Name: 生体内における脳タンパク質合成の局所速度の決定のための定量的自動放射線法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶ脳タンパク質合成の定量的自動放射線法。L-[1-14C]-leucineを用いて覚醒行動中の動物で局所速度を測定し、神経可塑性と発達過程における脳の適応応答を解析する正確な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、マウスのジェノタイピングについてZengyan Xia、アミノ酸とフィルムの処理のためのトム・バーリン、rCPS実験の一部を行うためのメイ・チンを認めたい。本研究は、NIMH(ZIA MH00889)の内部研究プログラムの支援を受けました。RMSはまた、自閉症スピークポストドクターフェローシップ8679とFRAXAポストドクターフェローシップによってサポートされました。

<ol><li>West, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+neuronal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of neuronal gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).</li>
<li>Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiegel%2C+G+%22Basic+Neurochemistry%22">Basic Neurochemistry</a>. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).</li>
<li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265, 1104-1107 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity-dependent+cell+survival+mediated+by+transcription+factor+MEF2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2.</a> Science. 286, 785-790 (1999).</li>
<li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+local+protein+synthesis+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).</li>
<li>Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+vivo%3A+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).</li>
<li>Schmidt, K. C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution%2C+sensitivity+and+precision+with+autoradiography+and+small+animal+positron+emission+tomography%3A+implications+for+functional+brain+imaging+in+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research.</a> Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).</li>
<li>Banker, G., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+different+amino+acids+as+protein+precursors+in+mouse+brain%3A+advantages+of+certain+carboxyl-labeled+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).</li>
<li>Frerichs, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+protein+synthesis+in+brain+during+hibernation+involves+inhibition+of+protein+initiation+and+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).</li>
<li>Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+fetal+and+neonatal+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep.</a> The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).</li>
<li>Nakanishi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+correlations+between+cerebral+protein+synthesis+rates+and+deep+sleep+in+Macaca+mulatta%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta.</a> The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).</li>
<li>Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+adjusted+for+regional+differences+in+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool+in+conscious+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats.</a> Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).</li>
<li>Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+a+circadian+rhythm+of+protein+synthesis+in+the+rat+suprachiasmatic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei.</a> Brain Research. 494, 155-158 (1989).</li>
<li>Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+thiopental+anesthesia+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).</li>
<li>Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+axotomy+on+protein+synthesis+in+the+rat+hypoglossal+nucleus%3A+examination+of+the+influence+of+local+recycling+of+leucine+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).</li>
<li>Smith, C. B., Yu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+protein+synthesis+in+the+regenerating+hypoglossal+nucleus%3A+effects+of+testosterone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment.</a> Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).</li>
<li>Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+delayed+effects+of+prior+chronic+cocaine+administration+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).</li>
<li>Nadel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+exercise+regionally+augments+rates+of+cerebral+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis.</a> Brain Research. 1537, 125-131 (2013).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+local+cerebral+protein+synthesis+in+the+rat+during+normal+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development.</a> The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).</li>
<li>Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+on+regional+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+the+Sprague-Dawley+rat%3A+examination+of+the+influence+of+recycling+of+amino+acids+derived+from+protein+degradation+into+the+precursor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool.</a> Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).</li>
<li>Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aging+on+local+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Neural+Sciences%22%5BJournal%5D)">The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats.</a> Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).</li>
<li>Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+measured+in+vivo+in+a+mouse+model+of+Tuberous+Sclerosis+Complex%3A+unexpected+consequences+of+reduced+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin.</a> Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).</li>
<li>Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+reverses+increased+rates+of+cerebral+protein+synthesis+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).</li>
<li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cerebral+protein+synthesis+in+fragile+X+syndrome%3A+studies+in+human+subjects+and+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).</li>
<li>Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postadolescent+changes+in+regional+cerebral+protein+synthesis%3A+an+in+vivo+study+in+the+FMR1+null+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse.</a> The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).</li>
<li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-Baclofen+Reverses+a+Social+Behavior+Deficit+and+Elevated+Protein+Synthesis+in+a+Mouse+Model+of+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome.</a> The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034(2015).</li>
<li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+protein+synthesis+in+a+knockin+mouse+model+of+the+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation.</a> ASN Neuro. 6, (2014).</li>
<li>Smith, C. B., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+protein+synthesis+in+a+genetic+mouse+model+of+phenylketonuria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).</li>
<li>Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+regional+cerebral+blood+flow+with+antipyrine-14C+in+awake+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats.</a> Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).</li>
</ol>

