Name: ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶiCRISPRプラットフォームによるヒト多能性幹細胞のゲノム編集と膵臓前駆細胞への指向性分化法。遺伝子変異細胞系を用いてヒト膵臓発生と糖尿病の分子基盤を解明する強力な手法です。

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この作品は、NIH / NIDDK（R01DK096239）とニューヨーク州の幹細胞科学（NYSTEM C029156）によって部分的に資金を供給されました。 ZZはスローンケタリング研究所の幹細胞生物学のためのセンターからNYSTEMポスドクフェローシップによってサポートされていました。

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著者らは、開示することは何もありません。

生成突然変異系統のための時間に関する検討事項ゲノム編集のためのCRISPR / CASシステムに基づいて、最近のアプローチが成功した標的につながっているが、より効果的かつ普遍的なプラットフォームは、遺伝子機能の大規模解析のために好ましいであろう。 iCRISPRプラットフォームは利息5、9のいずれかの遺伝子に変異を導入するための迅速かつ効率的な方法を提供しています。まず、PCRベースのgRNA合成方法は、時間のかかるクローニングステップなしで一日に配列形式でgRNAs数百の製造を可能にします。第二に、iCas9 hPSCsにおけるドキシサイクリン誘導性Cas9発現と、gRNAトランスフェクションを伴うステップは仕事の最小限の量を必要とし、したがって、複数のgRNAターゲッティング実験を同時に行うことができます。我々のシステムの分析で達成第三に、高いターゲティングによる効率〜24 - トランスフェクトgRNAあたり48コロニーがsuffでなければなりません効率は、標的遺伝子座に依存して変化するがicientは、単一の遺伝子のための複数の1アレル及び対立遺伝子変異体系統を確立します。訓練を受けた個人は、機械的に、一気に384コロニー（4×96ウェルプレート）を選択するために解剖顕微鏡下で約4時間を取るべきであることが可能であるので、訓練を受けた個人は、内12の遺伝子に影響する変異株を作製することが期待できます1から2ヶ月。短時間でHPSC変異体の合理化された世代は発達過程9を規制する 、互いに相互作用する転写因子および/またはシグナル伝達経路成分の配列の体系的な分析を可能にします。また、効率的な多重遺伝子ターゲティングは、複雑な人間の形質の根底にある遺伝的相互作用を調査への扉を開きます。 正確な遺伝子改変の生成簡単にアクセスできる体細胞型からの患者固有のiPS細胞の誘導<html> sおよび疾患関連細胞型への分化は、疾患関連変異の機能的検証のための素晴らしい機会を提供します。しかし、個体間の遺伝的背景にはかなりのばらつきに、患者からiPS細胞間および健康なドナーからの直接比較は1つが、背景効果から疾患の表現型を区別することができない場合があります。したがって、バック野生型配列へ病変異を補正して同系制御性IPSCを生成する等25,26によって提案されているように、野生型HPSC背景に患者特異的変異を導入することが必要です。機能喪失（ヌル）の変異に加えて、一つは今より正確に、hypermorphic低形質、neomorphic、またはドミナントネガティブ患者を含むhPSCsにおける内因性遺伝子座の中に患者特異的配列改変を導入することにより病気のメカニズムを分析することができます突然変異。 それはNHEJ媒介DNA修復よりもはるかに効率が低いので。修理テンプレートの存在下で、DSB修復のためのHDRを採用して正確な遺伝子改変ntent &quot;&gt;、患者特異的変異、薬剤選択カセット、および相同性アームを含むドナープラスミド以前に患者特異的変異の薬剤選択と検証した後、第二段階は、一般的に薬剤選択カセットを除去するために必要である。最も広く使用されているのCre-loxP配列とFLP-FRTシステムは残しながら。修理テンプレート2として使用されています内因性遺伝子座における残留シーケンス、のpiggyBacトランスポゾンの使用は、薬剤選択カセット27のシームレスな除去を可能にした。さらに最近では、短い一本鎖DNAテンプレートはまた、操作されたDNAエンドヌクレアーゼ28で効率的なHDRをサポートすることが示されている。ドナープラスミドと比較すると、一本鎖DNAを直接合成し、従って、時間のかかるクローニングステップを回避することができる。ここで、であるました同時トランスフェクションgRNAと相同性指向性修復を誘導するssDNA鋳型によって、iCRISPRが高効率で特定のヌクレオチド修飾を導入することができる、ことを示しアン。これは、タンパク質の機能的ドメイン内だけでなく、ヒト疾患変異をモデル化し、潜在的な治療的介入のためのこれらの疾患関連変異を補正するための必須のヌクレオチドの役割を解剖するだけでなくするために重要です。各糖尿病などの複雑かつ多遺伝子疾患をモデル化し、複数の配列変異体に関連付けられている感受性遺伝子座の数が多いために遺伝学者のための課題でした。 iCRISPRプラットフォームは、対立遺伝子シリーズの迅速な生成のためにまたは多重化可能遺伝子ターゲティングを許容するように、個別にまたは同質遺伝子的背景との組み合わせで、複数の疾患関連遺伝子座の調査を容易にすることができます。 効率およびオフターゲット効果をターゲット我々は持っています<html> T7E1とRFLPアッセイの結果及び配列決定により同定された変異体のライン数との間に良好な相関関係を発見しました。