Name: 殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶ バキュロウイルス発現系を用いたイエバエカルボキシルエステラーゼの大量生産と機能解析。Musca domesticaの殺虫剤抵抗性メカニズムを解明し、害虫管理戦略の開発に貢献する。

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最近数十年で表現し、大量の蛋白質の生化学的, 機能的定量法と体外酵素の特性をこのように分離異種発現システムに広く使用されています。日には、大腸菌、 ・組成分析、 Sacccharomyces 酵母、ハスモンヨトウ frugiperdaなどいくつかの別のモデル システムは組換え蛋白質の表現との選択に適応されている、興味の蛋白質22,23,24,25の大規模な生成のための in vitroシステムが欠かせません。昆虫細胞に似た細胞内環境を提供し、いくつかの重要な真核生物処理機能を維持するために選ばれた我々 の研究家フライ カルボキシルエステラーゼを生成するバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系9. バキュロ ウイルスによる発現システムの...

殺虫剤抵抗性は現在家はえ制御世界中1,2の主要な問題であります。殺虫剤抵抗性のメカニズムを容易にこの問題のより良い理解を決定するため、新しい戦略を効果的に防止したり、抵抗の開発3の拡散を最小限に努力。カルボキシルエステラーゼ、主要な解毒酵素の一つとして、多くの隔離と様々 な昆虫4,5,6の殺虫剤の代謝における役割のため注目を集めています。私たちの以前の研究は家のハエで複数カルボキシルエステラーゼを識別しているの発現量恒常耐性 ALHF 株にまで規制がありませんがまたペルメトリン治療7 への応答で高い誘導のレベルをすることができます。.ただし、殺虫剤の代謝におけるこれらのカルボキシルエステラーゼ遺伝子の機能的な特徴は、探検するために残ります。
初期の 1980 年代8の最初のレポート以来高蛋白質生産効率性真核生物のタンパク質のプロセッシング機能9バキュロ ウイルスを介する遺伝子発現システムに広く採用されています。このバイナリ システムは 2 つの本質的な要素で構成される: 構築された組換えバキュロ ウイルスの宿主細胞と遺伝子組換えバキュロ ウイルスによる感染細胞による興味のあるタンパク質の大量発現に外国の遺伝子を提供します。過去十年にわたってバキュロ ウイルス媒介電池式システムは、組換えタンパク質、細胞質酵素から昆虫の膜結合型蛋白質に至るまでの数千を生成する広く使用されています、哺乳類細胞の10。私たちの以前の研究は正常にこのシステム11Sf9 昆虫細胞での複数の CYP450 酵素を表明しています。本研究で我々 は Sf9 昆虫細胞に感染するカルボキシルエステラーゼ組換えバキュロ ウイルスを構築、異なるペルメトリン治療し、大規模な表現カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroの免疫寛容を検討機能探査。以前研究12,13で採択された「昆虫ホモジュネートからの複数のカルボキシルエステラーゼ アイソザイムの混合物を調査して、代わりこのバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系により特定の式とターゲットタンパク質の生化学的および構造特性より良い評価のための分離。
テトラゾリウム塩を用いた測定 (MTT) は、高スループットの比色定量法を開発し、細胞生存率を測定するために最適化されました。このアッセイは、生細胞のみがこの分析できる有機溶剤14に溶解した後、暗い紫色着色された塩の沈殿物に黄色の MTT の試薬を代謝できるメカニズムに基づいています 15。トリパン ブルー色素排除とチミジン滴定分析16,17などの時間のかかる方法がより正確なのいくつかは近年開発されています。ただし、MTT の細胞に基づく試金はまだ現在、細胞生存率を迅速に検出する最も迅速かつ簡単に操作の方法として認識されます。ここでは、MTT の試金を使用殺虫剤の治療に対して免疫寛容を探索します。強くカルボキシルエステラーゼ組換えバキュロ ウイルスに感染している場合に、セルの強化されたトレランスは、順番で殺虫剤抵抗性への関与を示唆している殺虫剤、カルボキシルエステラーゼの代謝の役割をサポートします。
さらに、体外代謝アッセイは、この研究も行われました。カルボキシルエステラーゼの加水分解の活動を反映するように α ラウリン酢酸 (α-NA) と β-ナフチル酢酸 (β-NA) などの一般的な基材を使用して一般的なカルボキシルエステラーゼの試金と比較して、体外代謝研究は正確な方法とみなされる殺虫剤18に向かってカルボキシルエステラーゼの活動を直接測定します。このメソッドは正常に様々 な昆虫の殺虫剤抵抗11,19,20協会における複数チトクロム p450 の特性評価に採用されています。ただし、このメソッドがまだ適用されていないカルボキシルエステラーゼの研究。バキュロ ウイルスによる発現システムによって生成するカルボキシルエステラーゼ タンパク質の可用性、我々 の関与の強力な証拠を提供することができます。 さらにペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの体外代謝研究を実行できます。ピレスロイド耐性を家の中でカルボキシルエステラーゼのハエします。

