Name: 培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶマウス前立腺葉の解剖・組織学的識別法と一次細胞の3Dスフェロイド培養技術。遺伝子改変マウスモデルを用いた前立腺がんのin vivo・in vitro解析に有用です。

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この作品は、LK に R01CA161018 国立がん研究所からの助成金によって支えられました。

ここで説明したすべてのマウスの実験は、SUNY アップステート医学大学で機関 IACUC 承認プロトコルで説明したガイドラインに従って行われました。
1、泌尿・生殖器 (UGS) 郭清
メモ: 回路図は、図 1に提示されます。
<ol><li>CO2吸入安楽死法または別の承認手法を使用して 3 ヶ月歳の男性 c57bl/6 マウスを安楽死させます。 注: マウス 3、12 ヶ月の年齢の間は、実験のため正常に使用できます。古いマウス (> 6 ヶ月) はほとんどクリアする必要がありますの UGS の周りより多くの脂肪をあります。葉の分離・同定マウス 3 ヶ月未満では困難です。他の系統は、実験では、同様に使用できます。</li>
	<li>その裏にマウスを置き、動物の腹部の側面を露出するようにピンを使用して足を保護します。</li>
	<li>マウスの腹部に 70% エタノールをスプレーし、拭きとってください。 注: は、郭清は必須ではありません前に、腹部毛を剃る。</li>
	<li>中の鈍い鉗子のペアで筋層と共に、腹部から皮膚を持ち上げ、はさみを使用して腹部に逆 Y 字切開を行います。<ol>
<li>直線切開をおきます (図 2 a) 胸骨に陰茎のすぐ上からはさみのペアを持つ。</li>
		<li>太もも (図 2 b) までのそれぞれのつま先に向かって切開の根元からカットします。皮膚を両側、腹部領域全体 (図 2 ce) を表示する下部折り返し。 注: カットのサイズは異なりますマウスの年齢やサイズによって異なります。初期のストレートの切開の大きさは、1.5 からマウスのサイズに応じて、4 cm まで及ぶかもしれない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>他の臓器に移動、UGS を公開します。持ち上げ、移動茶色黄色腸 (図 2 f)。鉗子で腹部の脂肪パッド (不透明な白い海綿状組織) をピックアップし、側面 (図 2 g) に移動します。 注: UGS は、精嚢、尿道、前立腺、精管 (精管) と膀胱の装備されています。ベースに接続されている膀胱の液体で満たされた嚢と不透明な白い半円形アーチ (精嚢腺である) の特性の組み合わせによって識別できます。精嚢の右下にある半透明の組織は前立腺です。</li>
	<li>UGS を見つけて、しっかり膀胱を持つ鈍い鉗子とマウスの腹部から上向きに UGS の全体を持ち上げます。 注: 膀胱がいっぱいの場合排水それ最初小さい注射器鉗子でよりよいグリップを提供し、膀胱を破裂のリスクを減らします。</li>
	<li>膀胱、スライド、背骨に膀胱と前立腺の下にはさみのペアを引き上げ、カットを作成し続けています。(図 2 hと2 i) 腹腔内に残りの接続をカットします。すべての前立腺組織を誤って切断を避けるために UGS を余りに近くを切らないように注意してください。 注: UGS の下でカットしながら、ハサミを挿入するマウスの奥にカット スナップ脊柱だけでなく。このメソッドは、ほぼすべて、UGS とマウスから組織を抽出に必要な時間を短縮、1 つ切り取り領域で腹腔との間の接続の切断の結果します。</li>
	<li>UGS を削除し、(十分な組織を被覆する) 2-6 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) またはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、高グルコース) 6 cm シャーレ (図 2 jと2 k) に、解剖顕微鏡 (10 X に移動倍率)。 注: 必要に応じて残りの手順に解離性のメディアを変更します。</li>
</ol>2. 前立腺の解剖
<ol><li>微細鉗子と顕微解剖はさみ (図 3 a) のペアで背側と腹側の両方の側面からのすべての脂肪をオフにします。解剖のプロトコルの残りの部分のような手術器具を使用します。 注: 脂肪はしばしば密接に絡んだ UGS (その白い海綿状の外観で識別することができます)。したがって、誤ってすべての前立腺組織を離れて切り取ることを避けるために慎重に、この手順を実行する必要があります。すべての脂肪をクリアするまで 10-15 分かかります。</li>
	<li>保持し、鉗子で膀胱を引き出します (図 3 b) ハサミ基地でそれを切り取る。</li>
	<li>残りの組織の腹側を上に置きます。鉗子で 1 つの精管を押したまま、ハサミでは、ベースにそれをトレースし (図 3 c)、それを切り取るし、反対側に繰り返します。今を残して前立腺 (半透明・ verminous)、精嚢、精管を削除 (不透明、白、半円形) と尿道 (ピンク、赤および不透明な管) (図 3 d ・ 3 e)。</li>
