Name: ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶラット腎臓からの糸球体分離法。ふるい分け技術で95%以上の純度を達成し、腎疾患のメカニズム解明やフィルター障壁の研究に有用です。構造を保ったまま培養可能です。

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この作品は、アメリカ心臓協会助成金 FTF 16990086、NIH P30 DK079307、腎臓ゴットシャルク賞のアメリカの社会、ピッツバーグ医療センター競争力のある医療研究基金賞、大学、ピッツバーグ大学に支えられ医師学術財団賞を受賞。ジェラール ・ アポダカに組織学的解析、マラ サリバンと明電子顕微鏡による援助のための太陽 Yingjian 李に糸球体の保全・の技術的な入力をこのプロトコルで Youhua 劉彼の技術的な提案ありがちましょう。また、シンシア サン ティレールは CD31 抗体に感謝我々。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ピッツバーグ大学のによって承認されています。
1. ラット糸球体の分離
<ol><li>滅菌 1% 分離バッファーを準備するには、600 mL のビーカーにウシ血清アルブミン (BSA) の 5 g を追加します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 500 mL をビーカーに追加、すべての BSA は解散まで磁気攪拌棒でかき混ぜます。</li>
		<li>滅菌フィルター携帯文化フードで 1 %bsa/PBS バッファー。 注: 滅菌 1 %bsa/PBS バッファーは、4 ° c で最大 1 週間保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 に 200 g の重量を量る 2 に 4 Sprague-dawley ラットを取得します。<ol>
<li>1 分あたり試験室の容積の 10-30% の割合で 100% の二酸化炭素は導入されたチャンバーを用いた炭酸ガス吸入を介してラットを安楽死させます。呼吸の停止のための動物を観察し、二酸化炭素から除去する前に目の色が色あせた。</li>
		<li>70% エタノールで前方の腹部の上に皮膚を準備し、必要な場合に、髪を削除するバリカンを利用します。外科はさみやメスを用いて皮膚で正中切開を行います。内臓を公開する筋層を介して別の正中切開を行います。安楽死の副次的な方法として横隔膜と胸骨や肋骨を上方に切開を拡張します。</li>
		<li>分離し両方の腎臓を摘出し、ハンクス バッファー塩溶液 (HBSS) 氷の上の 30 mL と 50 mL の滅菌プラスチック円錐管に配置します。 注: いくつかのラットは同じ部屋で安楽死できるし、同じ円錐管に腎臓のすべてを配置できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無菌細胞文化フードに氷とトランスポートの腎臓を維持します。氷の上も HBSS、5 mL を含む滅菌シャーレに腎臓を転送し削除しハサミで腎周囲脂肪を破棄し、鉗子を鋭い。まだ存在する場合削除も、小さな表面的な切開することによって、腎臓を取り巻くカプセルを破棄し、シャープな鉗子を使用して優しく器官から引き抜きます。 注: は常に全体氷と実践の無菌に腎臓分離を離さない。滅菌ガーゼのワンピースは、操作中に場所で腎臓を保持する織り目加工の表面としてペトリ皿に配置できます。<ol>
<li>腎臓を半分に切って縦 (正中矢状セクション) を削除し、破棄 HBSS 5 mL で 2 番目のペトリ皿のメスと髄質 (暗い色である)。</li>
		<li>サード HBSS 5 mL をシャーレに腎皮質は主に、残りの部分を転送し、部分が 1 mm 未満のサイズになるまで、またはペーストを形成するまで滅菌かみそりの刃でミンチします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1% の 180 μ m ふるいの上下をウェット廃棄物 500 mL ビーカーに BSA/PBS。この手順は重要なタンパク質のふるいのコートし、収量を改善する糸球体の付着を軽減です。</li>
	<li>ふるいの小さい端にみじん切りにした皮質を配置し、氷の上に座って鍋底にふるいを通して組織をドロドロに 10 mL の注射器の質感プランジャー フランジ (ゴム製シールの反対側) を使用します。HBSS で定期的に洗い、サンプル希釈を避けるために可能な限り少し使用します。 注: よりここでは使用することができます 25 mL のみバッファー数 30 mL を超えないようにします。ふるいの 1 つだけ端にみじん切りにした組織を置くための理由は、全体のふるいの表面積ではなく、ふるいの一部への露出を制限することで糸球体の付着を減らすことです。<ol>
<li>そのためには、ふるいを洗うとき下のパンに収集流体を再利用します。ふるい分けが完了する、慎重に緩く付着が糸球体をキャプチャする鍋の底から 1 %bsa/PBS バッファーをもう一度ふるいの下を洗います。</li>
		<li>20 G 針装備いくつかの 10 mL の注射器に下のパンに流体のすべてを収集し、少なくとも 2 追加回針を通してそれを渡します。最後のコレクション 90 μ m ふるいを通過する準備ができるまで注射器で糸球体を含んでいる液を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>流体は、注射器で格納されている、1 %bsa/PBS 廃棄物ビーカーにウェット トップと 1% の 90 μ m ふるいの下にフラッシュして鍋底を洗う BSA/PBS。氷の下のパンの上にふるいを置きます。<ol>