これは、クローン株の確立と並行して、これらのアッセイを行うことの重要性を強調しています。得ターゲティング効率は、ゲノム遺伝子座に依存して変化し得るが、ほとんどの単一遺伝子ターゲティング実験において、20 -クローンの60％が（フレームおよびフレームシフト変異を含む）変異した対立遺伝子9の両方で発見されました。多重遺伝子ターゲティングを行った場合には、5〜10％の効率で三重二対立遺伝子突然変異体のクローンが5を得ました。 10％5 -いくつかの遺伝子の一本鎖DNA媒介HDRはまた、ホモ接合ノックイン1の範囲のクローンを得るための効率で、正確な遺伝的変化を得るために行われました。 hPSCsにCRISPR / CASでの作業、同じgRNA標的配列を共有していない潜在的なオフターゲットサイト内の任意の突然変異がまだ検出されるべきです小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 5、9、12。最近の研究で行われる全ゲノム配列決定はまた、CRISPR / Casの29を使用して生成されたクローンHPSCラインに実質的なオフターゲット変異を同定するために失敗しました。それにもかかわらず、オフターゲット効果部位での変異によって導入表現型を交絡の潜在的な影響を最小限にするために、同じ遺伝子内の異なる配列を標的とする少なくとも2つの独立しgRNAsを使用して独立した変異株を作製することが提案されています。別gRNAsを使用して生成された複数のラインで観察された類似の表現型は、主に表現型がオフターゲット効果から来ている可能性を除外することができました。 フィーダー依存独立した文化とターゲット対 HPSC培養のための従来の方法は、動物のPRODを含み、血清または血清代替を含む培地中でフィーダー細胞上のそれらの維持・拡大を伴いますウシ血清アルブミンのようなUCTS。フィーダー細胞、血清、血清代替品、およびアルブミンすべては、複雑な、未定義の成分が含まれており、かなりのバッチ可変性を示します。無フィーダーと化学的に定義された条件への適応が大幅HPSC維持のための努力を低減し、より重要なのは、分化実験の一貫性を向上させます。現時点では、完全に定義された培養条件30で培養hPSCsのゲノム編集手順を説明し、非常に少数の研究があります。我々はgRNAトランスフェクションおよびクローン堆積は、フィーダー依存培養条件と比較して、無フィーダー条件で行ったときの効率をターゲットに高いCRISPRを発見しました。これはコロニー形成のためのトランスフェクションおよび単一細胞播種後に増加した細胞の生存のためであると考えています。また、フィーダー細胞は、以前にそれによってトランスフェクション効率を低下させる、トランスフェクション試薬を隔離することが示されています。 結合ダイレクト差別とゲノムの編集前分化プロトコルはインスリン陽性細胞のわずかな部分のみが得られている、の大半はpolyhormonalたと胎児の内分泌細胞23に似ていました 。最近の進歩は、より成熟したグルコース応答性β様細胞16、17、19、20にhPSCsの分化を可能にしました。私たちは日常的にHUES8 hPSCs 9を用いて、少なくとも75％の胚体内胚葉細胞、40％のPDX1 + NKX6.1 +膵臓前駆細胞、および約20％のNKX6.1 + CPEP +グルコース応答性β様細胞を得ることができます。 iCRISPRゲノム編集システムと組み合わせると、このより堅牢な分化プロトコルは、膵臓分化の膵臓前駆細胞および内分泌段階に不可欠である転写因子の解析を容易にしました。これは、ようになりますそれが可能な、将来の研究では、糖尿病9の根底にあるメカニズムへの機能検証や調査のための候補疾患遺伝子の大規模な数を調べました。 将来のアプリケーションや行き方我々のiCRISPRシステムは長いドナーDNAテンプレートをコードするタンパク質タグまたは蛍光レポーター12を使用して標的とHDR媒介遺伝子を通じて、このようなレポーター対立遺伝子の作成など、より複雑なゲノムの改変、の生成を容易にすることができます。我々は、システムにおいて達成効率を標的ハイCRISPRに、このプロセスはさらに、薬剤選択12を必要とせず、hPSCsに行うことができることを示しています。さらに、標的化多重遺伝子は、我々は、このようなワーク31の第一の例であると考えて我々の最近の研究で示されているように、複雑なヒト疾患の根底にある遺伝的相互作用を調査するために使用することができます。 iCRISPRはまた、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節領域の欠失を作成することにより、いずれかの非コードRNAまたは遺伝子における遺伝子調節制御を理解するために使用することができます。効率iCRISPRを使用して調節変異体を生成するために、gRNAsを含む、DNA結合タンパク質の結合部位を破壊するように設計されたが、基本転写機構または組織特異的な転写因子に限定されないことができます。 ssDNA鋳型媒介HDRは、特定のタンパク質結合部位を突然変異させるために使用することができます。最後に、我々は、in vitroでの分化プロトコルと組み合わせた場合、さらに最適化が多能性表現型または疾患の表現型のより高いスループット遺伝子解析のためのhPSCsでiCRISPRプラットフォームの使用を可能にするであろうことを想定しています。これらのiCRISPR媒介の研究は、候補疾患関連遺伝子およびそれらの機能的関連性の研究のより迅速な同定を可能にすることができます。