著者は、開示する利益相反を持っていません。

実験動物における生体内における脳タンパク質合成(rCPS)の局所的率の測定方法を提示する.この方法は、既存の方法に対してかなりの利点があります:1.測定は、目覚めの振る舞い動物で行われるので、それらは機能する脳の進行中のプロセスを反映します。2.測定は、同時に脳のすべての領域とサブ領域でrCPSを決定する能力を与える定量的な自動無線撮影によって行われます。3. この方法の運動モデルは、組織タンパク質分解に由来する標識されていないアミノ酸のリサイクルの可能性と、タンパク質合成用前駆体プールへの影響を考慮に入れる6.
この方法の主な制限は、時間と要求が高いことです。より単純で高いスループット方法を採用することは魅力的ですが、取得したデータの制限を認識する必要があります。
無傷のマウスでrCPSを測定する複雑さのために、正常な生理的状態の維持、十分な血液サンプルの収集、および干渉条件の回避に問題が発生する可能性があります。静脈および動脈カテーテルの外科的注入は挑戦的である。他の外科的処...

タンパク質合成は、神経系1における長期適応変化に必要な重要な生物学的プロセスである。タンパク質合成を阻害することは、無脊椎動物と脊椎動物の両方における長期記憶貯蔵をブロックする2.タンパク質合成は、長期増強(LTP)および長期うつ病(LTD)3、開発時のニューロン生存、およびニューロンおよびその一般的な維持のために、いくつかの形態の後期段階の維持に不可欠である。シナプス接続5.脳タンパク質合成率の測定は、適応的変化だけでなく、神経発達障害や学習と記憶に関連する障害を研究するための重要なツールである可能性があります。
我々は、脳組織6のex vivoまたはインビトロ製剤の速度を推定する他の技術よりも固有の利点を提供する覚醒動物における生体内の脳タンパク質合成の速度を定量する方法を開発した。何よりも、目を覚ました動物の無傷の脳での測定への適用性です。これは、シナプス構造と機能を備えた測定を可能にし、死後の影響を気にすることなく、重要な考慮事項です。さらに、我々が採用する定量的な自動放射線アプローチは、高度な空間ローカリゼーションを達成する。14Cのエネルギーは、細胞レベルまたは細胞レベルでトレーサーを局在化できないほどですが、視床下部核などの細胞層や小脳領域の速度を測定することができ、約25μmの分解能7を持つ。
放射線トレーサーによる生体内測定の1つの課題は、測定された放射性標識が未反応標識前駆体または他の無関係標識代謝産物6ではなく、関心のある反応の産物であることを確実にすることである。トレーサーアミノ酸としてL-[1-14 C]-ロイシンを選んだのは、タンパク質に組み込まれるか、14CO2に急速に代謝され、高い割合から生じる脳内の標識されていないCO2の大きなプールで希釈されるからである。 エネルギー代謝8.さらに、タンパク質に組み込まれなかった任意の14Cは、主に自由[14C]-ロイシンとして存在し、60分の実験期間にわたって、組織6からほぼ完全にクリアされる。タンパク質は、ホルマリンで組織に固定され、その後、自己放射器の前に任意の自由[14C]-ロイシンを除去するために水ですすいでください。
もう一つの重要な考慮事項は、組織プロテオリシスに由来する標識のないアミノ酸による前駆体アミノ酸プールの特定活性の希釈の問題である。成体ラットおよびマウスにおいて、脳内のタンパク質合成のための前駆体ロイシンプールの約40%がタンパク質分解6に由来するアミノ酸に由来することを示した。これは、脳タンパク質合成(rCPS)の局所率の計算に含まれなければならず、この関係が変化する可能性のある研究で確認されなければならない。理論上の基礎と方法の仮定は、他の場所で詳細に提示されている6.本稿では,この方法論の応用の手続き上の問題点に焦点を当てる.
この方法は、地上リス9、羊10、ケサスサル11、ラット12、13、14、15、16におけるrCPSの決定のために用いられた,17歳,18歳,19歳,20歳,21、結節性硬化症複合体22のマウスモデル、脆弱X症候群23、24、25、26、脆弱X変異マウス27、およびフェニルケトン尿症28のマウスモデル。本原稿では、生体内自動放射線L-[1-14 C]-ロイシン法を用いてrCPSを測定する手順を提示する。覚醒コントロールマウスの脳領域にrCPSを提示する.また、翻訳の阻害剤であるアニソマイシンの生体内投与では、脳内のタンパク質合成を廃止することを実証する。