<li>上記の説明と別の注射器フランジのふるいを通してふるいとドロドロの 1 つの端に注射器のサンプルを適用されます。ふるいの 1 つの端にすべてを収集するために鍋底からソリューションで洗ってください。</li>
		<li>慎重にステップ 1.5.1 のようにふるいの下を洗い、一度ふるいが完了します。50 mL のプラスチックの円錐管の下のパンにすべての流体を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 %bsa/PBS 廃棄物ビーカーとウェット上部に上下 1% の 75 μ m ふるいの鍋底を洗う BSA/PBS。氷の下のパンの上にふるいを置きます。<ol>
<li>サンプルを篩の 1 つの端に適用されます。液体を簡単に通過する必要があります。少なくとも 20 mL の 1% でトップをすすぎ廃棄物ビーカーに BSA/PBS。同様にふるいの下に慎重に洗います。糸球体は、この 75 μ m のふるいの上に残ります。</li>
		<li>HBSS を使用して、逆さまのふるいを通して洗浄によってペトリ皿で糸球体を収集します。必要に応じてできるだけ多く HBSS をここで使用します。1 つ以上 50 mL プラスチック円錐形の尿管に氷の上を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 1800 × g で遠心分離、ピペットと慎重に上清を除去、冷たい HBSS の 10 mL にペレットを再懸濁します。複数の円錐管は 1.7.2 で収集された場合は、サンプルを組み合わせます。遠心分離のステップを繰り返します。</li>
	<li>次のステップに進む準備ができるまでを 5 mL HBSS の糸球体を再懸濁します。</li>
	<li>必要な場合は、総腎糸球体のカウントを取る。このため、ピペットで 10 μ L のサンプルを取る、スライド ガラスにドロップ。顕微鏡下で表示、カウント フィールドにおける腎糸球体および総収率を取得する 500 を掛けます。 注: フィールドに見られる尿細管の数をカウントすることによって決定される純度、糸球体と尿細管の合計数で除算して構造。視覚的なフィールドに > 95% の糸球体があります。<ol>
<li>重要な管状の汚染がある場合手順 1.6.1 以降を繰り返し、1.7.1 とき手順を完了を徹底的に洗浄することを確認します。これは、ステップ管状の汚染が最も発生しやすい。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 糸球体の損傷
<ol><li>ウェルあたり約 9,000 糸球体があるので合計収量に基づく HBSS の適切な量で再懸濁します 200 x g にダウン 15 mL プラスチック円錐管とスピンの球体を収集します。24 ウェル プレートの各ウェルに 450 μ L のサンプルをピペットまたは下流の試金に合った版のフォーマットが必要な。 注: バッファーにおける腎糸球体をミックスする上下ピペッティング均一溶液を保証します。糸球体が非常に粘着性がある、重いと、お互いに固執し同様迅速かつチューブの側面にソリューションの下部に解決。</li>
	<li>6 mg/mL のプロタミン硫酸塩 (PS) ソリューションをするためには、まず PS dH2O 徹底的に 15 mL プラスチック円錐管と渦で 40 ° C に加熱の 10 mL に 1 g を溶解します。ソリューションの 30 μ L を取るし、dH2O の 470 μ L を加えます。 注: これは 6 mg/mL の溶液を生成、井戸の中に 50 μ L を追加すると下記のとおり、最終濃度が 0.6 mg/mL。<ol>
<li>、重複してプロタミン硫酸 50 μ L を追加 (これは、1:10 希釈) HBSS (マイナス コントロール) の別のグループ 50 μ L を供給しながら、1 つのグループのそれぞれの井戸。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C で 4 時間プレートを孵化させなさい</li>
	<li>スピン ・ ダウン遠心チューブ (4000 x g、4 ° C、10-15 秒) で各ウェルの内容と PBS 各 1 mL で 2 回洗浄します。</li>
	<li>最終的な洗浄を離れて吸い出しなさいし、300 μ L の PBS に再懸濁します。蛋白質の隔離、透過型電子顕微鏡 (TEM) の可視化、および蛍光抗体法 (IF) を汚すために準備する 3 つの因数に分割します。</li>
</ol>3. 解析の糸球体を準備
<ol><li>スピン ・ ダウン 3 つの因数 (4000 g、4 ° C、10-15 秒 x) とバッファーの残りのオフ吸引の内容と TEM によるサンプル分析に進む場合、または蛋白質の隔離。</li>
	<li>透過電子顕微鏡用処理<ol>
<li>0.01 M PBS で冷たい 2.5% グルタルアルデヒドの 150 μ L の糸球体のペレットを修正します。ペレット、ペレットを破壊することを確かめて、パスツール ピペットを使用して、PBS で洗浄から、定着剤を慎重に削除し、フェリシアン化カリウム 1% で 1% オスミウム四酸化の修正後。</li>
		<li>エタノールの傾斜シリーズを通して試料を脱水 (30、50、70、90、100、100、100%)、酸化プロピレン、エポキシ材を埋め込むことに埋め込みます。</li>
		<li>厚切カット (300 nm)、ウルトラミクロトームにセクション。0.5% 1% ホウ酸ナトリウムのトルイジン ブルー染色および光学顕微鏡の下でそれらを調べる。</li>
		<li>超薄切片をカット (65 nm)、酢酸ウランとレイノルドの鉛のクエン酸、それらを染色、電子顕微鏡で調べる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>場合の処理<ol>