	<li>精嚢と前立腺組織前葉の内側のアーチの間に鉗子を挿入します。詮索離れて精嚢と前立腺と必要な (図 3 f) として任意の結合組織を切り取る。基地尿道に精嚢をトレースし、(図 3 gと3 h) それらを削除します。それらを穿刺しないように注意します。</li>
	<li>個々 の前立腺の丸い突出部を分析に進みます。</li>
</ol>3. 前立腺と個々 の葉レーザーマイクロダイ セクション (図 4、3 i n の数字) の肉眼解剖学
<ol><li>背側、背側の葉は、蝶の羽のようになりますを示す直面しているので、鈍い鉗子のペアを持つ組織を反転します。</li>
	<li>鉗子で耳たぶを押し (図 3j) ハサミ基部に snipping 背側葉を収集します。</li>
	<li>腹側に残りのティッシュを裏返します。</li>
	<li>小さい側の葉を収集し、通常前方、腹側、背側葉 (図 3 k) で挟まれた、側で、尿道をラップします。</li>
	<li>次に、外側の葉よりも大きいの尿道にうそを腹側腹葉を収集 (図 3 l)。</li>
	<li>最後に、前葉、切断し、尿道 (図 3 m) を破棄して、4 つの最大の収穫します。</li>
	<li>実験的ニーズに応じて組織部分を処理します。、組織学のためのセクション 4、または回転楕円体文化のセクション 5 に進んでください。</li>
</ol>4. 葉同定とヘマトキシリンとエオシン染色スライドからの形態
<ol><li>前立腺の組織を修正し、パラフィンに埋め込みます。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) や、オリベイラらによって規定される特性を利用した、組織学に基づく前立腺の葉の違いを特定するとスライドを染色を続行します。12 (図 5)。</li>
</ol>5. 3次元培養10組織の処理
注: これは図 6の通りです。
<ol><li>培養実験のニーズに従って全体前立腺または個々 の葉を続行します。前立腺の組織を含む DMEM の 2-3 mL 10 cm 皿に転送します。メスと細かくと解剖顕微鏡下で可能な限り均等に前立腺の尿細管をミンチします。</li>
	<li>無菌条件下でのティッシュ文化フードの下で残りの手順を続行します。</li>
	<li>15 mL チューブに、DMEM と共に組織部分を転送し、DMEM に 9 つの mL にボリュームを増やします。DMEM 組織の混合物と混合する渦に 10 x コラゲナーゼ原液 1 mL を追加します。 注: は、コラゲナーゼ原液はロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 中 10 mg/mL と 15 mL チューブに最終濃度が 1 mg/mL。</li>
	<li>細胞外のマトリックスを低下させるコラゲナーゼの 37 ° C で 2 h の回転子をチューブまたはジャイレトリ ・ シェーカーでチューブを配置します。</li>
	<li>室温で 5 分間 400 x g でチューブを遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、細胞間や細胞-マトリックス接着斑を切断する暖かい 0.05% トリプシン-EDTA の 2 mL で再懸濁します。チューブを 5 分の 37 ° C に転送します。 注: 組織塊が大きすぎるため、よく混ぜる場合、より広い穴をするかみそりの刃でピペット チップをカットします。</li>
	<li>8 〜 10 倍、P1000 ピペットでピペッティングし、P200 ピペットを繰り返し、組織塊を破る。</li>
	<li>完全な DMEM の 3 mL のトリプシンを中和します。DNAase の 500 U を追加私とよくミックス。</li>
	<li>18 G 針で 5 〜 10 回を 5 mL のシリンジを通過します。20 G 針を 5 回を通過します。</li>
	<li>ソリューションにはまだ大きな組織塊が含まれている場合は、もう一度手順 4-8 を繰り返します。</li>
	<li>フィルター 40 μ m のフィルターを通して細胞懸濁液は、50 mL のチューブに配置されます。DMEM の 5 mL と 15 mL の管を洗い、同じフィルターを通過します。すすぎを繰り返します。</li>
	<li>フィルターを破棄し、室温で 5 分間 400 x g で通過を含むチューブを遠心します。</li>
</ol>6. めっきと、細胞を培養
<ol><li>完全な前立腺上皮細胞成長培地 (PrEGM) の 0.5 mL にペレットを再懸濁します。細胞カウンターまたは検定を使用して細胞密度をカウントし、5 x 105セル/ml に完全な PrEGM 細胞を希釈します。 注: 3 月齢マウス全体前立腺からの収穫の 3 x 10 の5-106セル範囲です。したがって、低収量とも、目的のセル密度を達成できますように (前述) に PrEGM の以上 0.5 mL にペレット再懸濁します最初に重要です。</li>