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）自己複製の両方三胚性生殖系列の全ての誘導体を生じる能力を有します。彼らは人間の発達のコンテキストで細胞プロセスを再現するユニークなプラットフォームとして機能することにより、細胞置換療法と病気のモデリングのための貴重なリソースを提供しています。彼らはまた、スケーラブル、高スループット分析のための実験的な細胞の供給源です。効率的な遺伝子改変ツールの欠如および培養皿に複雑な胚の発達段階を反復することの困難：しかし、進展があるため、2つの主要な課題に制限されていました。 遺伝子改変は、通常の開発と疾患における遺伝子機能を研究するための不可欠なツールです。相同組換えを介してのアプローチを標的古典的な遺伝子が証明されているがしかし、マウス胚性幹細胞（たmESC）における遺伝子機能を分析するための強力なツール1は、このアプローチであることがhPSCs 2、3に適用された場合、非常に非効率的となっています。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、およびクラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPRは関連を含む実験使用に自然からプログラマブル、サイト固有のヌクレアーゼ、最近の活発なアク（CAS）システム4は 、ゲノム工学はhPSCsを含め、生物および細胞株の広い範囲で非常に容易課題となっていることを意味します。これらの遺伝子の編集ツールは、このようなCas9エンドヌクレアーゼとキメラヌクレアーゼは、いずれかの非相同を活性化するために、正確な位置での二重鎖切断（DSB）を誘導する内因性DNA修復機構をトリガすることによって遺伝子改変の全範囲を可能にすることができるという事実を利用します結合（NHEJ）終了または相同性指向修理（HDR）。両方のメカニズムはEITHを誘導することによって遺伝子操作のために利用することができますえーランダム挿入および欠失変異（インデル; NHEJ を介した）は 、ヒト疾患のモデリングのための患者の変異を再現したり、遺伝子治療のための疾患を引き起こす変異を修正するために、遺伝子の対立遺伝子、または（HDR経由で）正確なヌクレオチド置換を無効にフレームシフト変異を作成します。 DNA標的認識を指定するDNAの切断と変数のCRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化（tracrRNA）二重のために必要な一定のRNA誘導型Cas9エンドヌクレアーゼ：CRISPR / Casの媒介ゲノム工学は、2つのコンポーネントが必要です。 crRNA / tracrRNA二本鎖は、より効率的に5、6、7働くことが見出されている単一のキメラガイドRNA（gRNA）で置き換えることができます。 CRISPR / Cas9システムが最も実験的な生物および細胞株に適合されているが、Cas9およびgRNAの送達および発現は有意に変化し、さらに阿智に最適化される必要がありますhPSCs 8を含む多くのシステムでの前夜効率的なゲノム編集。効率的なゲノム編集プラットフォーム、iCRISPRは、hPSCs 5に設立されました。このシステムでは、TALEN媒介アプローチは、テトラサイクリン応答エレメント（TREと逆テトラサイクリン制御トランス（M2rtTA）や他とのトランス 、一つの対立遺伝子の 「導入遺伝子セーフハーバー軌跡」AAVS1の両方の対立遺伝子を標的とするために使用されてきました）hPSCsにおけるCas9（iCas9）の発現を駆動します。確立されたクローン系（iCas9 hPSCs）では、Cas9は非常にドキシサイクリン処理で表現されています。一方、、その小さなサイズ（100ヌクレオチド）に、単一または複数のgRNAsは、簡単に高効率でiCas9 hPSCsに送達することができ、部位特異的切断のためのCas9を指示することができ、効率的なNHEJ媒介遺伝子破壊を可能にするだけでなく、HDR-媒介します短い一本鎖DNA（ssDNA）ドナーテンプレートの存在下での正確なヌクレオチド修飾。 iCRISPRシステムは、することができます成功し、9が重要な発生遺伝子5で二対立遺伝子（ホモ接合または複合ヘテロ接合）またはヘテロ接合機能喪失型変異を有する疾患模倣HPSC株のパネルを生成するために使用されます。グループの数はhPSCsにCRISPR / CASを使用して、効率的な遺伝子編集を報告しているが、成功は技術的に熟達研究室の小さな数に制限されたままです。 iCRISPRプラットフォームは、異なるスキルレベルの研究者による日常的遺伝子編集のための効率的かつシンプルなソリューションを提供しています、そして、それは既に公開された私たちのグループによる研究およびその他9、10、11、12の数で使用されています。このアプローチは、さらにdCas9-KRAB 13の発現に基づいて、誘導性サイレンシングに拡張されています。 ゲノム編集テクノの進展に伴いでれっと、大幅な改善もHPSCのメンテナンスと向かう分化に達成されています。 hPSCsのための培養条件は、定義された細胞外マトリックス成分に無フィーダー条件に、かつ化学的に培地条件14を定義したために、複雑な培地製剤から照射したマウス胚性線維芽細胞（iMEF）フィーダ依存から進化してきました。このような改善はiMEF準備とノックアウト血清代替成分中のバッチ間の差異に起因するhPSCsのばらつきを低減し、ひいてはHPSCの分化のためのより再現環境を提供しています。また、改良されたヒト胚発達を支配するシグナル伝達経路についての知識、ならびにハイスループット薬物スクリーニングの発見は、改良された分化プロトコル15、16、17、18につながっています。これらのプロトコルは、より密接VIVに模倣します発達段階oおよび密接にそれらのインビボの対応を再現細胞型を生成します。膵臓系統へのHPSCの分化のために、初期のプロトコルは比較的よく早期膵臓の開発を模倣するが、最終的に未熟な胎児の表現型のものであり、グルコース刺激に乏しい回答polyhormonalβ細胞を生成しました。最近の進歩は16、17、19、20は、このように形成し、monohormonalβ細胞のさらなる成熟として後でイベントを調査するために私達を許可して、グルコース応答性膵β細胞様細胞の生成のために許可されています。 ここでは、詳細グルコース応答pancrに向かってHPSCベースのインビトロ分化プラットフォームとiCRISPRシステムを組み合わせることにより、膵臓の開発の研究のためのゲノム修飾されたラインの適用eaticβ様細胞。改良されたHPSCの分化プロトコルを備えた強力なゲノム編集ツールのこの結合は、疾患の因果関係を検証するための需要を満たすために必要なスピードとスケールを提供していますが、また正常な発達と病気9の根底にある転写制御へのさらなるメカニズムの調査のための洗練された遺伝子操作を可能にするだけでなく、 。

