ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

本手順の目的は、ペプチド三次アミド（PTA）ユニットを含むコンビナトリアルライブラリーの合成方法を実演することです。まず、天然アミノ酸からPTAサブモノマーを調製します。次に、固相支持体上でペプチドラインカー領域を合成します。

次に、PTAおよびペプチドサブユニットを含むコンビナトリアルライブラリを合成します。最終ステップとして、合成の品質を確保するために、合成したライブラリの特性評価を行います。最終的に、コンフォメーション制限されたPTAサブユニットを含むコンビナトリアルライブラリが合成され、このようなライブラリをハイスループットスクリーニングに使用することで、タンパク質リガンドを同定し、新薬発見へとつなげることができます。

本記事で扱う化学的手法は、以前に扱っていたペプチドなどの物質よりもはるかに剛性の高い分子を見つけ出そうとする試みから開発されました。剛性の高い分子ライブラリを同定できれば、標的タンパク質に対してより高い親和性で結合できると考えられ、これは今後の創薬や興味深いプローブ分子の開発において非常に重要であると考えました。本PTAサブオーダー合成の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。なぜなら、合成を成功させるには温度とタイミングの制御が不可欠であり、習得が困難なためです。

まず、8.9 gのdineと11.9 gの臭化カリウムを、マグネチックスターラーバーを入れた500 mLの三口丸底フラスコに加えます。次に、あらかじめ調製した30%臭化水素酸溶液100 mLをフラスコに加えます。フラスコを-10 °Cのエチレングリコール・ドライアイスバスに設置した後、長い針を用いてフラスコの底部からアルゴンを10分間バブリングします。

マグネチックスターラーを用いて、溶液を300 RPMで撹拌します。続いて、あらかじめ調製した亜硝酸ナトリウム溶液を、3口丸底フラスコに取り付けた圧調整付き滴下漏斗に加え、セプタムで密封します。滴下漏斗のコックをゆっくりと開き、亜硝酸ナトリウム溶液をフラスコ内に滴下させます。

バルブを操作し、滴下速度を秒間約2滴に調整します。亜硝酸ナトリウムの添加が完了した後、溶液をさらに3時間撹拌し続け、温度を-10 °Cから室温まで上昇させます。溶液の色が濃すぎる場合は、真空引きを行い、反応中に生成した過剰な窒素酸化物および発生した可能性のある臭素を除去してください。

溶液を分液漏斗に移した後、35 millilitersのdiethyl etherで目的物を3回抽出します。有機相を合わせ、飽和食塩水で洗浄した後、フラスコに回収し、硫酸ナトリウムで6時間乾燥させます。硫酸ナトリウムをろ過した後、溶媒を真空下で留去し、無色から淡黄色のオイルを得ます。

ヘキサンと酢酸エチルの3:1混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製します。同位体標識のため、L-アラニン300 mgを重水10 mLに溶解し、50 mLポリエチレンチューブに入れます。共基質としてα-ケトグルタル酸10 mgを添加した後、チューブを37 °Cまで加温します。完了後、1 M水酸化ナトリウム重水溶液とpH試験紙を用いて、pHを8.5から8.7に調整します。

次に、0.1 mgのアラニンアミノ基転移酵素を溶液に加えます。チューブを37 °Cのインキュベーターに入れ、10〜30 RPMの緩やかな振盪条件下で一晩インキュベートします。この間に、RAMリンカー付きの90 µm、10%ゲルビーズ1 gを、12 mLシリンジリアクター内で10 mLのジメチルホルムアミドに懸濁し、緩やかな振盪を行いながら3時間膨潤させます。リアクターからジメチルホルムアミドを排出し、20%ピペリジンジメチルホルムアミド溶液10 mLを加え、アミドリンカーのFmoc基を脱保護します。

ビーズを20% Pepperdine溶液で30分間振盪した後、dimethyl forma meatで5回洗浄し、Pepperdineを完全に除去します。次に、シリンジからビーズを数粒取り出し、クロラールテストで確認します。2 Mのブロモ酢酸dimethylformamide溶液を2 mLビーズに加え、静かに振盪します。

次に、2 Mの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）のジメチルホルムアミド溶液を2 mL、ビーズに加えます。プランジャーでシリンジを密封した後、シェーカーを用いてビーズを10分間振盪します。ビーズをジメチルホルムアミドで十分に洗浄した後、あらかじめ調製しておいた1 Mのメトキシエチルアミン・ジメチルホルムアミド溶液を2 mL加えます。

ビーズを振とうし、ジメチルホルムアミドで5回洗浄した後、いくつかのビーズをクロラール試験で確認します。続いて、1:1のジクロロメタン・ジメチルホルムアミド溶液10 millilitersを、先ほど使用したシリンジに加えます。1000 microliterピペットと先端を切断したピペットチップを用い、1 gramの全ビーズを3本の5 millilitersシリンジリアクターに均等に分配します。