	<li>ミックス 2:3 容積比 (60% 基底膜 ECM と 40% 細胞懸濁液) とウェル プレートや実験のニーズに従ってチェンバー スライド プレートで基底膜 ECM とセルの必要量。 注: 免疫染色、ガラス底板やチャンバー スライド プレートの井戸や、井戸の中の全体をカバーします。結果オルガノイドを数える場合井戸の縁に板やプレートも中に数滴の高いボリュームをめっきする場合。厚すぎる、または薄すぎる広がっていないことに留意します。めっき技術分野; の 1 cm2あたりマトリックス セルの混合物の少なくとも 100 μ L をプレートします。などで 2 cm2とチェンバー スライド-よく表面積, 5 x 10 の4セルを含むマトリックス セルの混合物を 200 μ l 添加をメッキする必要があります。</li>
	<li>プレート/スライドを基底膜を固めるための ECM を 30 分間 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターに転送します。まあ、基底膜 ECM プラグを邪魔しないように世話をカバーするために予め温めておいた完全な PrEGM を追加します。</li>
	<li>メディアの半分を削除し、2 〜 3 日ごと新鮮なメディアを追加します。回転楕円体を成長すると、5-10 日間。</li>
	<li>収穫 (ステップ 7)、免疫染色 (手順 8)、および/または下流用イメージングを続行します。</li>
</ol>7. 収穫球
<ol><li>球を収穫、基底膜 ECM ゲル プラグイン乱すことがなくメディアを慎重に吸引し、基底膜 ECM の 100 μ L あたり PrEGM で 1 mg/mL 当期の溶液の 1 mL を追加します。 注: 場合彼らは井戸や (代わりにカバー全体も)、縁の真ん中にメッキ、回転楕円体を収穫する簡単だ井戸に当期ソリューションの適切な量を追加できることを確認します。</li>
	<li>Dispase PrEGM ソリューションに基底膜 ECM ゲルから持ち上げて細胞スクレーパーとプレートの底をこすり。</li>
	<li>1000 μ L ピペット チップまたはより小さい部分にゲル プラグを破る 5 mL ピペット ピペットが広く一度上下全体のソリューションを退屈させます。 注: は、大口径のヒントにかみそりの刃で 1000 μ L ピペット チップの先端をカットします。</li>
	<li>基底膜 ECM が完全に溶けるまでに 1-2 時間 5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。 注: これはゲルのチャンクがありませんが残ることを確認するためプレートをひねりながらウェル底面の目視検査で確保することができます。</li>
	<li>15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を収集します。</li>
	<li>室温で 5 分間 250 x g で球を遠心し、ダウン ストリーム アプリケーションを続行します。</li>
</ol>8. 球13の免疫染色
注: 回転楕円体は、時間の必要な量の成長している後、基底膜 ECM を溶解することができます、Colicinoらで説明するように球を汚すことができます。13。
<ol><li>簡単に言えば、PBS で文化を洗浄し、基底膜 ECM ゲル プラグに直接 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加します。基底膜 ECM が完全に解散した、新鮮な PFA 30 分毎の交換までゆっくり揺れ、室温で 30-90 分間インキュベートします。 注: PFA がゲル プラグを溶解し、この過程で、回転楕円体を修正します。</li>
	<li>次に、PBS 3 回洗浄し、PFA から任意の蛍光をクエンチする 10 分の 50 mM 塩化アンモニウムを追加します。PBS の 3 洗浄を繰り返します。</li>
	<li>0.1% 非イオン性洗剤 5 分・ PBSAT とブロックを permeabilize (PBS、1% BSA 0.5% トリトン X-100) 30 分間。</li>
	<li>一晩で 4 ° C、PBSAT と PBSAT で部屋の温度で 2 時間の二次抗体 3 洗浄が続く PBSAT の一次抗体とインキュベートします。</li>
	<li>必要な場合は、製造元のプロトコルに従って PBSAT で洗浄と DAPI 染色を繰り返します。3 つ以上 PBS で洗浄します。</li>
	<li>200 mM 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] オクタン (鎖置換 DABCO) antifade 試薬と PBS を追加し、画像に進みます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