<table><tbody><tr><td>マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>003024</td><td>Fmr1 knockout 繁殖ペア</td></tr><tr><td>アニソマイシン</td><td>トクリス バイオサイエンス</td><td>1290</td><td></td></tr><tr><td>マイクロヘマトクリットチューブ</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>1-000-3200-H</td><td>キャピラリーチューブ</td></tr><tr><td>Critoseal キャピラリーチューブ シーラント</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>39215003</td><td>シーラントパテ</td></tr><tr><td>ガラスバイアル血液</td><td>サンプルの収集に使用される</td><td>Agilent5183-2089</td>を挿入<td></td></tr><tr><td>します Digi-Med Blood Pressure Analyzer</td><td>Micro-Med Inc.</td><td>BPA-400</td><td>血圧計</td></tr><tr><td>Bayer Breeze 2 血糖モニタリング システム</td><td>Bayer Breeze</td><td>9570A</td><td>グルコース メーター</td></tr><tr><td>ガスタイト シリンジ</td><td>ハミルトン Co.</td><td>1710</td><td>ツベルクリンガラスシリンジ</td></tr><tr><td>HeatMaxHotHands-2ハンドウォー</td><td>マーHeatMax</td><td>モデルHH2</td><td>加温パッドヘ</td></tr><tr><td>パリンロックフラッシュソリューション</td><td>フレゼニウスカビUSA、LLC</td><td>504505</td><td>ヘパリン生理食塩水</td></tr><tr><td>透明な動物容器</td><td>Instech</td><td>MTANK / W</td><td>動物囲い</td></tr><tr><td>スプリングテ</td><td>ザーInstechPS62</td><td></td><td>カテーテルチューブ/げっ歯類アタッチメント</td></tr><tr><td>スイベル</td><td>Instech</td><td>375/25</td><td>スプリングテザーへのフック</td></tr><tr><td>スイベルアームとマウント</td><td>Instech</td><td>SMCLA</td><td>フックをスイベルと動物の囲いに</td></tr>取り付けます <tr><td>テザーボタン</td><td>Instech</td><td>VAB62BS/22</td>は<td>スプリングテザーの底に取り付けます</td></tr><tr><td>ステンレス製チューブ</td><td>自社製</td><td>N/A</td><td>マウスを介してカテーテルを蛇行させるために使用されます</td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000</td><td>Matrx</td><td>91305430</td><td>イソフルラン気化器</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Stoelting Co.</td><td>50207</td><td>イソフルラン/ハロタン吸着器</td></tr><tr><td>クリッパーズ</td><td>オスターフィニッシャー</td><td>モデル 59</td><td></td></tr><tr><td>サージカルスキンフック</td><td>自社製 (??)</td><td>N/A (??)</td><td></td></tr><tr><td>0.9%塩化ナトリウム生理食塩水</td><td>APPファーマシューティカルズLLC</td><td>918610</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>UNIFYシルク外科用縫合糸AD</td><td>Surgical</td> <td>#S-S618R13</td><td>6-0 USP,非吸収性</td></tr><tr><td>PE-8ポリエチレンチューブ</td><td>SAIインフュージョンテクノロジー</td><td>ズ PE-8-25</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー</td><td>309659</td><td>1cc/mL</td></tr><tr><td>PE-10 ポリエチレンチューブ</td><td>クレイ・アダムス</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>MCID Analysis</td><td>Imaging Research Inc.</td><td>バージョン7.0</td><td>光学密度分析</td></tr><tr><td>ゼラチンコーティングスライド(75x25mm)</td><td>FDニューロテクノロジー</td><td>ズPO101</td><td></td></tr>クライ<tr><td>オスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>スーパーRX-N医療用X線フィルム</td><td>富士</td><td>47410-19291</td><td></td></tr>ハイパー<tr><td>カセット(8x10インチ)</td><td>アマシャムファルマシアバイオテック</td><td>11649</td><td></td></tr><tr><td>[1-14C]ロイシン</td><td>モラベック</td><td>MC404E</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>Sarstedt Aktiengesellschaft&Co.</td><td>72.692.005</td><td>血液サンプルの除タンパクに使用</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>ウィートン</td><td>357335</td><td></td></tr><tr><td>グラスウール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td></td></tr><tr><td>窒素</td><td>NIH サプライセンター</td><td>6830009737285</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション液</td><td>CytoScint</td><td>882453</td><td></td></tr><tr><td>液体シンチレーションカウンター</td><td>パッカード トライカーブ</td><td>2250CA</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸分析装置</td><td>ピッカリングラボラトリーズ</td><td>ピナクルPCX</td><td></td></tr><tr><td>HPLCユニット</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズ 1260 インフィニティ</td><td>1260 バイオイナートポンプ</td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>ワイルドヘールブルッグ</td><td>M650</td><td></td></tr><tr><td>スルホサリチル酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>MKBS1634V</td><td>5-スルホサリチル酸二水和物</td></tr><tr><td>ノルロイシン</td><td>シグマ</td><td>N8513</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>[H3]leucine</td><td>Moraevk</td><td>MC672</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td>50 mL 円錐形遠心分離管</td></tr><tr><td>ストップウォッチ</td><td>ホイヤー マイクロスプリット</td><td>モデル 1000</td><td>1/100 分</td></tr><tr><td>安楽死ソリューション</td><td>Vet One</td><td>H6438</td><td></td></tr><tr><td>ノーザンライト精密イルミネーター</td><td>イメージングリサーチ株式会社</td><td>Model B95</td><td>蛍光灯</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>1442</td><td>CDD カメラ</td></tr></tbody></table>