<table><tbody><tr><td>Q5 ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs inc.</td><td>M0491L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO クローニングキット、One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K240020</td><td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers がこのキットに含まれていました。</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K210002</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>11791-023</td><td></td></tr><tr><td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>12562-019</td><td>セルフェクチントランスフェクション試薬とガンシクロビルがこのキットに含まれていました</td></tr><tr><td>pENTR-CAT プラスミド</td><td>Invitrogen by life technology</td><td></td><td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kitに含まれ、濃度:0.5 ug/uL</td></tr><tr><td>熱不活性化ウシ胎児血清、認定</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &Lysis Buffer</td><td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td><td>786-411</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 III SFM (1回;)無血清培地 コンプリート</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>12658-019</td><td></td></tr><tr><td>Grace's Insect Medium, Unsupplemented</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>11595030</td><td></td></tr><tr><td>ペルメトリン (異性体) 分析標準</td><td>SUPELCO by Solutions WithinTM442748</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>メタノール (分析グレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル(分析グレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>GHP Acrodisc 25 mmシリンジフィルター、0.45 &mu;m GHP メンブレン (HPLC 認証)</td><td>Pall Life Sciences</td><td>21890388</td><td></td></tr><tr><td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal</td><td>Cycle Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

カルボキシルエステラーゼを介した代謝は、さまざまな昆虫の殺虫剤抵抗性に大きな役割を果たすと考えられます。いくつかのカルボキシルエステラーゼ遺伝子は、探検するために殺虫剤耐性での役割が残っているに対し、抵抗性イエバエ フライひずみの調整を発見されました。ここでは、我々 はカルボキシルエステラーゼの機能解析のためのプロトコルを設計しました。3 つの例の実験を紹介する: (1) 式とバキュロ ウイルス媒介昆虫ハスモンヨトウ frugiperda (Sf9) セル式システムによるカルボキシルエステラーゼ タンパク質の分離(2) の細胞ベースの MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-イル]-2, 5-diphenyltetrazolium ブロマイド) 異なるペルメトリン治療昆虫細胞の耐性を測定する細胞毒性アッセイ(3)の in vitro代謝の研究ペルメトリンに向かってカルボキシルエステラーゼの代謝機能を調査します。MdαE7 抵抗性イエバエから複製されたカルボキシルエステラーゼ遺伝子系統 ALHF を飛ぶし、Sf9 細胞感染の組換えバキュロ ウイルスを作成するために使用します。異なるペルメトリン治療に対してセル目は、MTT アッセイを測定しました。パーメスリン抵抗性制御グループ (猫組換えバキュロ ウイルス感染細胞と GFP 遺伝子組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の比較実験グループ (MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染細胞) の高められた細胞トレランス治療は、それにより化学損傷から細胞を保護する殺虫剤の代謝で MdαE7 の機能を提案しました。それに加えて、カルボキシルエステラーゼ蛋白質は昆虫 Sf9 細胞で発現され分離体外代謝研究を行うこと。かなりの in vitro代謝効率 MdαE7 のペルメトリン、殺虫剤の代謝でカルボキシルエステラーゼの関与を示す直接の方が示唆し、飛ぶため殺虫剤抵抗性の家を授与します。