本稿は、マウス前立腺の解剖および個々 の葉の識別方法を紹介します。また説明マウスの in vitro解析のための 3次元培養における前立腺細胞を培養するためのプロトコルです。
解剖のプロトコルの重要なステップは、(1) マウスから全体の UGS を収穫と解剖顕微鏡の下で個々 の器官の分離です。前立腺の組織は非常に小さく、UGS; の残りの部分に囲まれてしたがって、そのまま葉のすべての 4 つのペアを調達しながら体内から直接臓器を収穫する実質的に不可能です。したがって、マウスから全体の UGS を収穫し、前立腺の抽出を続行することが重要です。また (2) このプロトコルに重要です適切なタイミングでの手順に従いますが、細心のまま。時間は解剖時に組織の劣化を最小限に抑えるための本質です。ここに記載したマウスから、UGS を抽出、特定の技術の選択肢に比べて高速と強くお勧め。全体の解離と葉の隔離プロシージャ通常分 35-40、もっと練習 25 分を下げることができます。解剖の最も困難な部分は、総解剖の時間の大部分を占める UGS を囲む脂肪を掃除です。脂肪は、前立腺はそれの...

科学的なコミュニティを何十年も人間の癌の開発の複雑なメカニズムの解明を続けています。潜在的なキープレーヤーと創薬ターゲットの同定から始まる患者細胞・組織研究、前臨床動物モデルの使用多くの場合このような結果の並進アプリケーション必要があります。モデル (GEMMs) モデルの人間のがんにはマウス モデルの人間癌コンソーシアム (NCI MMHCC)、について説明し、マウスの癌の特性を統一しようとする委員会の設立以来着実に上昇している遺伝子改変マウスの使用科学者世界中1,の2モデル。マウス モデルは、ほとんどの種類のがんは、開発の進行、治療への応答を理解するための前臨床研究で解明の必要性を満たすし、抵抗3を取得します。
前立腺がんは男性、毎年4160,000 以上の男性に影響を与える最も一般的に発生するがんです。病気の積極的な形態は、毎年の生活の数万人を主張します。しかし、病気の進行のメカニズムはまだよくわかっていません。進行性前立腺癌患者4で高死亡率からも明らかな転移・再発前立腺癌の効果的な治療オプションの深刻な不足でこの結果します。したがって、前立腺がんを研究する前臨床モデルの成長している必要性があります。しかし、おかげでマウスとひと前立腺の本質的な違い、GEMMs では前立腺癌のモデル化の利得していない人気バーハーバー分類導入 2004 年マウスの病理組織学的変化を説明するまで遺伝子操作、腫瘍性病変の同定と人間5癌の進行の段階の関係の時に前立腺。前立腺ジェム モデルを勉強しながら考慮する必要がありますマウス前立腺の重要な特性の 1 つの葉の 4 つの異なるペアの存在である: 前部、外側、腹側と背側。葉は、病理と遺伝子の発現パターン6に有意差を提示します。Probasin 蛋白質の表現パターンは、ポスト思春期の若いマウスで7Pb Cre47と呼ばれる probasin ベースのプロモーターを使用のジェムの Cre ベース モデルは大抵設計されているのでを考慮する必要があります葉によって異なります。Cre 発現頻度の空間的および時間的な違いは、葉の間の腫瘍性病変の違いと同様、腫瘍の発生と進行のタイムラインの違いに します。したがって、GEMMs、前立腺の腫瘍の開発を勉強しながら、このような違いを考慮することが重要だし、個々 の葉は、再現可能な結果を達成するために個別に評価する必要があります。この記事の最初の部分では、マウス前立腺の解剖、識別、別の各葉と葉の組織の違いを認識する適切な方法について説明します。
腫瘍増殖と病理組織学的解析では、腫瘍の開発に貴重な洞察力を提供できますが、彼らは分子メカニズムについて多くの情報を与えない。腫瘍の開発そして進行のメカニズムを研究するには、では、腫瘍細胞の生体外の分析に便利です。長年にわたり培養、3 D 文化8を含むこれらの細胞培養に関連するいくつかの方法が提案されている. 最近では、通常の 2D 文化9これらのメソッドのほとんどは、良い細胞の生存・増殖率になります、一方、3 D の文化は生理的条件に最も近い環境を提供します。3 D または回転楕円体の文化が基底膜の細胞外マトリックス (ECM) で栽培、完全に分化した luminal セル通常ある非常に低い生存率;ただし、根元と中間細胞 (主幹細胞) が伝播し、10回転楕円体と呼ばれる細胞のクラスターを生成することができます。これにより、がん研究に適した上皮癌幹細胞 (一般、がん幹細胞として知られている)11に由来すると考えられているので。このプロトコルの 2 番目の部分では、3 D 培養マウス前立腺の細胞を培養するための方法について説明します。Organoid 形態とイメージング、異なった蛋白質のための汚損蛍光抗体法による行動の研究と化学療法への応答の研究を含む下流の分析のいくつかの種類の結果球が使えるトリートメント。
全体的に、このプロトコルの目標はマウス前立腺の解剖および解剖技術と回転楕円体の文化との in vitro解析のための組織の処理を記述することによって前立腺癌のマウスモデルを使用して最適な方法を概説するには.