生体内における脳タンパク質合成の局所速度の決定のための定量的自動放射線法

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

タンパク質合成は、神経機能の発達と維持に必要であり、神経系の適応変化に関与しています。また、神経系におけるタンパク質合成の調節不全は、いくつかの発達障害においてコア表現型でありうって考えられている。動物モデルにおける脳タンパク質合成率の正確な測定は、これらの障害を理解するために重要である。我々が開発した方法は、目覚め、動物の振る舞いの研究に適用するように設計されました。これは定量的な自動放射線法なので、同時に脳のすべての領域で速度を得ることができます。この方法は、トレーサーアミノ酸、L-[1-14 C]-ロイシン、および脳内のL-ロイシンの挙動の運動モデルの使用に基づいている。無関係な標識代謝産物に結びつないため、トレーサーとしてL[1-14 C]-ロイシンを選びました。これは、タンパク質に組み込まれるか、または急速に代謝され、脳内の標識されていないCO2の大きなプールで希釈される14CO 2を得る。この方法およびモデルはまた、タンパク質合成のための組織前駆体プールへの組織タンパク質照症に由来する標識されていないロイシンの寄与を可能にする。この方法は、細胞および神経層におけるタンパク質合成速度、ならびに視床下部および頭蓋神経核を決定する空間分解能を有する。信頼性が高く再現可能な定量データを取得するには、手続き上の詳細に従うことが重要です。ここでは、生体内におけるタンパク質合成の局所速度を決定するための定量的自動放射線L-[1-14 C]-ロイシン法の詳細な手順を示す。