異なるペルメトリン トリートメント (MTT の試金) に向かって細胞生存率
MdαE7 組換えバキュロ ウイルス感染 Sf9 細胞 (実験群) と猫組換えバキュロ ウイルス感染 (感染するバキュロ ウイルス キット提供) 細胞 (群) のペルメトリンの細胞毒性を調べた。拡張セル許容範囲が MdαE7 強く発現細胞を用いたペルメトリンには、殺虫剤と化学損害からこうして保護セルに対してこのカルボキシルエステラーゼの代謝の役割をサポートします。我々 の研究は、異なるペルメトリン濃度に対する細胞生存率で (50、100、200、400 μ M) アセトニ トリルだけで細胞と比較して計算されました。結果 MdαE7 の発現細胞の生存率が有意に高かった (101.92% 86.00% に至るまで)(図 4 b) 制御の細胞 (67.59% に至る 81.43%) よりも(<strong class="xfig...

ここでは、プロトコルを提案家フライ カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系を生成し、後で機能的、それにより代謝ペルメトリンの役割を特徴づけるピレスロイドを授与セルベースの MTT アッセイと体外代謝研究を行うことにより抵抗。

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

この方法は、昆虫毒物学の分野における重要な質問、例えば、すべての代謝解毒遺伝子が殺虫剤耐性に関与しているかどうかなどを助けることができますか?この技術の主な利点は、より大きなスケールのタンパク質を産生し、in vitroでの殺虫剤の代謝におけるこれらのタンパク質の機能を特徴付けることができることです。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるXuechun Fengです。Xuechen博士課程の研究は、イエバエ(Musca domestica)の寄生虫耐性におけるカルボキシルエステラーゼの機能特性評価に焦点を当てています。まず、1マイクロリットルのGFPエントリー血漿DNAと、250マイクロリットルのPCRチューブに市販のCターム直鎖状DNA5マイクロリットルを混合します。次に、2マイクロリットルの市販のラムダ組換えミックスを各PCRチューブに加えます。チューブを穏やかに混合し、摂氏25度で一晩インキュベートします。2ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞培養液を細胞培養プレートのウェルに均等に播種します。次に、細胞をフード内で室温で少なくとも3時間接着させます。250倍の逆位相顕微鏡を使用して、細胞の付着を確認します。次に、細胞培養培地を取り出し、2ミリリットルのGraceの昆虫培地と交換します。この後、トランスフェクション混合物AおよびB溶液をテキストプロトコールに従って調製します。次に、トランスフェクション混合物AとBをチューブを軽くたたいて穏やかに混合します。混合物を室温でフード内で35分間インキュベートします。次に、混合物を播種した細胞に滴下します。ウェルをテープで密封し、細胞を摂氏27度で一晩インキュベートします。グレースの昆虫培地の2ミリリットルを、完全な成長培地の2ミリリットルと交換します。次に、各ウェルに100マイクロモルのガンシクロビルを加えます。ウェルをテープで密封し、細胞を摂氏27度で72時間インキュベートします。感染後72時間後に、各ウェルから培地を回収し、1.5ミリリットルの遠心チューブに移します。次に、チューブをGの1500倍で、摂氏4度で5分間遠心分離します。1ミリリットルの完全増殖培地をウェルに加え、蛍光灯付きの顕微鏡を使用して、P1バキュロウイルス増幅段階で細胞の感染徴候を観察します。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、暗所で摂氏4度で保管します。この後、2ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞培養液を、細胞培養プレートのウェルに均等に播種する。細胞をフード内で室温で少なくとも3時間接着させます。細胞播種ウェルに5マイクロリットルのP1ウイルスストックを接種し、各ウェルに100マイクロモルのガンシクロビルを添加します。ウェルを密封し、細胞を摂氏27度で72時間インキュベートします。まず、T25未処理フラスコで、5ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞を完全増殖培地と共に培養します。次に、25マイクロリットルのP1ウイルスストック溶液を加えて、摂氏27度で穏やかに振とうしながら48時間、細胞培養に感染させます。アセトニトリルを使用して、100ミリモルペルメトリンの段階希釈液を調製します。次に、200マイクロリットルの感染細胞培養物に300マイクロリットルの完全増殖培地を添加し、24ウェルプレートに播種します。ペルメトリンがアセトニトリルに完全に溶解し、プレートの各ウェルに均一に送達されることを確認します。ペルメトリンを加えた後、プレートを静かに振って、ペルメトリンを培地で完全に混合します。この後、プレートをテープで密封し、プレートを摂氏27度で48時間、暗い条件でインキュベートします。細胞培養培地をプレートから取り出し、下部に付着した細胞層を乱さないようにします。各ウェルに200マイクロリットルのMMT試薬を加えます。次に、プレートを摂氏37度で4時間インキュベートし、各ウェルに濃い紫色のホルマザン沈殿物が形成されるまでインキュベートします。各ウェルに500マイクロリットルのDMSOを加えて、沈殿物を完全に溶解します。次に、200マイクロリットルの溶解溶液を96ウェルプレートの各ウェルに移します。沈殿物をDMSOに完全に溶解することは、結果の精度にとって非常に重要です。プレート内のサンプルにDMSOを添加した後、沈殿物が完全に溶解するまで、ピペットを使用してサンプルを数回洗浄します。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルでプレートの吸光度値を測定します。P1の段階では、感染率は低いです。P2段階では、感染率が大幅に向上しました。P3感染段階では、ほぼすべての細胞が細胞培養プレートからの剥離、細胞径の増加、細胞増殖の停止などの症状を示しました。検出された吸光度値に基づいて、Md α E7発現細胞は、対照CAT細胞と比較して有意に高い生存率を示しました。この手順を実施する際には、細胞実験を行う前に、ボトルやチューブなどの物質の表面を70%のエタノールで拭くことにより、すべてのステップで細胞汚染を防ぐことが重要です。この手順に続いて、カルボキシルエステラーゼタンパク質とペルメトリンリガンドとの間の相互作用などの追加の質問に答えるために、相同性モデリングやダーク解析などの他の方法を実行できます。この技術は、昆虫毒物学の研究者が、昆虫の殺虫剤耐性の遺伝子とメカニズムの機能的特性を探求する道を開きました。殺虫剤の取り扱いは非常に有害である可能性があるため、これらの手順を実行する際には、手袋や白衣などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。

