培養色素脱失活動の定量化

化学物質の in vitro の色素脱失活性を評価するための 3 つの実験的方法を述べる: 1) 細胞のチロシナーゼ活性および 2) メラニン コンテンツ、および 3) メラニン細胞のメラニン色素染色と画像解析による測定の定量化。

この方法は、抗メラノジェニック活性を有する機能性化粧品および皮膚剤の開発に有用であり得る。それは実行する必要があり、結果はすぐに得ることができます。さらに、この方法は、研究者のために有用であり得る, 効果や化合物を同定または調査したり、前起性または原発性の活性を調査したい人.

チロシナーゼ活性を測定するには、細胞培養インキュベーターで24時間完全培地中のウェル当たり4番目の細胞にB16-F10メラニシドを5回10回から4番目の細胞に播種することから始める。翌日、各ウェルの上澄み物を、作りたての試験化合物と阻害剤コントロールまたは陰性対照で補ったDMEMに置き換え、プレートをさらに72時間インキュベーターに戻します。治療の終わりには、井戸あたり300マイクロリットルの冷たいPBSで井戸を2回すすいで、プレートを氷の上に置きます。

次に、セルスクレーパーを使用して各ウェルに300マイクロリットルのライシスバッファーを加え、5分後に細胞ライセートを収集します。得られた細胞粒子懸濁液を個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。そして、ライセートを14、500rpmで2秒間3回均質化し、細胞間チロシナーゼを放出する。

遠心分離によって細胞の破片をペレットし、氷上の個々の1.5ミリリットル遠心管に上清を移す。クリア96ウェルポリスチレンマイクロプレートの個々のウェルに各上清の70マイクロリットルを割り当て、上清の各ウェルにチロシナーゼ基質溶液の140マイクロリットルを追加します。●プレートを優しく振って、ウェル内容物を混ぜます。

その後、2時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。そしてマイクロプレートリーダー上の475ナノメートルでチロシナーゼ活性を測定する。処置した細胞のライセートを収集した後の細胞のメラニン含有量を測定する。

遠心分離によってライセートを収集し、新しいチューブに上清を転送します。摂氏60度で1時間のインキュベーションのために各ペレットに1つの通常の水酸化ナトリウムの300マイクロリットルを追加します。その後、溶解した細胞懸濁液の遠心分離が続いた。

その後、上清の200マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに移します。そして、400ナノメートルの波長でマイクロプレートリーダー上のメラニン内容物を測定する。フォンタナ・マッソン染色の場合、処理した細胞を300マイクロリットルの冷たいPBSで2回洗浄し、摂氏4度で1時間10%ホルマリンの200マイクロリットルで細胞を固定します。

濃厚な細胞を蒸留水ですすい、58~68°Cの200マイクロリットルを各井戸に加えます。摂氏37度で1時間のインキュベーション、または細胞が黄色褐色になるまで。染色した細胞を蒸留水でリンスし、その後室温で0.1%の塩化金で2分間インキュベートします。

蒸留水で処理した金の塩化物を、200マイクロリットルのチオ硫酸ナトリウム溶液を細胞に加えます。2分後に再び細胞をすすきます。そして、5分間、ウェルあたり200マイクロリットルの核高速赤で細胞にラベルを付けます。

次に、染色した細胞を水道水で洗浄してから、光学顕微鏡でイメージングします。しきい値解析の場合は、画像 J で画像を開き、画像、調整、およびカラーしきい値を選択します。Fontana Masson で染色された領域を測定するには、明るさパラメータバーをゼロに設定し、黒または茶色の染色セルがすべて含まれる位置に明るさを調整します。

[パーティクルの解析と解析] を選択し、[パーティクルの解析] ウィンドウの [集計] ボックスをオンにし、[問題] をクリックして結果の概要を取得し、データをスプレッドシートにコピーして貼り付けます。アルブチン処理は、制御車両処理細胞と比較して細胞性チロシナーゼ活性を有意に抑制する。同様に、アルブチンで刺激された細胞のメラニン含量は、コントロールに比べて有意に減少する。

細胞は治療群間で形態学的に類似しているが、アルブチンは、コントロール処理された細胞と比較して黒色色素の面積を減少させる。この方法は、複合ライブラリーを使用した活動スクリーニングに役立ちます。迅速にテストするサンプルの数百以上があります。

また、この方法は、メラニン生成を伴うメカニズムを調べることもできます。生物活性候補化合物が同定された後、生物学的メカニズムまたは商用アプリケーションの研究に対する彼らの証言のために。