ここでは、タンパク質合成阻害剤のrCPSに対する以前の投与の効果を実証する代表的な実験を示す。正常生理中のアニソマイシンを、rCPS判定開始前に成人C57/BL6雄野生型マウス皮下(100mg/kg)30分に投与した。アニソマイシン治療の効果は、車両処理対照動物と比較して、rCPSがアニソマイシン処理マウスでほとんど検出不可能であることを示している(図4)。これらのデータは、インビボ自動放射線L-[1-14 C]-ロイシン法が脳内のタンパク質合成率を測定するという検証を表す。
脳の4つのレベルにおけるL-[1-14 C]-ロイシン自動ラジオグラムの図を提示し、方法の分解能を実証する(図5)。図示は、嗅球(図5A及びB)、<stron...

タンパク質合成は、細胞にとって重要な生物学的プロセスです。脳では、適応的な変化のために必要とされる。無傷の脳におけるタンパク質合成率の測定には、慎重な方法論的考慮が必要である。ここでは、生体内における脳タンパク質合成の局所速度を決定するためのL-[1-14 C]-ロイシン定量的自動放射線法を紹介する。

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...

脳タンパク質合成の地域の速度の測定は、開発中および神経可塑性の間に起こるような長期的な変化に対する脳の応答をトレースすることができます。.我々の方法は、測定が完全に定量的であるという利点を有し、彼らは目覚めの振る舞い動物で行われる。定量的な自動放射技術は全ての脳領域の測定を同時に可能にする。この手順を実証するのは、私の研究室のポストバカロレアフェローのアニタ・トロシアンと、動物外科医の天建黄です。テキストプロトコルで詳述されているように手術の準備をして、この手順を開始します。手術段階では、手術用はさみを使用して、左大腿部の上部内側から、大腿動脈と静脈を明らかにする中線に向かって1センチメートルの切開を行います。外科的皮膚フックが切開の両側に引き込む。皮膚フックを手術段階にテーピングして固定します。十分な水分を維持するために、露出した領域に無菌0.9%塩化ナトリウムを適用します。鉗子を使用して解剖を鈍らせ、大腿動脈と静脈の小さな部分の周りに結合組織を分離する。慎重に動脈と静脈を分離します。今、切開の最も外側の点で大腿静脈と動脈の両方の下に吸収可能な縫合糸の1本の鎖を糸に鉗子を使用する。両端が均等になるように縫合糸を途中で引っ張ります。鼠径部のより近位の点では、鉗子を使用して大腿静脈の下に第2縫合糸を通す。血流を制限するために使用される半結び目を穏やかに結びます。ストランドAとストランドBの間のポイントで、鉗子を使用して大腿静脈の下に第3縫合糸を通します。血流を制限するために使用される完全な結び目をそっと結びます。静脈を引き裂かないように注意してください。ストランドBを軽く引っ張って血流を制限する。血液制限を維持するために、静かにストランドBを引っ張るために止血を使用してください。今度は、PEチューブのノンカットエンドを32ゲージ針とヘパリン化した生理食音で満たされた1ミリメートルのシリンジに接続します。カテーテルを洗い流して気泡を取り除く。大腿静脈の制限された領域に小さな穴をマイクロハサミで切り、フラッシュされたPE 8チューブの斜めの端をストランドBに向かって慎重に挿入します。カテーテルを含む静脈の周りにストランドBを締めます。ストランド C を使用して、カテーテルの周りに追加の結び目を結びます。この結び目が大腿動脈を捕捉しないことを確認してください。同じ手順を使用してPE 10カテーテルを左大腿動脈に挿入する前に、血液でチューブを部分的に満たすために注射器バレルを静かに引き戻します。大腿静脈と動脈カテーテルの両方が確保されたら、ストランドAを両方のカテーテルの周りの結び目に結びます。余分な縫合糸をすべて切断し、皮膚フックを取り除いた後、凝固を防ぐためにヘパリン化された生理液で動脈カテーテルを洗い流す。両方のカテーテルの端部を焼灼してシールを作成します。マウスを起こしやすい位置に置き、露出した領域に生理食塩分を塗布する首の基部に小さな切開を行います。頸部切開部から大腿切開まで、中空の金属棒を下皮に挿入します。中空の棒を通して、首の切開からカテーテルを蛇行する。中空の棒を取り除いた後、縫合糸で大腿部切開を閉じ、続いて手術後の鎮痛を伴う。30センチメートルの柔軟な中空チューブを通してカテーテルを蛇行し、皮膚の下のスプリングテザーのボタンを縫合する前にスプリングテザーを作り、続いて手術後の鎮痛を行います。マウスを回転マウントと腕で透明な円筒形の容器に移動し、回復期間中にマウスを収容します。マウスを暖かく保つために容器の下に手ウォーマーを置きます。