殺虫剤抵抗性イエバエ、イエバエのカルボキシルエステラーゼの機能特性
2018年8月23日
ここでは、プロトコルを提案家フライ カルボキシルエステラーゼ タンパク質の in vitroバキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系を生成し、後で機能的、それにより代謝ペルメトリンの役割を特徴づけるピレスロイドを授与セルベースの MTT アッセイと体外代謝研究を行うことにより抵抗。
この方法は、昆虫毒物学の分野における重要な質問、例えば、すべての代謝解毒遺伝子が殺虫剤耐性に関与しているかどうかなどを助けることができますか?この技術の主な利点は、より大きなスケールのタンパク質を産生し、in vitroでの殺虫剤の代謝におけるこれらのタンパク質の機能を特徴付けることができることです。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるXuechun Fengです。
Xuechen博士課程の研究は、イエバエ(Musca domestica)の寄生虫耐性におけるカルボキシルエステラーゼの機能特性評価に焦点を当てています。まず、1マイクロリットルのGFPエントリー血漿DNAと、250マイクロリットルのPCRチューブに市販のCターム直鎖状DNA5マイクロリットルを混合します。次に、2マイクロリットルの市販のラムダ組換えミックスを各PCRチューブに加えます。
チューブを穏やかに混合し、摂氏25度で一晩インキュベートします。2ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞培養液を細胞培養プレートのウェルに均等に播種します。次に、細胞をフード内で室温で少なくとも3時間接着させます。
250倍の逆位相顕微鏡を使用して、細胞の付着を確認します。次に、細胞培養培地を取り出し、2ミリリットルのGraceの昆虫培地と交換します。この後、トランスフェクション混合物AおよびB溶液をテキストプロトコールに従って調製します。
次に、トランスフェクション混合物AとBをチューブを軽くたたいて穏やかに混合します。混合物を室温でフード内で35分間インキュベートします。次に、混合物を播種した細胞に滴下します。
ウェルをテープで密封し、細胞を摂氏27度で一晩インキュベートします。グレースの昆虫培地の2ミリリットルを、完全な成長培地の2ミリリットルと交換します。次に、各ウェルに100マイクロモルのガンシクロビルを加えます。
ウェルをテープで密封し、細胞を摂氏27度で72時間インキュベートします。感染後72時間後に、各ウェルから培地を回収し、1.5ミリリットルの遠心チューブに移します。次に、チューブをGの1500倍で、摂氏4度で5分間遠心分離します。
1ミリリットルの完全増殖培地をウェルに加え、蛍光灯付きの顕微鏡を使用して、P1バキュロウイルス増幅段階で細胞の感染徴候を観察します。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、暗所で摂氏4度で保管します。この後、2ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞培養液を、細胞培養プレートのウェルに均等に播種する。
細胞をフード内で室温で少なくとも3時間接着させます。細胞播種ウェルに5マイクロリットルのP1ウイルスストックを接種し、各ウェルに100マイクロモルのガンシクロビルを添加します。ウェルを密封し、細胞を摂氏27度で72時間インキュベートします。
まず、T25未処理フラスコで、5ミリリットルの対数期増殖昆虫SF9細胞を完全増殖培地と共に培養します。次に、25マイクロリットルのP1ウイルスストック溶液を加えて、摂氏27度で穏やかに振とうしながら48時間、細胞培養に感染させます。アセトニトリルを使用して、100ミリモルペルメトリンの段階希釈液を調製します。
次に、200マイクロリットルの感染細胞培養物に300マイクロリットルの完全増殖培地を添加し、24ウェルプレートに播種します。ペルメトリンがアセトニトリルに完全に溶解し、プレートの各ウェルに均一に送達されることを確認します。ペルメトリンを加えた後、プレートを静かに振って、ペルメトリンを培地で完全に混合します。
この後、プレートをテープで密封し、プレートを摂氏27度で48時間、暗い条件でインキュベートします。細胞培養培地をプレートから取り出し、下部に付着した細胞層を乱さないようにします。各ウェルに200マイクロリットルのMMT試薬を加えます。
次に、プレートを摂氏37度で4時間インキュベートし、各ウェルに濃い紫色のホルマザン沈殿物が形成されるまでインキュベートします。各ウェルに500マイクロリットルのDMSOを加えて、沈殿物を完全に溶解します。次に、200マイクロリットルの溶解溶液を96ウェルプレートの各ウェルに移します。
沈殿物をDMSOに完全に溶解することは、結果の精度にとって非常に重要です。プレート内のサンプルにDMSOを添加した後、沈殿物が完全に溶解するまで、ピペットを使用してサンプルを数回洗浄します。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルでプレートの吸光度値を測定します。
P1の段階では、感染率は低いです。P2段階では、感染率が大幅に向上しました。P3感染段階では、ほぼすべての細胞が細胞培養プレートからの剥離、細胞径の増加、細胞増殖の停止などの症状を示しました。
検出された吸光度値に基づいて、Md α E7発現細胞は、対照CAT細胞と比較して有意に高い生存率を示しました。この手順を実施する際には、細胞実験を行う前に、ボトルやチューブなどの物質の表面を70%のエタノールで拭くことにより、すべてのステップで細胞汚染を防ぐことが重要です。この手順に続いて、カルボキシルエステラーゼタンパク質とペルメトリンリガンドとの間の相互作用などの追加の質問に答えるために、相同性モデリングやダーク解析などの他の方法を実行できます。
この技術は、昆虫毒物学の研究者が、昆虫の殺虫剤耐性の遺伝子とメカニズムの機能的特性を探求する道を開きました。殺虫剤の取り扱いは非常に有害である可能性があるため、これらの手順を実行する際には、手袋や白衣などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