<table><tbody><tr><td>既知化合物(E8)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1517001</td><td>エッセンシャル 8 基礎培地およびエッセンシャル 8 サプリメント付属</td></tr><tr><td>打ち切換えヒト型ビトロネクチン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤 Y-27632</td><td>セレックケミカルズ</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>解離試薬(TrypLE Select 酵素)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィック</td><td>12563029</td><td>1x、動物由来不使用、組換え酵素</td></tr><tr><td>G418 硫酸塩</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10131035</td><td>ジェネティクス 選択的抗生物質</td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>ピューロマイシン 選択的抗生物質</td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transcriptionキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 転写クリーンアップキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリンヒクレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985062</td><td>還元血清培地</td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMAX トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy血液&ティッシュキット</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>ゲノムDNA抽出キット</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR 培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>公開された製剤でカスタムメイド (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>L-グルタミンサプリメント (GlutaMAX)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biological Laboratories</td><td>7500855</td><td>脂肪酸フリー</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>GSK-3阻害剤</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>ビタミンC</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R&D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>ヘッジホッグ阻害剤</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>レチノイン酸</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>BMP 阻害剤</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Wnt 拮抗薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD ミリポア</td><td>565740-1MG</td><td>PKC 活性化剤</td></tr><tr><td>3,3',5-トリヨード-L-チロニン (T3)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>エンツォ ライフサイエンス</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5 阻害剤</td></tr><tr><td>II ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD ミリポア</td><td>565789</td><td>ガンマ セクレターゼ阻害剤 XX、NOTCH シグナル伝達阻害剤</td></tr><tr><td>N-Cys (N-アセチル システイン)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>トロロックス</td><td>EMD ミリポア</td><td>648471</td><td>ビタミンEアナログ</td></tr><tr><td>R428</td><td>セレック ケミカルズ</td><td>S2841</td><td>AXL 受容体チロシンキナーゼインヒビター</td></tr><tr><td>24 mm トランズウェル インサート付き</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell エレクトロポレーションシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 エンドヌクレアーゼ I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>バッファー 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>長鎖オリゴヌクレオチド</td><td>Eton Bioscience または IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 抗体</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC 抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ</td><td>FAB170A 1:25</td></tr><tr><td>PDX1抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>ズAF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1抗体</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2抗体</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>インスリン抗体</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>C-ペプチド抗体</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>グルカゴン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1,000</td></tr></tbody></table>