<li>PBS 溶液 12% のゼラチンの 150 μ L を追加、すぐにドライアイス ペレットを形成します。ペレットに漬 500 μ L 2% パラホルムアルデヒド/1 の 4 ° C で一晩微量遠心チューブに PBS x</li>
		<li>基本型のペレットを置き、ドライアイスの上最適な切削温度 (OCT) 媒体を追加することによって埋め込みます。Cryotome に 5-10 μ m のセクションをカットし、蛍光抗体/免疫組織化学または標準組織学的汚れを続行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛋白質の隔離の<ol>
<li>プロテアーゼ阻害剤の 1.5 μ L で遠心糸球体ペレットと組織のホモジナイザーと dounce に RIPA バッファーの 150 μ L を追加します。</li>
		<li>プロテインの定量とイムノブロットや他のタンパク質の分析に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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これは、安価な再利用可能な機器の単純なプロトコルを用いたラット腎糸球体を回復するための効率的な方法です。すべてのプロシージャと同様、その有用性に限界があります。まず、純度 > 95% を取得私たちがプロトコルと除外不可能出発原料のふるい性質によりすべての汚染物質といくつかの赤血球と時折鋼管セグメントに表示されます文化。アプリケーションの大半のための問題にこれらの小さな異物は予定していません。第二に、ふるいプロトコルは、糸球体はマウスよりも非常に大きい、ラット腎臓の使用に依存します。マウスの糸球体が必要な場合 (例えばダイナ) 商業の磁気ビーズを用いた手法は公開された22をされています。第三に、それはその特定の Mrna を示されている (プラスミノーゲン活性化因子阻害剤 1 とコラーゲン私) ボーマン嚢からほぼ完全派生分離糸球体で、糸球体内細胞23ではなく。これは mRNA 分離しようとするとこれらの腎糸球体から不適切な結論につながる可能性があります。それは、私たちの手で糸球体の大半がカプセル化解除される、したがって弓術家のカプセルからの大きな貢献がない必要があります注意してください。第四に、細胞死は、比較的迅速に培養条件の下で発生を開始します。
わかった、アポトーシス プログラム切断カスパーゼ 3 の外観によって証明されるようがアクティブ化された文化の 2 h で始まります。これは一般にそのアポトーシス DNA の断片化、トンネル、および組織学的解析により評価した分離24後 1-2 時間以内に開始を示す以前のレポートとの契約です。しかし、初期の観察がこの timepoint16でかなり細胞生存を示唆している、少なくとも 3 時間培養分離のふるわれた腎糸球体から代謝活性を検出できることを示したことに注意もする必要があります。しかし、結果に基づいて、最良の結果を意図した実験ですぐに隔離された糸球体を利用するが賢明であろうと考えます。72 h の前にすべての実験を実行我々 は糸球体構造全体がその timepoint を超えて悪化し始めることを観察するいるとお勧めします。
それは唯一の 2 ではなく 4-8 腎臓から始まるので糸球体数は追加損失はありません、ふるいが最大限にコーティングが様々 なふるいへの付着のために失わとき高い利回りを入手しやすく。同じ理由で、糸球体では乾式ふるいに準拠するため、ふるいの 1 つの端に組織の露出を制限する可能性が高いので使用する BSA/PBS バッファー前にふるいを浸漬することが重要です。合理的な収率を取得するより少ない 6 腎臓 (3 ラット) で始まるをお勧めします。
一部の調査者は、文化17時に糸球体のうち成長する傾向がある分離の腎糸球体からプライマリ ポドサイト文化を分離しています。我々 は、いくつかの孤立した糸球体が培養皿プラスチックに付着すること、細胞が後半縦長 (分離後 72 h) で糸球体の構造から移行する開始されるを指摘しています。これらの細胞の研究はこの隔離のプロトコルの範囲を超えて、これらの細胞が足細胞、上皮細胞、または両方15,25かどうかいくつかの論争があります。特に、マンデルら、ふるわれた球体から収穫される石畳細胞が培養条件26特定の下に成熟した足細胞に区別するために誘導することを報告しています。細胞の識別に関する混乱の一部は分離の糸球体、(ボーマン嚢上皮細胞によって住まれるを含む) カプセル化されるかどうか異なりますかふるい手順で互換。180、順次ふるいサイズを使用して私たちの手で、90 と 75 μ m は互換をされている球体の大半をもたらした。
漏出の慢性腎臓病のほとんどの形態は、糸球体の透過性の増加によるものです。何人かの著者は、孤立した糸球体透過性実験前のヴィヴォを活用しています。1 つのメソッドで周囲のメディアの浸透のコンテンツを変更した後糸球体の体積の変化は透磁率27を推定する使用されました。最近では、蛍光プローブ分離腎糸球体からの漏れが透磁率を測定する定量化することができるし、糸球体疾患の実験モデル28にさらされる齧歯動物で実行できる設立。
我々 は、TEM の準備プロセスで私たちは時々 足を基底膜リフトオフ プロセス ポドサイトを見るを指摘しています。この文化で起こっていると TEM のサンプル準備の間に可能性が高いアイテムを私たちは感じていません。特に、これが発生した場合でも明らかだ足プロセスが「普通」に見える減じであるか。
全体的に、このプロトコルは、1 つが損傷に応答の形態学的および細胞の変化を評価できますメソッドを提供します。細胞外マトリックスや他のネイティブの細胞型との相互作用を検討している場合に特に分離ポドサイト文化にコンパニオン手法として使用する可能性がありますが期待しています。この衰弱させる病気の将来の治療法を開発する能力を改善する漏出 CKD に関する理解の増進のための約束を保持しています。

