ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

このプロトコルは、hPSCにおける迅速なゲノム編集のためのiCRISPRプラットフォームを確立する方法と、ヒト膵臓の発達と疾患を研究するために、hPSCに向けられた膵臓分化を持つゲノム編集ラインを組み込む方法を示しています。これらの方法は、正常な膵臓の発達の遺伝的制御や糖尿病の分子基盤など、ヒトの膵臓発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、hPSCに関心のある遺伝子を効率的に改変し、これらの改変細胞株をヒト膵臓の発達や疾患のin vitroでの研究に使用できることです。

ヒトビトロネクチンをコーティングした切断皿上で、化学的に定義されたフィーダーフリーの条件でhPSCを培養します。エレクトロポレーションの前日に、培地交換中に10マイクロモルのROCK阻害剤を追加します。エレクトロポレーション当日は、ビトロネクチンをコーティングした10cmの皿を事前に用意してください。

次に、細胞から培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで1回洗浄し、37°Cの1X解離試薬で細胞を約3分間処理します。次に、細胞が剥離する前に解離試薬を吸引し、10.5ミリリットルの完全培地を追加します。穏やかなピペッティングを使用して単一細胞懸濁液を形成してから、遠心チューブに移します。

自動セルカウンターを使用して、500マイクロリットルの細胞懸濁液で細胞カウントを行います。次に、hPSCをGの200倍で5分間ペレット化します。細胞を1ミリリットルあたり10〜6細胞の12.5倍で冷PBSに再懸濁し、800マイクロリットルの容量に分注します。

プラスミドを各800マイクロリットルhPSC懸濁液に加え、よく混合します。混合物を0.4cmのエレクトロポレーションキュベットに移し、約5分間氷上に保ちます。250ボルトと500マイクロファラッドのエレクトロポレーションシステムを使用してセルをエレクトロポレーションします。

ゲノム編集には、健康で増殖しているhPSCを使用することが重要です。エレクトロポレーション後、細胞を5ミリリットルの予熱済み完全培地を入れた15ミリリットルの円錐管に移し、細胞をペレット化します。細胞を10マイクロモルのROCK阻害剤を含む10ミリリットルの完全培地に再懸濁し、各エレクトロポレーションから10〜6番目の細胞を1回、10の2.5倍を6番目の細胞に、10の5倍を6番目の細胞に、10〜6番目の細胞に5回プレートします。これにより、プレートの少なくとも1つがピッキングに十分な単一細胞コロニーを持つようになります。

細胞を摂氏37度で培養します。2日目に、1ミリリットルあたり500マイクログラムのG418硫酸塩を含む培地を追加して、ネオマイシンの選択を開始します。6日目に、1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシン二塩酸塩を含む培地を追加して、ピューロマイシンの選択を開始します。

10日目から12日目には、hPSCシングルセルコロニーの直径は1〜2ミリメートルに達します。この時点で、実体顕微鏡で12〜24個のコロニーを選択します。200マイクロリットルのピペットチップを使用してhPSCコロニーを機械的に分解し、細胞を直接ビトロネクチンでコーティングした24ウェルプレートに移します。

ガイドRNAトランスフェクションの24時間前に、iCas9 hPSCをドキシサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムで処理します。トランスフェクションの日には、ビトロネクチンでコーティングされた24ウェルプレートを調製し、前回と同様に1X dissociation reagentを使用してiCas9細胞を単一細胞に解離します。次に、細胞をGの200倍で5分間ペレット化し、細胞を1ミリリットルあたり2マイクログラムのドキシサイクリンおよび10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した完全な培地で10〜6番目の細胞の0.5倍で再懸濁する。

再懸濁した細胞の500マイクロリットルを24ウェルプレートの個々のウェルにプレート化します。各ガイドRNAについて、以下のトランスフェクション混合物を作製します。混合A、50マイクロリットルの還元血清培地と1マイクロリットルのガイドRNA

混合B、50マイクロリットルの還元血清培地と3マイクロリットルのトランスフェクション試薬。ミックスAとBを混ぜ合わせて100マイクロリットルの混合物を作り、室温で5分間インキュベートします。50マイクロリットルの混合物を24ウェルプレートの複製ウェルの細胞に加え、よく混合します。

4日後、ゲノムDNAを抽出し、ガイドRNAターゲティング配列に隣接する標的領域をPCR増幅し、T7E1消化を使用して編集効率を推定します。播種から2日後に細胞が80%のコンフルエント度に達した時点で、hPSC株の分化を開始します。微分デイゼロ媒体を追加し、ここに示す式を使用してメディアを毎日変更します。

10日目に、細胞のサブセットを免疫蛍光染色することにより、後の膵臓前駆細胞PP2マーカー、PDX1、およびNKX6.1を調べます。次に、まずPP2細胞を10マイクロモルのROCK阻害剤で4時間処理することにより、気液界面培養に進みます。インキュベーション時間が経過したら、以前と同様に細胞を解離します。

分化の気液界面段階での播種のための細胞生存率を最大化するために、解離試薬処理の期間を最小限に抑えます。細胞が分離する前に解離試薬を吸引します。次に、10ミリリットルのブーラー培地をプレートに加え、ピペッティングで静かに上下させてPP2細胞を単一細胞に分散させます。

単一細胞懸濁液を回収します。セル番号をカウントし、セルをペレット化します。細胞ペレットをS5分化培地に再懸濁した後、トランズウェルインサートフィルターで1スポットあたり5〜10マイクロリットルの細胞をスポットします。

各トランズウェルインサートの底部にS5培地を添加し、免疫蛍光染色により膵臓内分泌マーカーが検出可能になるまで培地交換とともにインキュベートします。この図は、hPSCにおけるiCRISPRを介した非相同末端結合を示しています。遺伝子ノックアウトは、選択プロセスが関与しないため、非常に効率的であり、20%から50%のビアレル変異体を容易に達成できます。

効率的かつ正確な遺伝子改変のために、ガイドRNAは、赤で示されている特定の配列変化を持つ一本鎖DNAドナーとコトランスフェクトされます。多くの場合、修飾対立遺伝子の再切断を防ぐために、PAM配列にサイレント変異を含めることをお勧めします(ここでは緑色で示されています)。このシステムにより、所望の相同性がもたらされた修復媒介ゲノム修飾を有するクローンの約10%を、両対立遺伝子に追加の変更を加えることなく達成することができます。

一度習得すれば、新しいiCas9 hPSCラインを確立するのに2か月もかかりません。その後、1ヶ月から2ヶ月以内に様々なhPSC変異コロニー株を作製することができます。hPSC遺伝子変異株の作製後、in vitroで変異細胞株を膵臓β様細胞に段階的に分化させることで、これらの変異の影響を受ける特定の発生過程を研究することができ、根本的な疾患メカニズムの理解を深めることができます。