本記事では、バキュロウイルス媒介昆虫細胞発現系を用いて、イエバエのカルボキシルエステラーゼタンパク質をin vitroで調製するためのプロトコルを提示します。本研究では、ピレスロイド抵抗性に寄与するペルメトリンの代謝における、これらのタンパク質の役割の特性評価に焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 昆虫毒性学
- タンパク質発現
- 代謝研究
背景
- イエバエ（Musca domestica）は殺虫剤に対する耐性を示す。
- カルボキシルエステラーゼは、殺虫剤の解毒に関与する酵素である。
- 代謝経路を理解することは、殺虫剤耐性への対処に役立つ。
- 本手法により、機能特性解析のための大規模なタンパク質調製が可能となる。
研究の目的
- 殺虫剤耐性における代謝解毒遺伝子の関与を調査すること。
- イエバエからカルボキシルエステラーゼタンパク質を調製し、その特性を明らかにすること。
- ペルメトリンの代謝に関するin vitro研究を行うこと。
使用方法
- タンパク質生産のためのバキュロウイルス介在性昆虫細胞発現システム。
- 機能評価のための細胞ベースのMTTアッセイ。
- 酵素活性を評価するためのin vitro代謝研究。
- タンパク質発現のためのプラスミドDNAとλリコンビネーションミックスの混合。
主な結果
- イエバエカルボキシルエステラーゼタンパク質の製造に成功したこと。
- ペルメトリン代謝におけるこれらのタンパク質の役割を特性解析したこと。
- ピレスロイド抵抗性のメカニズムに関する知見を得たこと。
- 研究室の大学院生による本プロトコルの実演。
結論
- このプロトコルにより、昆虫の解毒酵素の大規模生産が可能になります。
- これらの酵素の特性解析は、耐性メカニズムを理解する上で極めて重要です。
- さらなる研究でこれらの知見を活用し、より優れた害虫管理戦略を開発できます。
よくある質問
産業界における重要性
カルボキシルエステラーゼなどの解毒酵素の機能的特性解析は、殺虫剤耐性研究におけるターゲットの妥当性確認を裏付けるものです。このアプローチにより、遺伝子発現とピレスロイドに対する代謝活性を関連付けることで、メカニズム面からのリスク低減が可能になります。このワークフローは、ベクターコントロールプログラムにおける耐性メカニズムの優先順位付けに向けた予測的な信頼性を提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 特定のカルボキシルエステラーゼアイソフォームが殺虫剤の代謝に果たす役割を裏付け、標的仮説の検証を支援する。
- 実用的価値： Sf9細胞を用いた組換えタンパク質発現により、メカニズム研究に不可欠な機能的酵素を単離する。
- 予測的価値： 酵素活性と相関する細胞生存率の向上を実証し、耐性遺伝子の機能的スクリーニングを可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 酵素活性の機能的な読み取りを可能にする、ペルメトリンへの耐性を定量化するための細胞ベースのMTTアッセイを確立する。
- 実用的価値： 実験群および対照群における殺虫剤耐性の標準化された再現性のある測定を可能にする。
- 拡張性： 生存率に基づいたエンドポイントを用いることで、酵素変異体または阻害剤の中スループットスクリーニングをサポートする。
翻訳および前臨床研究
- 翻訳的妥当性：カルボキシエステラーゼのin vitroでの代謝効率をペルメトリン分解に関連付け、抵抗性メカニズムにおけるバイオマーカーの整合性を裏付けます。
- メカニズムによるリスク低減：酵素と基質の相互作用の直接的な証拠を提供し、抵抗性経路の特定における曖昧さを軽減します。
- 経路の明確化：ホモロジーモデリングやリガンド相互作用解析などの後続研究を可能にし、構造ベースの阻害剤設計に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、機能的なタンパク質発現および活性スクリーニングを通じて標的バリデーションを可能にすることで、初期の創薬ワークフローに統合されます。
- 発見生物学：候補となる耐性遺伝子を発現させ、殺虫剤に対する代謝機能を測定することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：MTTアッセイによる定量的な生存率の読み取りにより、条件間の酵素介在的な保護作用を比較します。
- 分析：ホルマザン溶解による吸光度データを生成して細胞生存率を定量化し、処理群間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの代謝と耐性表現型を関連付け、遺伝子機能から表現型という結果までの連続性を裏付けます。
- 企業での再利用：昆虫種や殺虫剤のクラスを問わず、解毒酵素を特性解析するための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：カルボキシエステラーゼを介した解毒のメカニズムに関する知見を提供し、標的バリデーションにおける偽陽性を減少させる。
- 運用的価値：バキュロウイルス-Sf9およびMTTアッセイシステムを用いて、タンパク質発現と活性評価を標準化する。
- 戦略的価値：候補遺伝子の機能的関連性を確認することで、耐性マーカーの優先順位付けにおけるgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：代謝メカニズムを早期に検証することにより、耐性打破戦略へのリスク調整済み投資を可能にする。
実施上の検討事項
- 分子クローニング、バキュロウイルス増殖、および昆虫細胞培養の専門知識が必要です。
- バキュロウイルス発現ベクター、Sf9細胞、およびトランスフェクションおよび感染用の試薬に依存します。
- ペルメトリンの調製、MTTアッセイの実施、および吸光度測定のための標準化されたプロトコルが必要です。
- 異なる殺虫剤や酵素変異体を試験する場合、アッセイ条件の最適化が必要です。
- 機能的な酵素発現の必要性および高濃度のペルメトリンによる潜在的な毒性によって制限されます。
