稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用
2018年7月24日
ここでは、ゼブラフィッシュとヨシノゴチの幼虫ミノーの自発活動と photomotor 応答 (PMR) 自動追跡ソフトウェアを使用して検討するプロトコルを提案します。共通の毒性生物検定株式これらの行動の分析は化学生物活性を調べる診断ツールを提供します。このプロトコルは、カフェイン、モデル neurostimulant を使用して記述されています。
魚類モデルには多くの利点があり、その結果、生物医科学でますます使用されるようになっています。開発から創薬、毒物学研究まで。同様に、魚類モデルの行動は、環境研究や生物医学研究にますます利用されるようになっています。
ここでは、水生毒物学と行動生態学における数十年にわたる研究経験を活用して、環境生物医学を進歩させることが特に重要です。私たちの方法は、化学物質の生物学的アビビティと、それらがもたらす可能性のある利点と危険性を理解するために使用できます。このプロトコルの主な利点は、環境および生物医学に有用な化学活性を診断的に理解するための高感度で迅速なアプローチを提供することです。
この技術の意味は、商業的なバイオアビビティと行動への影響の診断をサポートすることを目的としています。これらの化学物質のほとんどは、重要な毒性情報を欠いていることがよくあります。ただし、医薬品や農薬などの他の化学物質の影響を理解するためにも適用できます。
工業化合物については、環境薬理学と毒物学の比較データが不足していることが多いため、この点を考慮することが重要です。このプロトコルは、明るい、暗い写真期間を変更する際の幼虫の自発運動活動を測定するだけでなく、幼虫の光運動反応を測定するために使用できます。これは、光から暗への遷移と暗から光への遷移の間の動きの違いの大きさを効果的に調べます。
まず、カフェインを再構成した硬水に溶かします。次に、段階希釈を実行して、カフェイン処理レベルを下げます。個々の露光チャンバーを準備するには、ゼブラフィッシュ用の4つの100ミリリットルのガラスビーカーに20ミリリットルの溶液を注ぎます。
ファットヘッドミノー用の3つの500ミリリットルのガラスビーカーに200ミリリットルの溶液を注ぎます。次に、移し替えピペットを使用して、受精後4〜6時間のゼブラフィッシュ胚10個を各ビーカーに入れます。改造されたトランスファーピペットを使用して、孵化後24時間以内に老化した10匹のファットヘッドミノーの幼虫を各曝露チャンバーに入れます。
ゼブラフィッシュとファットヘッドミノーチャンバーをインキュベーターに入れます。96時間後、個々の魚を48ウェルプレートと24ウェルプレートの別々のウェルにロードします。記録チャンバーに少なくとも1匹の幼魚が入ったウェルプレートを置きます。
次に、ビデオ追跡ソフトウェアで、[ファイル生成プロトコル]をクリックします。ダイアログボックスのロケーションカウントフィールドに、ウェルプレートの個々のウェルの数を入力します。画面上部の OK.At をクリックし、[全画面表示]をクリックします。
ウェルプレートのオーバーヘッドカメラビューを表示します。次に、描画領域アイコンをクリックします。「areas」というラベルの付いたフィールドの円のアイコンを選択します。
カーソルを使用して、プレートの左上のウェルの円形のビデオ追跡領域を描きます。右上のマークを選択し、右上の表示領域の輪郭をよく描きます。次に、右下の輪郭をよく描くために下のマークを選択します。
ウェル追跡エリアを定義したら、[ビルド] をクリックして、残りのウェルの表示エリアを描画するようにソフトウェアに促します。キャリブレーション領域で、[スケールの描画]をクリックし、プレートを横切って水平線を引きます。線が引かれると、キャリブレーション測定というラベルの付いたダイアログボックスが表示されます。
このボックスにウェルプレートの長さを入力し、[OK]をクリックします。「キャリブレーション領域のグループに適用」をクリックします。描画マネージャを終了するには、描画領域アイコンをクリックします。次に、タイルアイコンをクリックします。
カーソルを使用して、表示画面に表示されるすべてのボックスを強調表示し、各ボックスが緑色になるようにします。[表示と全画面表示] をクリックします。次に、検出しきい値ボックスで[bkg]をクリックし、しきい値調整バーを使用してピクセル検出しきい値を設定します。
適切なしきい値を選択したら、[グループに適用] をクリックします。[移動しきい値]というラベルの付いたボックスに、目的の移動速度追跡パラメータを入力します。速度パラメータを設定したら、[グループに適用] をクリックします。
