殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性

この方法は、昆虫毒物学の分野における重要な質問、例えば、すべての代謝解毒遺伝子が殺虫剤耐性に関与しているかどうかなどを助けることができますか?この技術の主な利点は、より大きなスケールのタンパク質を産生し、in vitroでの殺虫剤の代謝におけるこれらのタンパク質の機能を特徴付けることができることです。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるXuechun Fengです。

Xuechen博士課程の研究は、イエバエ(Musca domestica)の寄生虫耐性におけるカルボキシルエステラーゼの機能特性評価に焦点を当てています。まず、1マイクロリットルのGFPエントリー血漿DNAと、250マイクロリットルのPCRチューブに市販のCターム直鎖状DNA5マイクロリットルを混合します。次に、2マイクロリットルの市販のラムダ組換えミックスを各PCRチューブに加えます。

チューブを穏やかに混合し、摂氏25度で一晩インキュベートします。2ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞培養液を細胞培養プレートのウェルに均等に播種します。次に、細胞をフード内で室温で少なくとも3時間接着させます。

250倍の逆位相顕微鏡を使用して、細胞の付着を確認します。次に、細胞培養培地を取り出し、2ミリリットルのGraceの昆虫培地と交換します。この後、トランスフェクション混合物AおよびB溶液をテキストプロトコールに従って調製します。

次に、トランスフェクション混合物AとBをチューブを軽くたたいて穏やかに混合します。混合物を室温でフード内で35分間インキュベートします。次に、混合物を播種した細胞に滴下します。

ウェルをテープで密封し、細胞を摂氏27度で一晩インキュベートします。グレースの昆虫培地の2ミリリットルを、完全な成長培地の2ミリリットルと交換します。次に、各ウェルに100マイクロモルのガンシクロビルを加えます。

ウェルをテープで密封し、細胞を摂氏27度で72時間インキュベートします。感染後72時間後に、各ウェルから培地を回収し、1.5ミリリットルの遠心チューブに移します。次に、チューブをGの1500倍で、摂氏4度で5分間遠心分離します。

1ミリリットルの完全増殖培地をウェルに加え、蛍光灯付きの顕微鏡を使用して、P1バキュロウイルス増幅段階で細胞の感染徴候を観察します。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、暗所で摂氏4度で保管します。この後、2ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞培養液を、細胞培養プレートのウェルに均等に播種する。

細胞をフード内で室温で少なくとも3時間接着させます。細胞播種ウェルに5マイクロリットルのP1ウイルスストックを接種し、各ウェルに100マイクロモルのガンシクロビルを添加します。ウェルを密封し、細胞を摂氏27度で72時間インキュベートします。

まず、T25未処理フラスコで、5ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞を完全増殖培地と共に培養します。次に、25マイクロリットルのP1ウイルスストック溶液を加えて、摂氏27度で穏やかに振とうしながら48時間、細胞培養に感染させます。アセトニトリルを使用して、100ミリモルペルメトリンの段階希釈液を調製します。

次に、200マイクロリットルの感染細胞培養物に300マイクロリットルの完全増殖培地を添加し、24ウェルプレートに播種します。ペルメトリンがアセトニトリルに完全に溶解し、プレートの各ウェルに均一に送達されることを確認します。ペルメトリンを加えた後、プレートを静かに振って、ペルメトリンを培地で完全に混合します。

この後、プレートをテープで密封し、プレートを摂氏27度で48時間、暗い条件でインキュベートします。細胞培養培地をプレートから取り出し、下部に付着した細胞層を乱さないようにします。各ウェルに200マイクロリットルのMMT試薬を加えます。

次に、プレートを摂氏37度で4時間インキュベートし、各ウェルに濃い紫色のホルマザン沈殿物が形成されるまでインキュベートします。各ウェルに500マイクロリットルのDMSOを加えて、沈殿物を完全に溶解します。次に、200マイクロリットルの溶解溶液を96ウェルプレートの各ウェルに移します。

沈殿物をDMSOに完全に溶解することは、結果の精度にとって非常に重要です。プレート内のサンプルにDMSOを添加した後、沈殿物が完全に溶解するまで、ピペットを使用してサンプルを数回洗浄します。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルでプレートの吸光度値を測定します。

P1の段階では、感染率は低いです。P2段階では、感染率が大幅に向上しました。P3感染段階では、ほぼすべての細胞が細胞培養プレートからの剥離、細胞径の増加、細胞増殖の停止などの症状を示しました。

検出された吸光度値に基づいて、Md α E7発現細胞は、対照CAT細胞と比較して有意に高い生存率を示しました。この手順を実施する際には、細胞実験を行う前に、ボトルやチューブなどの物質の表面を70%のエタノールで拭くことにより、すべてのステップで細胞汚染を防ぐことが重要です。この手順に続いて、カルボキシルエステラーゼタンパク質とペルメトリンリガンドとの間の相互作用などの追加の質問に答えるために、相同性モデリングやダーク解析などの他の方法を実行できます。

この技術は、昆虫毒物学の研究者が、昆虫の殺虫剤耐性の遺伝子とメカニズムの機能的特性を探求する道を開きました。殺虫剤の取り扱いは非常に有害である可能性があるため、これらの手順を実行する際には、手袋や白衣などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。