3本のシリンジをクロロメタンで3回洗浄した後、rおよびsと表記されたシリンジを無水テトラヒドロフランで3回、Bと表記されたシリンジをジメチルホルムアミドで3回洗浄します。ブロモプロピオン酸のトリシンカップリングのため、ドラフト内でバイアルにトリシン約200 mgを加えます。バイアルにキャップをした後、バイアル内のトリシンの重量を量り取ります。

次に、20 mg/mLのトリホスゲン・テトラヒドロフラン溶液にするため、適切な量の脱水テトラヒドロフランをバイアルに加えます。ブロモ酸トリホスゲン混合液を調製するには、(R)-2-ブロモプロピオン酸と(S)-2-ブロモプロピオン酸-d4をそれぞれ89 µLずつ2つの小型バイアルに分けて加えます。各バイアルに、トリホスゲン・テトラヒドロフラン溶液を5 mL加えます。バイアルを密封した後、-20 °Cのフリーザーに20分間置きます。

その間に、2:1のテトラヒドロフラン/ジイソプロピルアミン溶液1,125 µLをシリンジRおよびSに加えます。別途、冷却したブロモ酸・ホスゲン混合物を含み白沈殿が生じている各バイアルに、2,4,6-トリメチルプリン356 µLを加えます。得られた懸濁液を直ちに修飾済みビーズに直接適用し、その後シェーカーに設置して120 RPMで2時間振とうします。

ジイソプロピルカルボジアミドを用いたブロモ酢酸のカップリングでは、2 Mのブロモ酢酸ジメチルホルムアミド溶液5 mLをシリンジBに加えます。撹拌後、2 Mのジイソプロピルカルボジアミドジメチルホルムアミド溶液5 mLを同じシリンジに加え、軽く撹拌した後、シリンジBをシリンジRおよびSと同じシェーカーに設置します。次に、シリンジをジクロロメタンおよびジメチルホルムアミドで十分に洗浄し、2時間撹拌します。シリンジR、S、Bからすべてのビーズを回収し、1つの12 mLシリンジリアクターにまとめます。

ビーズをジメチルホルムアミドで5回洗浄した後、ジクロロメタンとジメチルホルムアミドの1:1混合溶液10 mLをシリンジに加えます。分注用の先端をカットした1000 µLピペットを使用して、すべてのビーズを7本の2 mLシリンジに均等に分配し、あらかじめ調製した2 Mアミン溶液5 mLをそれぞれのシリンジに加えます。インキュベーション後、7本すべてのシリンジを60 °Cの振盪インキュベーターで一晩インキュベートします。

切断が必要なビーズをジクロロメタンで5回洗浄します。ビーズを15分間振盪し、再びジクロロメタンで洗浄した後、シリンジからジクロロメタンを排出します。その後、個々のビーズを96ウェルプレートに移します。

光学顕微鏡と先端をカットしたチップ付きピペットを使用して、96ウェルプレートにカバーガラスを被せ、-20 °Cのフリーザーで15分間静置します。プレートをフリーザーから取り出した後、ビーズが入っている各ウェルに、あらかじめ調製して冷却しておいたTFAとジクロロメタンの1:1混合溶液を20 µLずつ加えます。カバーガラスを再び被せ、96ウェルプレートをシェーカーに設置し、-20 °Cのフリーザーに戻します。

20分間振とうした後、96ウェルプレートをフリーザーから取り出し、カバースリップを剥がします。各ウェルのジクロロメタンを、空気を吹き付けることで乾燥させます。50% TFAジクロロメタン溶液を用いて室温で切断を行うと、著しい分解が観察されます。

ピーク593および484はそれぞれリンカーとPTA三量体に対応しており、分子全体がビーズ上で正常に合成されたが、切断中に分解したことを示しています。上述のような低温条件下で切断した場合、TFAによる分解量は大幅に抑制されます。切断メカニズムは既往の文献に記載されており、オレイン中間体を経由すると考えられています。PTA分子はMs/MSによって配列解析が可能であり、そのフラグメンテーションパターンはペプチドと同様です。

S-2-ブロモプロピオン酸-D4を用いて合成されたPTA分子は、S-2-ブロモプロパンやNOIC酸-D3などの不完全な反応生成物の存在により、MSおよびMS/MSにおいて一般的に幅広のピークを示します。これは、シーケンシング手順中にRキラル中心が存在することの指標として利用できる可能性があります。また、PTA分子はペプチドよりもナトリウム付加体を形成しやすい傾向があります。したがって、低ナトリウム水およびプラスチック製器具の使用が推奨されます。

もう一つの潜在的な副生成物は、アミノ化中の臭素脱離によって形成されるアクリルアミドです。アクリルアミドが形成されると、配列は停止します。これは、溶液を低減するために、一次アミンの濃度を1 molarまで下げることで解決できます。

基本的には、十分に習熟すれば、適切に実施することで2日間で適正な規模のライブラリを調製することが可能です。この化学的手法が完全に確立され、合成効率が非常に高まったことで、他の研究者の方々にも、創薬やプローブ開発に向けた立体配座拘束ペプチド模倣体の作製に、この強力な技術を取り入れていただけることを期待しています。