<table><tbody><tr><td>マウス手術器具(マウス解剖キット)</td><td>ワールド精密機器</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>解剖培地(DMEM + 10%FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11965-084</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>10438018</tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティ</td>フィック<td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17018029</td><td>RPMIで10倍ストック(10mg / ml)を作り、ろ過滅菌し、分注し、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>サイエン</td>ティフィック 25300054 <td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001&nbsp;ロシュ</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ&ニードル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック<tr><td>・フィッシャーブラン&nbsp;滅菌セルストレーナー、40&mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>PrEGM BulletKit&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>CC-3166</td>すべての<td>コンポーネントを追加し、アリコートし、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>マトリゲル膜マトリックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II パウダー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>17105041</td><td>PrEGM に 10 倍のストック (10mg/ml) を入れ、フィルター滅菌、分注、-20 °C で保存します。ハ</td></tr></tbody></table>

培養 3 d 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、前立腺癌 (PCa) を含む、人間のがんのほとんどの種類を調査するため効果的な前臨床モデルとして機能します。マウス前立腺の解剖学を理解することは、効率的な利用と適切な特性そのような動物のモデルにとって重要です。マウス前立腺にはそれぞれ独自の特性を持つ葉の 4 つの別個のペア。この記事は、適切な郭清法および疾患解析にマウス前立腺の丸い突出部の同定を示します。後郭清術、前立腺細胞さらに培養できる体外機構の理解のためです。マウスから前立腺細胞は、彼らの通常の特性を失う傾向があるとき培養体外、我々 概要ここでセルを隔離し、生理学を維持するため有効である 3 D 回転楕円体文化としてそれらの成長法セルの特性。これらの 3 D の文化は細胞の形態と調査、近く生理の状態で動作が変更レベルとの主要なタンパク質と開発に関与する経路のローカライズと、病気の進行を分析し見て使用できます。薬物治療への応答。

マウス前立腺の丸い突出部は識別でき、精嚢、尿道に関して彼らの場所を使用して解剖しました。マウス前立腺 4 対葉背側に位置するのと腹精嚢、尿道で構成されます。図 4 aおよび4 b (上) そのまま前立腺、精嚢、尿道の背側と腹側のビューを表示します。最下部のパネル (図 4 cおよび4 d) は、身分証明書に記載されている異なる葉を表示します。葉は、3 ヶ月ほど若いマウスから分離できます。
別の前立腺の丸い突出部は組織学 (図 5) で大幅に異なります。すべてマウス前立腺葉に囲まれて分泌上皮細胞内腔から成る複数の腺プロファイルで構成されます。しかし、葉の形、細胞、組織、分泌物の性質変わる葉から葉へ。H &amp...

遺伝子改変マウスは、前立腺癌のメカニズムを調査するための有用なモデルです。識別とマウス泌尿生殖器から前立腺の丸い突出部を解剖、組織学に基づく区別と分離および下流解析の回転楕円体として体外主な前立腺細胞文化プロトコルをご紹介します。

