ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

この手順の全体的な目標は、ネフロンのろ過ユニットをうまく視覚化し、ろ過バリアを越えてin vivoで尿路空間への蛍光高分子のろ過を定量化することです。これは、最初に生きた動物用の顕微鏡ステージを準備することによって達成されます。次に、腎臓を露出させ、ラットをステージに置きます。

次に、個々の糸球体が特定されてマッピングされ、背景の3D画像が取得されます。最後に、蛍光アルブミンを注入します。個々の糸球体の3Dボリュームを取得し、透過性を定量化します。

最終的には、バイアル内2光子顕微鏡の使用により、腎臓の糸球体全体の高分子のろ過係数を示す結果を得ることができます。2光子顕微鏡の主な利点は、糸球体濾過と近位尿細管再吸収およびトランスサイトーシスの両方を動物で同時に定量化できることです。同時に、この技術の意味は、糸球体濾過と近位尿細管の両方の役割を理解することの重要性として、機械論を超えて診断および治療にまで及びます。

アルブミンの再吸収は、治療の標的を決定する上で重要です。ラットに麻酔をかけた後、頸静脈または大腿静脈のいずれかに留置静脈アクセスラインを挿入し、胸郭のすぐ下から左大腿部のすぐ上まで左脇腹を剃ります。これは非生存手術です。

ラットを右側に平らに置き、剃った左側が上を向くようにします。ベンチに平らに置き、姿勢を伸ばし、しゃがんでいないことを確認し、前足が互いに触れ合い、後足が非常に優しく触れていることを確認してください。触診して腎臓を感じ、後腹膜内のどこに自然にあるかを判断し、シャーピーを使用して一対の歯の鉗子で体に平行な直線を描きます。

皮膚をつまみ、止血剤を使用して描かれた線に沿って皮膚をつまんで組織を押しつぶし、外科用ハサミを使用して出血を防ぎます。切開部に沿って切ります。必要に応じて薄くなる外側の筋肉層をカットする場合も同じ手順を使用します。

露出させる内側の筋肉層への切開による出血を防ぐために、止血剤を使用してください。腎臓を触診してサイズを推定します。腎臓よりも小さい切開線をつまんで、切開が腎臓のすぐ上にあることを確認します。

この切開部は小さすぎ、必要に応じて大きくするのが最善です。腎臓の位置を特定し、鉗子を使用して周囲の脂肪をつかみ、手をつないで腎臓の底極に向かって働きます。腎臓の下極に到達したら、腎臓を切開部からそっと引っ張り、腎臓の下を非常にそっと絞って腎臓を外部にします。

切開部が小さすぎる場合は、筋肉層をつぶして切り込み、幅を広げます。ラットの腎臓を外部化し、ラットを顕微鏡ステージに置いてイメージングした後、腎臓を外部化する手順を繰り返します。顕微鏡に、デュアルパスフルオレセインロッド、ドミンフィルター、および低倍率対物レンズを使用して位置をマーキングできる電動ステージが装備されている場合、近位尿細管に囲まれた空の円形構造として現れる個々の糸球体を見つけて中心に

固有の黄橙色の自家蛍光で各位置をマークし、砲塔を高出力の水浸対物レンズに切り替え、各糸球体の3Dデータセットを撮影します。キャピラリーループとボウマンスペースがはっきりと見えることを確認します。擬似カラーパレットを使用すると、これらの構造を視覚化するのに役立ちます。

次に、表在性血管に焦点を当ててゆっくりと蛍光アルブミンを注入し、糸球体cing係数またはGSCが低い分子の全身分布を可能にするための時間が与えられていることを確認します、血漿中の強度値を最大化することが不可欠ですが、顕微鏡の光検出器を飽和させるレベルに達しないようにする必要があります。これにより、ろ過された分子の検出可能性が向上します 約10分待って、潜在的な低分子量の断片がクリアされるようにした後、メタモルフ画像処理ソフトウェアを使用してアルブミンの計算に使用する1ミクロン間隔で3Dボリュームを取得します。蛍光アルブミンを含むボリューム内の各糸球体の背景画像とともに、3Dデータセットをロードします。

定義されたマージンとボーマンのカプセルの端との間に十分な空きスペースがある表面の毛細管ループを見つけます。バックグラウンドボリュームで。同じ焦点面を配置し、そこにはアルブミンを含む画像のすべての視覚的な手がかりが含まれている必要があります。

対象のキャピラリーループ内の領域を選択し、平均強度の読み取り値をメモします。次に、ボウマン空間内の領域を選択し、平均強度の読み取り値をメモします。これらは、定量のバックグラウンド値として使用されます。

アルブミンを含む画像のボウマン空間内の類似領域を選択します。これを少なくとも 2 つの他の領域に対して行い、Bowman 空間内の平均強度の値を取得します。プラズマ強度が最も明るいキャピラリーループを選択し、その周囲に領域を描きます。

次に、閾値機能を使用して、循環する血漿内の明るい値を強調表示し、循環する赤血球の暗い縞を避けます。選択したプラズマ空間の平均強度値に注意してください。血液中の因子は血漿蛍光レベルの過小評価を引き起こすだけであるため、血漿の明るい領域を優先的に選択することが重要です。

Excelスプレッドシートに値を入力してGSCを計算します(GSCは生のボウマンスペースの差に等しくなります)。強度からバックグラウンドを差し引いたボーマン空間強度を、生の毛細管ループ強度からバックグラウンド毛細管ループ強度を差し引いた差で割った値。ろ過された蛍光アルブミンの取り込みは、主に近位尿細管の初期セグメントで発生します。

Sの1つは、このパネルは、最初のテキサスレッドRSAボーラスの注入の約20分後にミュンヘンのWistarプロンプターラットから採取された糸球体とSの1つのセグメントの断面を示しています。ボウマン空間の開口部と赤のアルブミンの熱心な取り込みは、Sの1つのセグメントに示されています。このパネルは、同じデータセットの浅い 20 ミクロンの 3D 投影を示しており、ここに示されているのは、注入後約 60 分で撮影された低電力投影です。

これらの画像は、生体内顕微鏡法が濾過後の注入材料の運命を視覚化できることを示しています ある程度裏付け、ここに示されている観察された濾過係数は、表面糸球体から撮影された画像です。このパネルは背景画像であり、この画像はテキサスレッドラット血清アルブミンの注入後約12分で撮影されました。これらの 2 つのパネルは疑似カラーで描画されます。

ボウマンの空間に描かれた3つの小さな関心領域を使用して、ろ過障壁を越えて移動した蛍光アルブミンの平均強度を計算します。個々の領域の平均強度値は、領域統計の表示ダイアログボックス内の強調表示された領域に報告されました。この個々の糸球体について導出されたアルブミンのGSC値は0.0111で、給餌状態のとき、このミュンヘンの星型ラットの系統の範囲内に収まります。

この手順に続いて、量的および定性的分析などの他の方法を他の腎臓構造に対して実施して、尿路空間への濾過後の高分子の最終的な輸送などの追加の質問に答えることができるその開発後。この技術により、腎臓生理学の研究者は、動的な生理学的および病態生理学的プロセスを一度だけでなく、縦断的に探求することができました。時間が経つにつれて、それはそうでした。