テキストプロトコルで詳細に説明したサンプルを採取して、実験の最初にマウスが正常な生理状態にあることを確認します。トレーサーを静脈内に投与するには、片方の腕に接続されたC14ラベル付きロイシントレーサーを保持する注射器を持つ注射器を持つYコネクタと、100〜200マイクロリットルの無菌生理食塩水を持つ注射器を使用して、もう一方の腕に接続された静脈ラインを洗い流す。Y コネクタを静脈ラインに接続します。同時にストップウォッチを開始し、トレーサーを注入し、時給動脈血液サンプルを収集することによって研究を開始します。注射直後に静脈ラインを生理液で洗い流します。実験の最初の2分間を通して、血液サンプルを1~7個連続で収集します。7つのサンプルを採取した後、残りの各サンプルの前に30マイクロリットルのデッドスペース血液を採取する。サンプル8~14は、それぞれ3分、5分、10分、15分、30分、45分、60分で採取する。実験中のある時点で、テキストプロトコルに詳述されているように、三尖ロイシンとノロイシンを含む内部標準の3つのチューブを処理する。血漿ロイシン濃度を定量化するには、ナトリウムカチオン交換カラムを備えたHPLCシステムと、オルソフタルアルデヒドおよび小麦粉検出によるポストカラム誘導体化を使用します。ロイシン曲線の下の面積は、サンプル中のロイシンの濃度に比例します。サンプル中のロイシン濃度を定量化するために、標準との比較を使用してください。次に、液体シンチレーションカウンターを使用して、血漿サンプル中のトリチウムおよびC14の1分間あたりの崩壊を定量化する。これらの濃度を用いて、動脈血漿中の循環とその比活性の時間経過から標識ロイシンC14のクリアランス曲線を構築する。グラフから、動脈血漿中のロイシン比活性を標識した統合C14を算出する。定量的オートラジオグラフィーを行うために、脳部20ミクロンの厚さを準備する。マイナス20°Cのクライオスタットによって脳を切り離す。ゼラチンコーティングスライド上のマウントセクションを解凍します。スライドの固定後、X線フィルムカセットにスライドを並べ、以前に較正されたC 14ラベルのメチルメタクリレート規格のセットを並べてください。暗い部屋と安全な光の下に、側面と標準の上にX線フィルム、エマルジョン側の一部を置きます。カセットを密封し、黒い交換袋に入れます。メーカーの指示に従ってフィルムを開発します。背景が不均一で、定量化に影響を与える可能性があるため、フィルムの自動開発はお勧めできません。フィルム上の較正された標準のセットの光学密度値に基づいて、光学密度対組織C14濃度の較正曲線を構築する。これらのデータを多項式に適合します。第二または第三次多項式は非常によく合います。特定の脳領域を分析するには、脳アトラスと比較して、関心領域またはROIを6〜8セクションに配置します。ROI 内のピクセルの光学的密度を、すべてのセクションに記録します。検量線に基づいて、各画素における組織C14濃度を算出する。最後に、時tおよびランバでの未標識および標識ロイシンの動脈血漿濃度の比率の積分中のROI中の平均組織C14濃度から脳タンパク合成の地域率を計算する。血漿から来る組織前駆体プール中のロイシンの割合。ここに示されているのは、タンパク質合成の阻害剤であるアニソマイシンで処理された動物と比較して、動物を処理した車両からの代表的な画像である。タンパク質合成の速度は、画像内の暗闇のレベルに比例します。アニソマイシンは、この方法の特異性を示す脳タンパク質合成の測定率を大幅に低下させる。ここでは、デジタル化されたオートラジオグラムは、海馬と視床下部のレベルで目を覚ますマウスから示されています。暗い領域は、脳タンパク質合成のより高い地域率を有する。ここに示されているのは、裏海馬のレベルで目を覚ます動作制御マウスからのデジタル化されたオートラジオグラムです。脳タンパク質合成の速度は、カラーバーに従って画像に色塗りされています。この手順を試みる間、動物が測定中に正常な生理学的状態であることを確認することが重要です。我々の方法論は、脆弱X症候群のような神経発達障害におけるタンパク質合成の調節不支配を既に実証している。また、アルツハイマー病のような変性変化や状態のための有用なマーカーである可能性があります。.タンパク質合成法は、切換切り替えにおける免疫細胞化学と組み合わせて使用して、タンパク質合成の変化と特定のタンパク質の局所的変化を相関させることができます。要約すると、定量的な自動ラジオグラフィックスL-1 C 14ロイシン法は、生体内でのタンパク質合成の地域的な速度を正確に決定するのに理想的である。それは、生体内条件に対する正確さと適用性の点でかなりの利点を提供します。