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

この方法は、前立腺癌の遺伝子操作マウスモデルの開始と、生体内およびインビトロ分析を通じた前立腺癌メカニズムの研究に役立つ。この技術の主な利点は、組織解剖から細胞分離および培養まで、前立腺癌マウスモデルの完全な分析を可能にすることです。泌尿生殖器系(UGS)を暴露した後、尿膀胱を中型の鈍い鉗子でしっかりとつかみ、マウス腹部からシステム全体を持ち上げる。膀胱と前立腺の下にハサミを滑り込まして脊髄を切開し、残りの接続を切り裂いてUGS全体を取り除きます。2~6ミリリットルのPBSを含む6センチメートルのペトリ皿に、解剖顕微鏡でUGSを移します。そして、細かい鉗子とマイクロ解剖はさみを使用して、前立腺組織を切り取ることなく、組織システムの側側と側腹側の両方から脂肪のすべてを慎重にクリアします。すべての脂肪が取り除かれたら、鉗子で膀胱を引っ張り、膀胱をそのベースで切除する。残りの組織腹側を上に置き、鉗子で1つのダクトの端を保持し、はさみでそのベースに容器に従い、そのベースで容器を切除します。反対側の同じ容器を取り外し、必要に応じて隣接する結合組織の切り取りができるように、精嚢と前立腺の間に鉗子を挿入します。その後、尿道の基部に精嚢をトレースし、それらを穿刺することなく、血管を除去します。両方の小胞が取り除かれたら、蝶の羽に似た後部葉が見えるように組織の裏側を上に置きます。各背部葉を鉗子で保持し、そのベースの組織をはさみで切断して背側葉を採取し、組織を腹側に回す。小さく、通常は側に尿道を包み、同じように前葉、腹側葉、および側葉の間にくさび状にする横葉を収集します。側葉より大きく、尿道腹腔に横たわる腹側葉を集める。次に、尿道を切って捨てて前葉を収穫する。3D培養のために前立腺組織を処理するには、ローブを2〜3ミリリットルのDMEMを含む10センチメートル皿に移し、メスを使用して前立腺管管をできるだけ細かく均等にミンチします。組織断片を滅菌組織培養フードに移し、組織溶液を新しい15ミリリットルチューブに加える。新鮮な培地でチューブ内の体積を最大9ミリリットルにし、TenXコラゲナーゼストック溶液を1ミリリットル加えます。ボルテックス後、37°Cで2時間揺れでチューブをインキュベートし、細胞外マトリックスを劣化させます。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって組織を収集し、EDTAの暖かい05%ストリップの2ミリリットルにペレットを再中断します。セル対細胞および細胞間接着の切断を容易にするために摂氏37度の5分後、広いボードチップを持つP1000パイプヘッドを使用して、組織を8〜10回三分して塊を分割します。P200 パイプヘッドチップで解離を繰り返します。その後、完全な培地の3ミリリットルでトリプシンを中和します。500単位のDNASE1を組織スラリーに混ぜ、18ゲージの針を装備した5ミリリットルの注射器を通して溶液を5〜10回、続いて20ゲージの針を通して5回渡します。これ以上大きな組織片が見えない場合は、40マイクロメートルのフィルターを通して50ミリリットルの円錐管に懸濁液をろ過し、遠心分離によって細胞を収集する。