使用して、E-CRISPによって同定された他のガイドRNAの関心領域内の分布を視覚化します。

目的領域全体に分布する4つの(できれば重複しない)ガイドRNAを選択します。関心領域が 600 塩基対を超える場合は、ガイドを 1 つまたは 2 つ追加することを検討してください。ホモポリマーの伸張性や極端なGC含量を持つガイドRNAは、ガイドRNAのクローニングプロセスを妨げ、ガイドRNAのターゲティング効率を低下させる可能性があるため、避けてください。

ガイドRNAオリゴを最終濃度100マイクロモルの超純水で再構成します。各目的領域には、少なくとも4つの別々のガイドRNAオリゴが存在する必要があります。関心領域ごとに、関心領域に対応するすべてのオリゴのプールを作成します。

エッペンドルフチューブで、各領域の個々の再構成ガイドRNAオリゴを5マイクロリットル組み合わせます。ボルテックスでプールをよく混ぜてから、1マイクロリットルを取り出し、このエロクワットを超純水で1〜200に希釈します。USICSプライマーを用いて短いPCRを行い、テキストプロトコールに詳述されているように、相同性領域をオリゴに結合します。

各オリゴに約40塩基が添加され、両端にUSICスペクターとの相同性が十分に含まれる約100塩基対の生成物が得られます。次に、氷上でギブソンアセンブリ反応を設定します。20マイクロリットルの反応で、50ナノグラムの消化ベクターと7ナノグラムのインサートを使用します。

また、50ナノグラムのベクターを使用して消化ベクターのみのGibson Assembly反応を設定し、インサートを水と交換します。ギブソンアセンブリ反応を摂氏50度で15分間インキュベートし、続いて摂氏4度で保持します。組み立てた製品を氷に移した後、氷上の超純水で1:4に希釈します。

たとえば、5マイクロリットルのギブソンアセンブリ製品を15マイクロリットルの超純水に追加します。次に、希釈したGibson Assembly製品を変換します。高効率のコンピテントセルを氷上に落下させ、形質転換ごとに25マイクロリットルのエロコートを作ります。

複数の部位を標的とする複雑なプールが必要な場合は、十分な数の細胞を異なるチューブに落下させて、複数の独立した形質転換を行います。形質転換細胞を50マイクロリットルにプレートし、プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。個々の部位を標的とするプールのミニプレップでは、アンピシリンまたはカルベニシリンを含む3〜5ミリリットルのLBブロスに細胞を直接入れます。

細胞を250rpm、37°Cで振とうしながら一晩インキュベートします。大規模な図書館の場合は、プレートスクレーパーを使用して、個々のプレートからすべてのコロニーを1つのマキシプレップに収集します。これは、適切な抗生物質を含む約5ミリリットルのLBを15ミリリットルのファルコンチューブに注ぎ、コロニーをチューブにこすり落とすことによって促進できます。

トランスフェクションの前日に、細胞を24ウェルプレートに30〜50%の密度でプレート化します。トランスフェクションを重複して実施できるように十分な細胞をプレート化し、コントロールガイドRNAでトランスフェクションするウェルを含めます。細胞のめっき後にプレートを静かに振ることにより、細胞がウェル全体に均一に分布していることを確認します。

最初の15分間は5分ごとに振ってください。翌日、選択したトランスフェクション試薬の指示に従ってトランスフェクションを調製します。Ishikawa細胞の場合、24ウェルプレートの各ウェルに550ナノグラムの全プラスミドを使用します。

プラスミドを無血清培地で最終濃度020μg/miliLに希釈します。DNA1マイクログラムにつき3マイクロリットルのトランスフェクション試薬を使用し、穏やかにボルテックスし、室温で5〜10分間インキュベートします。各ウェルに25マイクロリットルの最終混合物を追加します。

1%β-メルカプトエタノールを含む十分な量の溶解バッファーを調製します。真空吸引器を使用してメディアを吸引します。細胞を等量の1x PBSで一度洗浄し、吸引してできるだけ多くのPBSを除去します。

マルチチャンネルピペットを使用して、300マイクロリットルの溶解BME溶液を各ウェルに加えます。溶解液を8〜10回ピペットで上下させ、氷上のディープウェルプレートまたは1.7ミリリットルのエッペンドルフチューブに移します。RNAはすぐに抽出することも、ライセートを摂氏マイナス80度で凍結して将来の処理を行うこともできます。

ガイドRNAの設計は、MMP17の近くの3つの転写因子結合部位について示されています。標的領域は、ChiP-seqで定義されるERαの結合部位であり、4つのガイドRNAはこの領域を横切ってタイリングします。ここに示されているのは、USICの内部プライマーを使用した短時間のPCR後に予想されるガイドRNA産物です。

この反応により、59塩基対ガイドRNAフラグメントの各末端に20塩基対の配列が追加され、約100塩基対の配列が得られます。MMP17でのEnhancer-I実験からの定性的PCR結果が示されています。Enhancer-Iが対象とするサイトは、黒い六角形で示されます。

サイト1と2はMMP17の完全なエストロゲン反応に必要ですが、サイト3は寄与しません。サイト1はそれ自体で何らかの表現に貢献できますが、最大の活動はサイト1と2がアクティブになっているときに見られます。目的の細胞株に最適化されると、この手法は適切に実施されれば、5〜7日で実行できます。

このビデオを見れば、Enhancer-IのガイドRNAの設計方法、ガイドRNAの複雑なプールの作成とトランスフェクション、トランスフェクションされた細胞の採取方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、無菌の組織培養環境を維持し、RNaseおよびDNaseを含まない材料を使用することが重要です。この手順に続いて、ChiP-seqやRNA-seqなどの他の方法を使用して、Enhancer-Iがゲノムのどこに結合しているか、それが全体的な遺伝子発現にどのように影響しているかなどの追加の質問に答えることができます。

その開発後、この技術は、研究者がエピソームレポーターを使用する代わりに、ヒトゲノムの内因性遺伝子座でエストロゲン誘発性遺伝子調節を探索する道を開きました。哺乳類の組織培養環境での作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。