稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

魚類モデルには多くの利点があり、その結果、生物医科学でますます使用されるようになっています。開発から創薬、毒物学研究まで。同様に、魚類モデルの行動は、環境研究や生物医学研究にますます利用されるようになっています。

ここでは、水生毒物学と行動生態学における数十年にわたる研究経験を活用して、環境生物医学を進歩させることが特に重要です。私たちの方法は、化学物質の生物学的アビビティと、それらがもたらす可能性のある利点と危険性を理解するために使用できます。このプロトコルの主な利点は、環境および生物医学に有用な化学活性を診断的に理解するための高感度で迅速なアプローチを提供することです。

この技術の意味は、商業的なバイオアビビティと行動への影響の診断をサポートすることを目的としています。これらの化学物質のほとんどは、重要な毒性情報を欠いていることがよくあります。ただし、医薬品や農薬などの他の化学物質の影響を理解するためにも適用できます。

工業化合物については、環境薬理学と毒物学の比較データが不足していることが多いため、この点を考慮することが重要です。このプロトコルは、明るい、暗い写真期間を変更する際の幼虫の自発運動活動を測定するだけでなく、幼虫の光運動反応を測定するために使用できます。これは、光から暗への遷移と暗から光への遷移の間の動きの違いの大きさを効果的に調べます。

まず、カフェインを再構成した硬水に溶かします。次に、段階希釈を実行して、カフェイン処理レベルを下げます。個々の露光チャンバーを準備するには、ゼブラフィッシュ用の4つの100ミリリットルのガラスビーカーに20ミリリットルの溶液を注ぎます。

ファットヘッドミノー用の3つの500ミリリットルのガラスビーカーに200ミリリットルの溶液を注ぎます。次に、移し替えピペットを使用して、受精後4〜6時間のゼブラフィッシュ胚10個を各ビーカーに入れます。改造されたトランスファーピペットを使用して、孵化後24時間以内に老化した10匹のファットヘッドミノーの幼虫を各曝露チャンバーに入れます。

ゼブラフィッシュとファットヘッドミノーチャンバーをインキュベーターに入れます。96時間後、個々の魚を48ウェルプレートと24ウェルプレートの別々のウェルにロードします。記録チャンバーに少なくとも1匹の幼魚が入ったウェルプレートを置きます。

次に、ビデオ追跡ソフトウェアで、[ファイル生成プロトコル]をクリックします。ダイアログボックスのロケーションカウントフィールドに、ウェルプレートの個々のウェルの数を入力します。画面上部の OK.At をクリックし、[全画面表示]をクリックします。

ウェルプレートのオーバーヘッドカメラビューを表示します。次に、描画領域アイコンをクリックします。「areas」というラベルの付いたフィールドの円のアイコンを選択します。

カーソルを使用して、プレートの左上のウェルの円形のビデオ追跡領域を描きます。右上のマークを選択し、右上の表示領域の輪郭をよく描きます。次に、右下の輪郭をよく描くために下のマークを選択します。

ウェル追跡エリアを定義したら、[ビルド] をクリックして、残りのウェルの表示エリアを描画するようにソフトウェアに促します。キャリブレーション領域で、[スケールの描画]をクリックし、プレートを横切って水平線を引きます。線が引かれると、キャリブレーション測定というラベルの付いたダイアログボックスが表示されます。

このボックスにウェルプレートの長さを入力し、[OK]をクリックします。「キャリブレーション領域のグループに適用」をクリックします。描画マネージャを終了するには、描画領域アイコンをクリックします。次に、タイルアイコンをクリックします。

カーソルを使用して、表示画面に表示されるすべてのボックスを強調表示し、各ボックスが緑色になるようにします。[表示と全画面表示] をクリックします。次に、検出しきい値ボックスで[bkg]をクリックし、しきい値調整バーを使用してピクセル検出しきい値を設定します。

適切なしきい値を選択したら、[グループに適用] をクリックします。[移動しきい値]というラベルの付いたボックスに、目的の移動速度追跡パラメータを入力します。速度パラメータを設定したら、[グループに適用] をクリックします。

次に、ドロップダウンメニューから[プロトコルパラメータ]をクリックします。ダイアログボックスで、時間タブを選択し、観測時間と積分時間を入力します。[OK]をクリックし、パラメータドロップダウンメニューから[ライトドライブ]を選択して、ライトドライバー設定ダイアログボックスを開きます。

各写真期間の明るい暗い写真の期間と光の強度を設定します。次に、[OK]をクリックします。次に、観測プロトコルを保存します。

まず、実験魚の入ったウェルプレートを行動記録室に入れます。次に、以前に開発した追跡プロトコルを開きます。ビデオ トラッキング ビューアーで、すべての幼虫が表示されていること、各ウェルに 1 匹の幼虫のみが存在すること、およびウェルが定義された観察エリアに揃っていることを確認します。

次に、実験をクリックして実行します。データの名前と保存場所を指定します。また、いくつかのライブ画像アイコンをクリックして、事前定義されたすべての表示領域を強調表示します。

最後に、録音チャンバーのパネルを閉じて、背景をクリックしてから、コンピューターモニターで開始をクリックします。カフェインに96時間曝露した後、ファットヘッドミノーの幼虫の光運動反応は、ゼブラフィッシュよりも低いレベルでカフェインによって変化しました。しかし、ゼブラフィッシュでは、著しく多くの光運動エンドポイントが影響を受けました。

さらに、移動距離、運動回数、および運動時間について、明るい運動活動と暗い自発運動活動を3つの速度閾値で分析しました。両種とも、カフェインはすべての活動を阻害し、自発運動エンドポイントに有意な影響を与えました。.この手順を実行する際には、行動アッセイを狭い特定の時間枠で接続することを忘れないことが重要です。

なぜなら、時間帯は魚の幼生の行動に影響を与える可能性があるからです。この手順に従うと、他の化学物質の標準化されたガイドラインに方法を適用して、魚の行動に関連する追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、環境科学および生物医学に関連する標準化されたガイドラインを使用して毒性バイオアッセイを実施する際に、幼魚モデルの行動と光運動応答を観察する方法を十分に理解しているはずです。

特定の化学物質を扱うことは危険であることを忘れないでくださいので、このプロトコルを実行するときは、必ず適切な個人用保護具を着用してください。