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhpscsの指向性分化

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

自己再生または分化するヒト多能性幹細胞（hPSCs）で遺伝子機能を尋問することは、人間開発を理解し、皿に病気のメカニズムを解剖に向けて貴重なプラットフォームを提供しています。この潜在的な用途に活用するには、密接にそれらのインビボの対応を再現疾患関連細胞型を生成するために、疾患関連遺伝子にHPSC変異体を生成するための効率的なゲノム編集ツールを必要とするだけでなく、in vitroでの HPSC分化プロトコル。 iCRISPRという名前hPSCsのための効率的なゲノム編集プラットフォームはAAVS1遺伝子座におけるCas9発現カセットのTALEN媒介ターゲティングによって開発されました。ここでは、化学的に定義された培地および無フィーダー条件で培養細胞を用いた誘導Cas9 HPSCラインを生成するためのプロトコルが記載されています。 nまでのいずれかの遺伝子ノックアウトまたはhPSCsで正確な遺伝的変化のためのiCRISPRシステムを使用するための詳細な手順、接合端（NHEJ）に相同オンまたは相同性指向修理（HDR）テンプレートを使用して、正確なヌクレオチド変異を経由して、それぞれ、含まれています。これらの技術的な手順は、設計、生産、およびCRISPRのガイドRNA（gRNAs）のトランスフェクションの記述を含みます。 T7E1またはRFLPアッセイによってCRISPR変異率の測定;およびクローン変異株の樹立と検証。最後に、 生体内膵臓の胚発生に模倣することによってグルコース応答性膵β細胞様細胞への我々 HPSC分化に記載の手順。有向HPSC分化にiCRISPR技術を組み合わせることにより、膵臓の開発と糖尿病のメカニズムの理解を促進するために遺伝子機能の系統的な検査を可能にします。