糸球体は毛細血管の血漿の循環ろ過を担当の専門性の高い房です。それは、腎臓の基本的な機能単位であるネフロンの初めを形作る。一意に有窓血管内皮、足、スリット横隔膜介在の基底膜、糸球体の機能が定義されます。これらのレイヤーは、濾液に物質の選択的排泄を許可する半透バリアを形成します。他の小さな分子やイオン、水一般に通過、プラズマでより大きい分子は保持しながら。足が特殊な上皮細胞基底膜に広がって足プロセスとして知られている細胞質突起を有する毛細血管を囲みます。足はされ隣接する足を処理し、ネフリン、podocin、P 型カドヘリン、ZO 11などのタンパク質から成るスリット ダイヤフラムで交差しています。断面図でこれらの足が均等に配置プロセス基底膜上。病気にかかった糸球体足プロセスなる肉眼的異常または「消去」濾液にプラズマの内容の異常な漏れに 。など、糸球体障害は一般的にタンパク質 (蛋白尿など) および/または尿中の赤血球 (血尿など) の異常に大きな量の存在によって特徴付けられます。さらに、負傷した足は、そのレギュレータ ウィルムス腫瘍 1 (WT1) 分化2,3の保守を担当するタンパク質と同様、ネフリンの発現を失います。糸球体は、糖尿病性腎症における損傷の主なターゲットと微小変化群、膜性腎症、巣状分節性など他の glomerulonephritides です。これらの病気は、進行性の腎不全末期腎疾患の開発、透析または腎移植に依存して生存の条件の主要な原因です。したがって、慢性腎臓病 (CKD) の病理を理解する糸球体を研究することが重要です。
細胞培養系は糸球体生物学を勉強するため重要です。スリット ダイヤフラム蛋白質の突然変異のため特定の漏出症の存在と同様、スリット絞りを生成する際に中心的な役割のために多くの研究は当然のことながら単独でポドサイトを利用します。これは体外で利用するプライマリ ポドサイト細胞ラインの生成をもたらした。これらの細胞はさまざまな条件下で培養することができも透磁率4を評価するために透過性のサポートに育てることができます。しかし、しばしば増殖細胞の単離は、そのポドサイト マーカーのいくつかを失っている脱分化型のセルを選択します。これは、SV40 大きい T 遺伝子 (例えばimmortomouse)、文化で育つことができるがまたの温度感受性変異を運ぶトランスジェニック マウスの系統から派生した条件付き不滅にされた足の世代につながっています。ポドサイト マーカー5の完全な配列を表現する区別されます。初代培養のこれらの方法は、理解ポドサイト生物学4,6,7で極めて重要なされています。
それにもかかわらず、1 つのセル型を含む文化不足発生する体内の接続と同様の支援体制やマトリックス、細胞間の関係とこれらの細胞の膜は必ずしも立体化ではない要約糸球体のアーキテクチャです。面倒で文化8、どちらかの immortomouse の所有を必要とする挑戦的な不死の足することができますかからの細胞の開始因数確立捜査を開始します。さらに、糸球体だけでなく足が、また毛細血管内皮細胞、基底膜とメサンギウム細胞構造のためのサポートを提供する構成されます。したがって、アプローチを開発する前のヴィヴォ利用通常糸球体を構成するすべての細胞と同様、彼らのネイティブ アーキテクチャを保持するそのままの糸球体の調査のためすべての捜査に有用です。
1958 年、クックとピカリングはウサギ腎糸球体の最初の分離を説明します。脂肪塞栓糸球体の提出になったことの観察の後彼らは、同じ大きさの粒子を使用してこれらの構造を具体的に特定できると仮定しました。確かに、腎臓の糸球体にこれらの粒子の捕捉につながったに酸化鉄粒子の注入。そのまま、純度の磁気分離9を使用して、機械的解離と腎臓のふるい分け後、糸球体は隔離されかねない。輸液は省略できます、酸化鉄とみじん切りにした人間、犬、ウサギやラットの腎臓組織10のふるい分けを実現される糸球体分離 1971 年、ミスラはことを示した。この手法は以降、調査官の目標に応じて変更されているが本質的に純化をさらに検討する可能性がまたは一次電池文化が確立された11,12をすることになりました,13,14,15,16,17。
ここで我々 はラット腎臓からそのまま実行可能な球体の隔離のためのプロトコルについて説明します。全体のプロトコルは、ほんの数時間をかかります。しか増殖しない、単に開始材料として腎臓の数を増やすことによって任意のサイズの実験計画をサポートできます。糸球体の磁気ビードの分離の公開プロトコル、ビーズの静脈注射を必要とするより高価し、ビーズ文化における腎糸球体によって保持されますいずれかまたは糸球体を必要とするので生物学を変更可能性があります」溶解"と遠心分離19による除去。マウスの糸球体に比べると、ラット糸球体 (生後 2 ヶ月のラット18ほぼ 100 μ m) の大型やすくシンプルなふるい分け法を用いた他の腎臓の構造とは異なる。
その有用性の証拠として、異なった細胞のタイプを示す糸球体を特徴付けた。生体内で糸球体を傷つけないように知られているエージェントを公開することも、これらの文化にプロタミン硫酸塩 (PS) の悪影響を示します。糸球体毛細血管壁20に沿って陰性荷電部位を中和するポリカチオン PS です。この中和糸球体濾過障壁は劇的な効果があり蛋白尿と足のプロセス卑下になります。これらの球体は、ネフリンと全体的な健康を評価するために WT1 など主要蛋白質のための immunoblots を評価できます。さらに、その構造は、光、蛍光抗体法、電顕と評価できます。
全体的に、このプロトコルはほとんど捜査官 (1 つだけ動物といくつかの単純な機器へのアクセスが必要) にアクセスできます。左損傷形態学的特徴、研究者は糸球体を分析し、どのように他の重要な細胞の種類を参照してくださいすることが、糸球体に行列保存機能と疾患の進行、ポドサイト文化の欠点に影響を与えます。