細胞めっきおよび培養の場合、ペレットを完全な前立腺上皮細胞増殖培地の0.5ミリリットルで再懸濁し、前立腺上皮細胞増殖培地濃度の1ミリリットル当たり5倍10〜5番目の細胞に細胞をアリュードした。細胞を細胞外基質と混合し、溶液比を2~3体積で、適切な実験細胞培養容器に細胞懸濁液をプレートします。その後、細胞を細胞培養器に30分間入れます。細胞外マトリックスが固まった場合、前立腺上皮細胞増殖培地を温め込んだ完全な前立腺上皮細胞で培養液を覆い、基質膜細胞外マトリックスプラグを乱さない様に注意する。その後、細胞を5〜10日間培養器に戻し、2〜3日ごとに培地の半分をリフレッシュする。球体を収穫するために、基底膜細胞外マトリックスゲルプラグを乱さずに培地を慎重に吸引し、基底膜外細胞マトリックスの100マイクロリットルに対して1ミリリットルのディスベース溶液を添加する。セルスクレーパーを使用して、プレートの底に沿って掻き取り、プレートの底から上澄み板に細胞外ゲルを持ち上げ、溶液全体を1回パイプアップしてプラグを小さくします。細胞培養インキュベーター内の細胞外マトリックス片を細胞外基質マトリックスが完全に溶解するまで1~2時間インキュベートする。その後、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。さらに下流操作のために遠心分離により細胞を収集する。マウス前立腺は、陰部および腹腔内に位置する4組のローブから、精嚢および尿道に位置する。前立腺葉は、複数の腺プロファイルで構成され、それぞれが分泌上皮細胞に囲まれた内腔で構成される。葉の形、細胞の組織、分泌の性質はローブによって異なります。単離された前立腺細胞は、基原膜細胞外マトリックス培養の4日後にオルガノイドに成長し始める。次の1〜6日間で、細胞のほとんどは部分的または完全な内腔を示す球の一部を有する固体球体に成長する。スフェロイドはまた、F-アクチン染色と共局化する細胞間接合部における強力なベータカテニン染色を示す。この手順を試みる間、細かく微細解剖の手順に従うことは非常に重要です。例えば、前立腺葉がまだ尿道に付着している間に分離するので、尿道に関してどのローブがどのローブに基づいているかを知ります。解剖手順に従って、単離されたローブは、RMAシーケンシング、ウェスタンブロッティングまたは免疫染色などの下流分析に使用できます。主要な3D培養技術は、形態および行動の変化のためにスフェロイドで生命を監視し、同じ中の腫瘍学的変化を識別することができるので、前立腺癌メカニズムに関するさらなる洞察を得ることを可能にする。要約すると、この前立腺解剖および培養方法は、遺伝子組み換えマウスモデルを用いて前立腺癌のメカニズムを調査するための貴重な情報を提供するために、様々な下流アプリケーションに組み込むことができる。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

腫瘍由来のオルガノイドは、腫瘍の病理学的特徴と臓器特異的な細胞系統を維持できる3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコルの例では、科学者が遺伝子操作マウスモデルから前立腺腫瘍からオルガノイドを生成する様子を見ていきます。...