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

本プロトコルでは、hPSCにおける迅速なゲノム編集のためのiCRISPRプラットフォームの構築方法と、ゲノム編集された細胞株をhPSC由来の膵分化に組み込み、ヒトの膵臓の発達および疾患を研究する方法について解説します。これらの手法は、正常な膵臓発達の遺伝的制御や糖尿病の分子基盤など、ヒト膵臓発達分野における重要な疑問への回答に寄与します。これらの技術の主な利点は、hPSCにおいて目的の遺伝子を効率的に改変でき、さらにこれらの改変細胞株を用いて、ヒト膵臓の発達および疾患をin vitroで研究できる点にあります。切断型ヒトビトロネクチンでコーティングしたディッシュを用い、化学的に定義されたフィーダーフリー条件下でhPSCを培養します。エレクトロポレーションの前日に、培地交換時に10 µMのROCK阻害剤を添加します。エレクトロポレーション当日は、あらかじめビトロネクチンコーティング済みの10 cmディッシュを用意しておきます。次に、細胞から培地を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで1回洗浄した後、1Xの解離試薬を用いて37°Cで約3分間細胞を処理します。続いて、細胞が剥離する前に解離試薬を吸引し、10.5 mLの完全培地を加えます。穏やかにピペッティングして単一細胞懸濁液を作成した後、遠心チューブに移します。自動細胞計数装置を用いて、500 µLの細胞懸濁液の細胞数を測定します。次に、hPSCを200 ×gで5分間遠心分離してペレット化します。細胞を冷PBS中で12.5 × 10⁶ cells/mLに再懸濁し、800 µLずつ分注します。各800 µLのhPSC懸濁液にプラスミドを加え、よく混合する。混合液を0.4 cmのエレクトロポレーションキュベットに移し、約5分間氷上で静置する。エレクトロポレーションシステムを用い、250 V、500 µFの条件で細胞に電気穿孔を行う。ゲノム編集には、健康で増殖しているhPSCを使用することが極めて重要です。エレクトロポレーション後、細胞を5 mLの予熱済み完全培地が入った15 mLコニカルチューブに移し、細胞をペレット化します。10 µMのROCK阻害剤を含む10 mLの完全培地で細胞を再懸濁し、各エレクトロポレーションから1×10⁶、2.5×10⁶、および5×10⁶個の細胞をビトロネクチンコートしたディッシュに播種します。これにより、少なくとも1つのプレートで、ピックアップに十分な数の単一細胞コロニーが得られるようになります。細胞を37 °Cで培養します。2日目に、500 µg/mLのG418硫酸塩を含む培地を添加し、ネオマイシン選択を開始します。6日目に、1 µg/mLのピューロマイシン二塩酸塩を含む培地を添加し、ピューロマイシン選択を開始します。10日から12日目にかけて、hPSC単一細胞コロニーは直径1から2 mmに達します。この時点で、実体顕微鏡下で12から24個のコロニーをピックアップします。200 µLピペットチップを用いてhPSCコロニーを物理的に小さく分散させ、細胞をビトロネクチンコートした24ウェルプレートに直接移します。ガイドRNAのトランスフェクションの24時間前に、iCas9 hPSCを2 µg/mLのドキシサイクリンで処理します。トランスフェクション当日、ビトロネクチンでコーティングした24ウェルプレートを用意し、前述の方法で1X解離試薬を用いてiCas9細胞を単一細胞に解離させます。次に、細胞を200 ×gで5分間遠心してペレット化し、2 µg/mLのドキシサイクリンおよび10 µMのROCK阻害剤を添加した完全培地を用いて、細胞密度0.5 × 10⁶ cells/mLで再懸濁します。