<table><tbody><tr><td>ソリューション、化学薬品、動物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley ラット</td><td>Envigo</td><td>207M</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャー</td><td>BP1605100</td><td></td></tr><tr><td>ハンクのバランスの取れた塩溶液 Ca2+ および Mg2+</td><td>Thermo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>プロタミン硫酸塩</td><td>MP バイオ</td><td>ICN15197105</td><td></td></tr><tr><td>カルノフスキーの固定剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMD EM-PX0055-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Scigen</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>RIPA バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストップ プロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモ</td><td>PI78442</td><td></td></tr><tr><td>ネフリン抗体</td><td>フィッツジェラルド</td><td>2OR-NP002</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab89901-10ul</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR-&β;抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td> <td>#3169S</td><td></td></tr><tr><td>CD31 抗体</td><td>LSBio</td><td>LS-C348736</td><td></td></tr><tr><td>切断されたカスパーゼ-3抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9661S</td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 (Luft) epoxy</td><td>Polysciences</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>円錐管,15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr>コ<tr><td>ニカルチューブ、50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>外科用鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、滅菌ガーゼ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、ペトリ皿、100 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr>メス<tr><td>、</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルター装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ふるいパン</td><td>アルファ Aesar</td><td>AA39999ON</td><td></td></tr><tr><td>180um ふるい</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39996ON</td><td></td></tr><tr><td>90um ふるい</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39990ON</td><td></td></tr><tr><td>75um ふるい</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA39991ON</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>600 mL ビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picofuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Homogenizers</td><td>Fisher Scientific</td><td>50550226</td><td></td></tr><tr><td>20 G ニードル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ ライカ ウルトラカット</td><td></td><td></td><td>ウルトラミクロトーム</td></tr></tbody></table>

ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

糸球体の構造と機能の保全は、糸球体腎炎の予防、蛋白尿慢性に最終的につながることができる腎臓疾患と末期腎疾患のカテゴリで極めて重要です。糸球体は、複雑な装置本体からプラズマのろ過のための責任です。症では、構造の整合性が失われ、尿中にプラズマ内容の異常漏出は。分離し、培養腎糸球体を調べる方法は、これらの疾患の研究にとって重要です。このプロトコルでは、構造と形態学的特徴を節約しながら、ラット腎臓からそのまま糸球体を取得する効率的な方法を説明します。このプロセスは他のネフロン セグメントから雑菌腎臓あたり糸球体の高収率を生成することができます。これらの球体とにプロタミン硫酸塩、原因となる足のプロセス卑下と動物モデルにおける蛋白尿を含む化学毒素の様々 な傷害の条件をまねることができます。損傷の程度は、透過型電子顕微鏡、蛍光抗体法、および西部にしみが付くことを使用して評価できます。ネフリンとウィルムス腫瘍 1 (WT1) レベルはこれらの文化からも評価することができます。使いやすさとこの議定書の柔軟性のため前述のまたはより良い研究糸球体健康と病気にかかった状態の構造を支援する研究者のニーズに最適な方法で分離された糸球体が利用できます。

糸球体の分離に安楽死の時間からプロトコルで 2 時間ほどで完了することができます、高スループットと効率性。8 腎臓から始まるとき技術の適切な利用にあたりラット腎糸球体の収量は 6,000-10,000 腎糸球体から範囲します。最終的な懸濁液糸球体は密集で、全体的な純度 &gt; 95%、管状のセグメントまたは他の細胞型 (図 1A, B) から最小の汚染を示します。さらに、10 月に埋め込まれた球体は形態 (図 1C) を参照してくださいにヘマトキシリンとエオシン (H &amp; E) 汚れと汚されることがことができます。これらの球体は、処理後も全体のプロトコルを通してそれらの構造を維持します。孤立した糸球体がそのままで、実行可能な足 (図 2A)、メサンギウム細胞 (図 2B) と血管内皮細胞 (図 2C) を有していることを示す.
一度分離、糸球体が生体内で病理学をシミュレートするためによく知られている化学傷害に公開できます。この場合、プロタミン硫酸塩 (PS) は、最終的にプロセスの卑下を足につながる糸球体濾過障壁の電荷を混乱させる能力に選ばれました。PS 処理糸球体ネフリン (赤) の顕著な削減と核 WT1 (緑)経由で蛍光抗体法 (図 3A, B) の正の数があります。糸球体は、透過電子顕微鏡 (図 3C) 用も用意できます。コントロールのサンプル通常ポドサイト形態と PS を投与した糸球体がポドサイト障害のサインであり PS21を使用して体内のモデルに見られる足プロセス卑下 (図 3D) プロセスの足。これはネフリン (図 3E, F) のイムノブロットによる検出の減少にも対応しました。
生存率を決定するには、切断カスパーゼ 3 がアポトーシス マーカーとして評価されました。切断カスパーゼ 3 は蛍光抗体法を使用して、最初分離 (図 4) 後 2 h を開始いくつかのセルに表示されます。このプロテアーゼを発現する細胞数になった 24、48 h で最高水準と時間をかけてより豊かです。そのアポトーシスは文化の早い段階で比較的発生が示唆された最良の結果のための分離後すぐに下流のアプリケーションを実行することとします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig1.jpg"> 図 1.分離後のラット糸球体文化の典型的な外観。(A) 糸球体文化の明視野イメージ。我々 は、この顕微鏡写真 (矢印) で単一腎尿細管がフィールドを選んだが得られた文化は、一般的に純度 &gt; 95% です。スケール バーは、100 μ m (B) 拡大画像の単一の糸球体を等しくなります。単一の糸球体の (C) ヘマトキシリンとエオシン染色。B および C のスケール バーは等しく 10 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig2.jpg"> 図 2.孤立した糸球体における構成細胞の種類が保持されます。ネフリン (赤、足) と足細胞、メサンギウム細胞、内皮細胞特異マーカーの共焦点蛍光顕微鏡観察を行った。ネフリンと WT1 のため (A) Costain (緑、足)。(B) Costain ネフリンの試験-β (グリーン、メサンギウム細胞、矢印)。ネフリンの CD31 (C) Costain (緑、血管内皮細胞、血管断面矢印マーク)。スケール バーのすべてのパネルに 25 μ m を =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig3.jpg"> 図 3.ポドサイト傷害誘導培養ラット糸球体を使用することができます。(A) 共焦点蛍光顕微鏡ネフリンと WT1 の未処理の糸球体文化。染色 (赤) 線形ネフリンと一般的に健康的な足に見られる WT1 陽性核 (緑) の存在に注意してください。(B) 後、プロタミン硫酸塩治療、ネフリンの発現は減少し、非線型の WT1 はありません、ポドサイト障害を示します。(C) 伝送電子 microscpy (TEM) 映像足プロセス、基底膜と有窓血管内皮細胞の正常な糸球体構造の典型的です。Equals 500 nm バー。(D) プロタミン硫酸塩後足プロセスが細長いまたは (矢印) を減じ、ポドサイト障害を示します。ネフリンを示すため (E) 西部のしみは、プロタミン硫酸塩治療後ネフリンを減少しました。西部のしみの負荷制御 (F) アクチンが表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig4.jpg"> 図 4.孤立した糸球体の細胞生存率の評価します。共焦点蛍光顕微鏡を用いた切断カスパーゼ 3 (緑) を行った。ネフリン共同染色は、糸球体を容易に見つけるため行われました。糸球体の分離後 0 と 1 h で切断カスパーゼ 3 陽性でしたがない、いくつかの細胞の蛍光信号を認めた 2 h で徐々 により多くの細胞になって肯定的な長い分離した後.カスパーゼ 3 陽性細胞数の最大が 24、48 h で認められた<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルの主な焦点は、効率的にさまざまな下流のアプリケーションで使用するための最小限の汚染物質と実行可能な主な糸球体の文化を分離することです。孤立した糸球体コンポーネント セル型の構造の関係を維持、培養前のヴィヴォ短時間のためにすることができます。