functional-characterization-carboxylesterases-insecticide-resistant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

電気生理学的検査によって決定されるようネッタイシマカの主要な味覚付属における遺伝子発現を評価するために2つの方法を使用して、我々は、推定される苦味反発化合物に神経細胞応答の根底にある遺伝子のセットを同定した。...

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定ネッタイシマカ

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis...

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

研究所は、安定したハエや他の有翅の双翅目の飼育

このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。...

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera...

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B.

オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

このプロトコルは鱗翅目の昆虫の幼虫に対するphytochemicalの潜在的に有毒な効果を評価するために義務的な供給の試金を記述する。これは、亜致死量および致死量、抑止活性、および生理学的効果の最適化が容易な、拡張性の高い昆虫バイオアッセイです。これは、環境に優しい殺虫剤のスクリーニングに使用できます。...

Helicoverpa armigeraに対するファイトケミカルの殺虫効果を評価するための摂食アッセイシステムの開発

ここでは、森林のウッドボーラーから昆虫病原性真菌を取得するためのプロトコルと、鞘翅目モデル昆虫を使用してそれらの昆虫病原性活性を評価するための代替方法を示します。この方法は、自然林の木材を退屈する害虫から昆虫病原性真菌資源を探索するのに効率的で便利です。...

森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

学ぶ バキュロウイルス発現系を用いたイエバエカルボキシルエステラーゼの大量生産と機能解析。Musca domesticaの殺虫剤抵抗性メカニズムを解明し、害虫管理戦略の開発に貢献する。

殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性

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