再懸濁した細胞を500 µLずつ、24ウェルプレートの各ウェルに播種します。各ガイドRNAについて、以下のトランスフェクション混合液を調製します。混合液Aとして、50 µLの低血清培地と1 µLのガイドRNAを混合します。混合液Bとして、50 µLの低血清培地と3 µLのトランスフェクション試薬を混合します。混合液AとBを合わせて100 µLの混合液とし、室温で5分間インキュベートします。この混合液を50 µLずつ、24ウェルプレートの重複ウェルの細胞に添加し、十分に混ぜ合わせます。4日後にゲノムDNAを抽出し、ガイドRNA標的配列の両端にある標的領域をPCRで増幅させ、T7E1消化を用いて編集効率を推定します。播種から2日後、細胞が80%コンフルエントに達した時点でhPSC株の分化を開始します。分化0日目の培地を加え、その後はここに示した処方を用いて毎日培地を交換してください。10日目に、細胞の一部を免疫蛍光染色し、後期膵前駆細胞PP2のマーカーであるPDX1およびNKX6.1を examine します。その後、まずPP2細胞を10 µMのROCK阻害剤で4時間処理し、気液界面培養へと移行します。インキュベーション時間が経過したら、前述と同様に細胞を解離させます。気液界面の分化段階での播種における細胞生存率を最大化するため、解離剤による処理時間は最小限に抑えてください。細胞が剥離する前に解離剤を吸引します。その後、プレートに10 millilitersのboo-lah mediumを加え、緩やかにピペッティングすることでPP2細胞を単一細胞に分散させます。単一細胞懸濁液を回収する。細胞数をカウントし、細胞をペレット化する。細胞ペレットをS5分化培地で再懸濁した後、トランスウェルインサートフィルターの1スポットあたり5～10 µLの細胞を播種する。各トランスウェルインサートの底部にS5培地を加え、膵内分泌マーカーが免疫蛍光染色で検出可能になるまで、培地を交換しながらインキュベートする。この図は、hPSCsにおけるiCRISPR介在性の非相同末端結合を示している。選別プロセスを必要としないため、遺伝子ノックアウトの効率は非常に高く、20%から50%のバイアレル・ミュータントを容易に得ることができる。効率的かつ精密な遺伝子改変を行うため、ガイドRNAを、赤色で示される特定の配列改変を有する一本鎖DNAドナーと共に共導入します。多くの場合、改変後のアレルにおける再切断を防ぐために、PAM配列にサイレント変異を導入することが推奨されており、ここでは緑色で示されています。このシステムを用いることで、両アレルに余分な改変がなく、目的の相同組換え修復（HDR）を介したゲノム改変を持つクローンの割合を約10%まで得ることが可能です。習得すれば、新しいiCas9 hPSC株を樹立するのに2か月もかかりません。その後、1〜2か月以内にさまざまなhPSC変異コロニー株を作製することが可能です。hPSC遺伝子変異株の作製後、変異細胞株を膵β細胞様細胞へとin vitroで段階的に分化させることで、これらの変異によって影響を受ける特定の発生段階を研究でき、疾患の根底にあるメカニズムのより深い理解につながります。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

ヒト多能性幹細胞(hPSC)のゲノム編集は、迅速かつ効率的に行うことができます。ここでは、AAVS1セーフハーバー遺伝子座を編集してEGFPを発現させ、抗生物質耐性を導入することで例示されるように、hPSCを遺伝子操作するための堅牢な実験手順を示します。...

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

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