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

この方法は、腎臓病の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。特に正常および罹患状態における糸球体の理解において。糸球体生物学は、様々な細胞型とそのユニークな構造のために研究が困難な場合があります。この技術の主な利点は、簡単な方法と機器を使用して、無傷の糸球体の容易に利用可能なソースを提供することです。この技術は、正常および疾患腎臓における濾過障壁の理解に影響を及ぼす。特に、糸球体損傷が血清タンパク質の尿への異常に高い分泌につながるタンパク尿性慢性腎臓病の理解に光を当てることができます。一般的に、この技術に新しい個人は、最終サンプルで十分な収率と純度を得ることが困難になります。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるブリトニー・ラッシュです。まず、毛髪クリッパーを使用して安楽死させたラットの前腹部から毛髪を取り除きます。70%エタノールを使用して、露出した皮膚を洗浄します。次に、手術用ハサミを使用して、皮膚に中線切開を行います。内臓を露出するには、筋層を通して正中線の切開を行います。腎臓を見つけて隔離し、30ミリリットルのハンクの緩衝塩溶液またはHBSSを氷の上に置いた滅菌50ミリリットルプラスチック円錐形チューブに入れます。氷上のチューブを無菌細胞培養フードに移します。氷の上に置かれたHBSSの5ミリリットルを含む無菌ペトリ皿に腎臓を移す。はさみと鋭利な鉗子を使って、色素の脂肪を取り除き捨てます。腎臓を取り巻くカプセルを取り除いて捨てるには、小さな表面切開を行い、鋭い鉗子を使って腎臓からそっと引き離します。5ミリリットルのHBSSを持つ2番目のペトリ皿の無菌ガーゼに腎臓を置き、各腎臓を中射矢セクションを通して半分に分けます。メスを使用して、暗い色と中央の位置で識別できる髄質を取り除き、廃棄します。主に腎臓皮質を含む残りの部分を、5ミリリットルのHBSSを含む第3のペトリ皿に移す。滅菌カミソリの刃を使用して、ピースのサイズが1ミリメートル未満になるまで、またはペーストが形成されるまでミンチします。1%BSA PBSを使用して、500ミリリットルの廃棄物ビーカーの上と底部を180マイクロメートルのふるいに濡らします。このステップは、ふるいをタンパク質でコーティングし、糸球体の付着を減少させ、歩留まりを改善するので非常に重要です。混合皮質をふるいの小さな端に置きます。10ミリリットルの使い捨て注射器のテクスチャ付きプランジャーフランジを使用して、ふるいを通して氷の上に置かれた底鍋に組織をマッシュします。サンプル希釈を避け、底鍋に集めた流体を再利用してふるいをすすいでください。ふるいを完了した後、慎重に緩く接着糸球体をキャプチャするために、鍋の底からHBSSでふるいの底を洗います。底の鍋からすべての流体を20ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器に分けます。針を通して流体を少なくとも3回下の鍋に通します。最後のコレクションでは、90マイクロメートルのふるいを通過する準備ができるまで、注射器に液体を含む糸球体を保管してください。一方、底鍋を1%BSA PBSで洗い流し、廃ビーカーに洗います。1%BSA PBSを使用して90マイクロメートルのふるいの上部と下部を濡らし、底部の鍋の上に置きます。注射器のサンプルをふるいの1つの端に塗布します。テクスチャ化されたプランジャーフランジを使用して、以前のようにふるいを通して組織をマッシュします。下部のパンから溶液を使用して組織を洗浄し、ふるいの1つの端からすべてを収集します。ふるいが完了したら、鍋の底からHBSSバッファーでふるいの底を慎重に洗い、緩やかに接着することができる任意の糸球体を捕捉します。底部の鍋から50ミリリットルのプラスチック円錐形の管にすべての流体を集めます。1%BSA PBSを使用して、底鍋を廃ビーカーに洗います。その後、1%BSA PBSを使用して、75マイクロメートルのふるいの上部と下部を濡らします。氷の上に置かれた底の鍋の上にふるいを置きます。液体が簡単に流れるふるいの1つの端にサンプルを適用します。1%BSA PBSの最低20ミリリットルでふるいの上部を無駄なビーカーに洗い流し、慎重にふるいの底を洗います。75マイクロメートルのふるいの上部に残った糸球体を収集するには、ペトリ皿に糸球体を収集するために必要なだけ多くのHBSSでふるいを逆さまに洗い流します。ふるいにかけた糸状の糸球体を氷の上の50ミリリットルのプラスチック円錐形の管に集める。