腫瘍からのオルガノイドの調製:3D In Vitro腫瘍モデル

このビデオでは、マトリックスゲルリングベースの培養技術を使用して、単離されたマウス前立腺上皮細胞の培養を実演します。このアプローチは、遺伝的または薬理学的操作に応答して前立腺上皮細胞が3D腺構造を形成する分化能力に関する補完的な情報を提供できます。...

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このビデオでは、雄マウスモデルから泌尿生殖器系またはUGSを解剖する手順を説明します。このUGSは、前立腺を分離し、前立腺癌の発症におけるその役割を研究するために、生体外でさらに解剖されます。...

マウス泌尿生殖器系からの前立腺の抽出:雄マウスの他の泌尿器系および生殖器系器官から前立腺を分離する技術

このビデオでは、マウスモデルの前立腺から個々の葉を採取するテクニックについて説明しています。その後、個々の葉を組織学的分析やがん研究に使用できます。...

前立腺からの個々のローブ抽出:マウスの前立腺から個々の前立腺ローブを採取する技術

この原稿は、実験用マウスにおける前立腺顕微解剖や去勢手術のためのプロトコルについて説明します。また、これらのプロトコルによって生成される代表的な結果を示しています。最後に、我々は長所と、これらのプロトコルの利用を議論します。...

マウス前立腺マイクロ解剖と外科的去勢

前立腺癌は、米国で癌関連の死亡原因として2番目に多いものです。同所性がんモデルは、前立腺がんの生物学を理解し、治療レジメンの有効性を評価するための有用なアプローチを提供します。このプロトコルでは、同所性前立腺がんマウスモデルを確立するために必要な詳細な手順について説明します。...

ヒト前立腺癌の前臨床同所性マウスモデル

このプロトコルの目的は、その後去勢と、前立腺癌細胞の前立腺内注入を示すことです。同所性同種アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の前臨床モデルは臨床的に関連する腫瘍微小環境と免疫ホストのコンテキストで疾病研究にとって重要です。...

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

ここでは、人間プライマリ前立腺における処理をガイドし、表現型を評価するためにエンドポイントを提案するプロトコルを提案する.播種、文化の維持、マトリックス ゲルからの回復形態の定量化、埋め込み断面、FFPE...

処理と人間プライマリ前立腺培養の評価

前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。...

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

マウス前立腺オルガノイドは、分化を調節するメカニズムを評価する有望な文脈を表す。本論文では、前立腺オルガノイドを確立するための改善されたアプローチについて述べ、(1)オルガノイドからタンパク質リサートを採取する方法、および(2)全マウント共焦点顕微鏡のためのオルガノイドを修正および染色する方法を紹介する。...

オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

このプロトコルは、2Dで培養されたマウス前立腺オルガノイドモデルの生成を記述しています。この検査には、オルガノイド解離、細胞シーディング、分化、上皮の完全性評価、そして尿路病原性大腸菌による体外感染が含まれます。このモデルは頂端のアクセス性を提供し、宿主と病原体の相互作用の研究に適しており、従来の3Dオルガノイドシステムの制約を克服します。...

宿主-病原体相互作用を研究するためのマウス前立腺オルガノイドモデルの生成

学ぶマウス前立腺葉の解剖・組織学的識別法と一次細胞の3Dスフェロイド培養技術。遺伝子改変マウスモデルを用いた前立腺がんのin vivo・in vitro解析に有用です。

培養 3 D 回転楕円体モデルでのマウス前立腺の葉の解剖組織学的特性及び

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