quantitative-autoradiographic-method-for-determination-regional-rates

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、骨髄由来の間質細胞によるアミノ酸の取り込みを推定するためのin...

アミノ酸の細胞内取り込みを定量するための放射性標識アミノ酸取り込みアッセイ

小動物陽電子放出断層撮影法は、脳の2つの主要なエネルギー基質であるグルコースとケトンの評価を可能にします。本方法では、11種類のC-アセト酢酸と18種類のF-フルオロデオキシグルコースを各動物に順次注入し、磁気共鳴画像から決定される特定の脳領域におけるそれらの取り込みを定量的に測定します。...

ラットにおける局所脳エネルギー基質取り込みの定量的測定のためのデュアルトレーサーPET‐MRIプロトコル

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

ここでは、アンジオテンシンIIのヨウ素-125標識類似体を用いた定量的、密度測定、in vitro受容体オートラジオグラフィーにより、ラット脳内のアンジオテンシンII型1受容体の局在を説明するためのプロトコルを提示します。...

アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

私たちは、げっ歯類モデルで[14C]-ヨードアンチピリン(IAP)の取り込みを測定し、中枢性脳卒中後疼痛(CPSP)に関与する神経基質の活性化を評価するためのプロトコルを提示します。...

[オートラジオグラフィー測定<sup&gt; 14</sup&gt; C]中央郵便ストローク痛みに続いてラット脳で-Iodoantipyrine

オートラジオグラフィー法は質的または量的薬理学による組織切片にイメージングに関する基礎的バインディングを研究する使用します。...

シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。...

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。...

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

高い脊髄液タンパク質レベルは、変化した血液脳関門または細胞内合成を横切る血漿タンパク質の拡散の結果であり得る。この記事では、両方のケースを判別するのに役立ち、インテコール内合成タンパク質の定量的測定を提供する最適化されたテストプロトコルを紹介します。...

マウスにおけるインテコール内合成タンパク質の定量測定

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。...

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

本プロトコールは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドβ負荷を定量するために、矢状マウス脳切片の全領域またはサブ領域の関心分析を実行する手順を記載および比較する。...

マウス脳切片におけるアミロイドβ負荷の完全領域対小領域定量化

学ぶ脳タンパク質合成の定量的自動放射線法。L-[1-14C]-leucineを用いて覚醒行動中の動物で局所速度を測定し、神経可塑性と発達過程における脳の適応応答を解析する正確な手法です。

生体内における脳タンパク質合成の局所速度の決定のための定量的自動放射線法

さらに動画を探す