摂氏4度で5分間Gの1800倍の遠心分離機をした後、ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。冷たいHBSSの10ミリリットルでペレットを再中断します。サンプルを組み合わせて遠心分離を繰り返します。糸球体は5ミリリットルのHBSSで再中断する。総糸球体を数えるために、サンプルの10マイクロリットルの滴をガラススライドに置き、顕微鏡下で数え、500で倍数して総収量を得る。孤立した構造は、管状構造のないほぼすべての糸球体で構成されるべきである。チューブが存在し、ダウンストリームアプリケーションに影響を与える場合は、サンプル全体を90マイクロメートルのふるいに適用し、その時点以降のプロトコルを繰り返すことで除去できます。ここで説明するプロトコルは、糸球体を単離する際に効率的であり、最終的な懸濁液は、95%を超える純度と管状セグメントまたは他の細胞タイプからの最小限の汚染を有する糸球体が密に詰まっている。これらの糸球体は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色して、それらの形態を見ることができる。さらに、処理後もプロトコル全体にわたってその構造を維持します。それらは無傷で生き生き可能なポドサイト、メサンギアル細胞および内皮細胞を保持する。孤立した糸球体は、生体内病理をシミュレートするために化学的傷害にさらされている。具体的には糸球体濾過バリアの電荷を乱すプロタミン硫酸塩。健康な糸球体とは対照的に、プロタミン硫酸処理糸球体は、WT1に対してネフロンおよび多数の核陽性の顕著な減少を有する。透過電子顕微鏡で見ると、健康な糸球体は典型的な足のプロセスを示す。プロタミン硫酸処理後、足のプロセスは、ポドサイト損傷を示す細長いまたは汚れている。単離糸球体での細胞生存率を決定するために、切断カスパーゼ3はアポトーシスマーカーとして観察された。糸球体の分離後、ゼロと1時間後に切断カスパーゼ3はありませんでした。いくつかの細胞は、時間の経過とともに進行性の増加と2時間と4時間でアポトーシスの徴候を示した。アポトーシス細胞の最大数は24時間と48時間で注目された。これらの結果に基づいて、ほとんどの実験では、分離直後に分離糸球体を使用することをお勧めします。この手順を実行する場合、迅速かつ効率的に作業することが重要です。腎臓が単離された瞬間から、糸球体が悪化し始める。糸球体を素早く分離すればするほど、ポーズ、隔離、操作にかかる時間が増えます。単離後、単離された糸球体は、生理学的または病理学的状態を刺激するために化学的または生物学的薬剤にさらされる可能性がある。そして、標本はタンパク質またはRNAの単離、構造学または免疫蛍光および電子顕微鏡のためのプロセスであり得る。1950年代の開発以来、この技術は、糸球体生物学の研究に研究者を支援してきました。全体として、このプロトコルは、正常および罹患状態における無傷の糸球体の形態学的および細胞特性を評価する方法を提供する。この方法は、タンパク尿性慢性腎臓病の理解を助け、将来の治療法の開発に役立ちます。

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この記事では、熱不安定性サルウイルス40および光活性化可能なミトコンドリア、PhAMを切除したトランスジェニックマウスの腎臓から条件付き不死化糸球体内皮細胞を単離する方法について説明しています。ビーズを用いた腎臓全体からの糸球体単離の手順、消化ステップ、播種、およびGECs-CD31陽性の培養について説明します。...

蛍光ミトコンドリアによる条件付き不死化マウス糸球体内皮細胞の単離

この研究は、CUBIC透明マウス腎臓からの糸球体を標識および分析するための、使いやすく完全でシンプルな一連の方法を提示します。糸球体数や体積などのデータは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)、または一般的な共焦点顕微鏡とImarisなどのソフトウェアを使用して簡単かつ確実に取得できます。...

マウス糸球体の標識と分析のための効率的で迅速な方法

この研究では、マウスメサンギウム細胞(MC)とその ex vivo...

マウス糸球体メサンギウム細胞の単離と精製の最適化

学ぶラット腎臓からの糸球体分離法。ふるい分け技術で95%以上の純度を達成し、腎疾患のメカニズム解明やフィルター障壁の研究に有用です。構造を保ったまま培養可能です。

ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

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