次に、ドロップダウンメニューから[プロトコルパラメータ]をクリックします。ダイアログボックスで、時間タブを選択し、観測時間と積分時間を入力します。[OK]をクリックし、パラメータドロップダウンメニューから[ライトドライブ]を選択して、ライトドライバー設定ダイアログボックスを開きます。
各写真期間の明るい暗い写真の期間と光の強度を設定します。次に、[OK]をクリックします。次に、観測プロトコルを保存します。
まず、実験魚の入ったウェルプレートを行動記録室に入れます。次に、以前に開発した追跡プロトコルを開きます。ビデオ トラッキング ビューアーで、すべての幼虫が表示されていること、各ウェルに 1 匹の幼虫のみが存在すること、およびウェルが定義された観察エリアに揃っていることを確認します。
次に、実験をクリックして実行します。データの名前と保存場所を指定します。また、いくつかのライブ画像アイコンをクリックして、事前定義されたすべての表示領域を強調表示します。
最後に、録音チャンバーのパネルを閉じて、背景をクリックしてから、コンピューターモニターで開始をクリックします。カフェインに96時間曝露した後、ファットヘッドミノーの幼虫の光運動反応は、ゼブラフィッシュよりも低いレベルでカフェインによって変化しました。しかし、ゼブラフィッシュでは、著しく多くの光運動エンドポイントが影響を受けました。
さらに、移動距離、運動回数、および運動時間について、明るい運動活動と暗い自発運動活動を3つの速度閾値で分析しました。両種とも、カフェインはすべての活動を阻害し、自発運動エンドポイントに有意な影響を与えました。.この手順を実行する際には、行動アッセイを狭い特定の時間枠で接続することを忘れないことが重要です。
なぜなら、時間帯は魚の幼生の行動に影響を与える可能性があるからです。この手順に従うと、他の化学物質の標準化されたガイドラインに方法を適用して、魚の行動に関連する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、環境科学および生物医学に関連する標準化されたガイドラインを使用して毒性バイオアッセイを実施する際に、幼魚モデルの行動と光運動応答を観察する方法を十分に理解しているはずです。
特定の化学物質を扱うことは危険であることを忘れないでくださいので、このプロトコルを実行するときは、必ず適切な個人用保護具を着用してください。
概要
本記事では、自動トラッキングソフトウェアを用いて、ゼブラフィッシュおよびファットヘッドミノーの幼魚における運動活性および光運動反応を調べるためのプロトコルを提示します。本手法は、モデル神経刺激剤としてのカフェインの使用例を通じて、化学物質の生物活性に関する知見を提供し、毒性生物学的アッセイの精度を高めることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 行動生態学
- 水圏毒性学
- 生物医学研究
背景
- 生物医学において、魚類モデルの利用がますます増えています。
- 魚類の行動研究は、環境研究や生物医学研究に有用な知見を提供します。
- 化学物質の生物活性を理解することは、その有益性と有害性を評価する上で極めて重要です。
- 環境薬理学および毒性学に関する比較データは、不足していることが多いのが現状です。
研究目的
- 化学的活性を評価するための、感度が高く迅速な手法を開発すること。
- 商業的な生物活性および行動への影響の診断を支援すること。
- さまざまな化学物質の影響を評価するための標準化されたアプローチを提供すること。
使用した手法
- 曝露用に、再構成した硬水にカフェインを溶解させる。
- 自動トラッキングソフトウェアを使用して、運動および光運動反応を解析する。
- 連続希釈を行い、異なるカフェイン濃度を評価する。
- 明暗サイクルにおける魚類幼魚の行動をモニタリングする。
主な結果
- カフェインは、ゼブラフィッシュよりも低い濃度でファットヘッドミノーの光運動反応を変化させた。
- ゼブラフィッシュでは、より多くの光運動エンドポイントに影響が見られた。
- 両種ともに、すべての運動エンドポイントにおいて活動の抑制が認められた。
- 時間帯は、魚類幼魚の行動に有意な影響を及ぼす。
結論
- 本プロトコルは、化学物質が行動に及ぼす影響を評価するための枠組みを提供する。
- 他の化学物質に対しても方法を標準化することで、さらなる課題の検討が可能である。
- このアプローチにより、毒性学研究における魚類の行動への理解が深まる。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコルは、幼魚の迅速な行動プロファイリングを可能にし、神経活性化合物の効果を評価することで、神経薬理学における初期段階のターゲットバリデーションを支援します。光運動反応および自発的運動反応を定量化することにより、哺乳類での試験前に中枢神経系（CNS）活性化合物のリスクを低減させるためのメカニズム的な知見を提供します。ゼブラフィッシュとファットヘッドミノーの感受性を比較することで、環境および生物医学的コンテキストにおける種特異的な行動スクリーニングにトランスレーショナルな利点をもたらします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：魚類幼生モデルにおける神経刺激剤誘発性の行動変化を測定することにより、治療仮説を検証します。
- 運用的価値：定量可能な光運動および自発運動のエンドポイントを通じて、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 予測的価値：環境に関連する濃度で有意な行動影響を示す化合物を特定することで、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージュ）を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 自動トラッキングを用いた下流の化合物スクリーニングに向けて、バリデーション済みの行動アッセイを準備します。
- 定量的出力： ヒット確認のため、速度閾値に基づいた測定可能な自発運動および光運動データを生成します。
- 再現性： 明暗サイクルプロトコルを標準化し、実験間で一貫した行動読み取り値を確保します。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 疾患との関連性： 中枢神経系（CNS）疾患のターゲットエンゲージメントに関連する神経薬理学的応答をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性： 保存された行動学的エンドポイントを通じて、行動生態毒性学と生物医学的スクリーニングを橋渡しします。
- リスク調整後の進展： 神経活性化合物の応答における種特異的な感受性の違いを明確にすることで、go/no-go判断に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期の創薬ワークフローに適合し、神経活性化合物に曝露させた魚類幼魚の行動表現型解析を通じて、仮説検証およびリード化合物の同定を支援します。
- ディスカバリー生物学： 化合物の曝露と、変化した光運動および自発運動行動を関連付けることで、パスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング： 化合物の効果を比較するための、アッセイにそのまま利用可能な再現性のある行動読み取り値を提供します。
- 分析： 条件間の比較分析に向けた、定量的な運動閾値および光運動反応指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 保存された行動アッセイを介して、行動生態毒性学と前臨床神経薬理学を結びつけます。
- 企業の再利用： 多様な化合物ライブラリーに適用可能な、再利用可能な行動プロファイリングプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経活性化合物のスクリーニングにおけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、ターゲット検証における予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：種間および研究室間における行動アッセイの標準化と拡張性を高めます。
- 戦略的価値：中枢神経系（CNS）活性化合物の早期リスク低減を可能にし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：定量的な行動効果のしきい値に基づいた、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 稚魚の飼育および行動追跡ソフトウェアの操作に関する専門知識が必要です。
- 自動ビデオ追跡システムおよび環境制御インキュベーターに依存します。
- 曝露プロトコルおよび行動エンドポイントの定義について、チーム間での標準化が必要です。
- アッセイのスケジュールを立てる際は、日周的な行動変動を考慮しなければなりません。
- 行動エンドポイントに限定されており、メカニズムの解明や分子ターゲットの検証に代わるものではありません。
