Name: 蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ 蛍光抗体法と共焦点顕微鏡を用いてマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布を定量化する手法。この方法は蛍光強度比を用いることで変動性を低減し、脳領域や海馬層など多階層の解析に応用可能である。

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私たちは優れたテクニカル サポート サポート ヴァイスシュヴァルツを感謝します。著者は、エルメスの Pofantis と Andoniya Petkova によるサポートを認めます。著者は、LSM800 と技術援助、特に博士ニルス Halbsgut の使用のための欧州の神経科学研究所もありがとうございました。この仕事は大学医療センター ゲッティンゲンで賄われていた。JSV は、顕微鏡によるナノスケールの分子生理学の脳 (CNMPB) センターでサポートを認めています。

このプロトコルは、生きている動物実験を行いません。脳サンプルを入手するために動物の安楽死させる実験は、承認番号 T 10/30 の下でローカル動物保護当局 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin ゲッティンゲン) によって承認されました。
注: このプロトコルの 3 の成人男性 c57bl/6 マウスが使用されました。
1. サンプル準備
<ol><li>定着剤および 0.1 M のリン酸バッファー (PB;テーブル 1を参照) を準備します。</li>
	<li>ゲージらで説明されているように transcardial 潅流によって動物を修正します。28。 最初 0.9 と血を洗い流す %、食塩を、30 ml の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の灌流。</li>
	<li>ハサミで頭蓋骨を開き、慎重に組織を損傷しないように鈍端のスプーンを使用して脳を分離します。</li>
	<li>定着剤を 50 mL の反応管を記入し、4% で脳を後置 4 ° c 一晩 PFA。</li>
	<li>定着剤を取り外して 30 分間シェーカーで 0.1 M PB の 50 mL の脳を洗います。</li>
	<li>洗浄後、0.1 M PB 48 h またはそれに対する凍害保護作用のための 4 ° C でチューブに沈むまでに 30% ショ糖で 50 mL の反応管で脳をインキュベートします。</li>
	<li>鋭い刃を持つ cryoprotected 脳をトリム、cryomold に配置し、最適な切削温度 (OCT) 化合物を埋め込みます。泡を避けるため。脳の向きし、-80 ° C のフリーザーで cryomold をフリーズします。</li>
	<li>区分のための凍結するティッシュをマウントします。区分する前に少なくとも 15 分 cryomicrotome 温度に組織を平衡します。</li>
	<li>25 μ m の厚切りコロナに脳をセクションします。脳の組織に触れることがなくガラスのフックで慎重に 10 月をタップします。24 well プレートのウェルあたりの 3 つの隣接するスライスを収集し、染色まで 4 ° C で 0.1 M の鉛にそれらを保管します。 注: プロトコルは、2 週間ここで休止できます。長い保存期間は、組織の品質を妨げるでき、従って実験の結果に影響を与えます。</li>
</ol>2. 蛍光抗体法
<ol><li>ブロック バッファー、抗体バッファー、バッファー 1、および洗浄液 2 (表 1参照) を洗浄を含むソリューションを準備します。</li>
	<li>一度余分な 10 月を削除する PB とスライスをすすいでください。<ol>
<li>脳スライスの吸引せずプラスチック ピペットとソリューションを削除します。1000 μ L ピペットと新鮮な PB の 250 μ L を追加します。 注意: スライス乾燥しない、だから削除し、水分もを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスチック ピペットで PB を削除し、250 μ L 1000 μ L ピペットで井戸あたりのブロック バッファーを追加します。シェーカーに室温 (RT) で 3 時間孵化させなさい。</li>
	<li>培養時間の間に抗体の反応管内のバッファーに一次抗体を希釈します。ウェルあたり 250 μ L 抗体バッファーを使用し、抗体の適切な量を追加 (表 2参照) で 2 μ L ピペットを使用してソリューションに直接ピペッティングします。上下に数回軽くピペッティングして混合します。適切な混合を確実にその後まもなく渦。 注: 背景の蛍光性を決定するには、染色も対象となる一次抗体を追加せず。そのため、プロトコルに従って一次抗体に抗体溶液でスライスをインキュベートします。</li>
	<li>培養時間後プラスチック ピペットのブロック バッファーを削除し、250 μ L/ウェル一次抗体を含む抗体溶液を追加します。シェーカーで 4 ° C で一晩一次抗体とスライスを孵化させなさい。</li>
	<li>次の日、洗浄バッファー 1 3 ウォッシュ スライス シェーカーで RT で 10 分の x。<ol>
<li>プラスチック ピペットで培地を取り除き、洗浄液 1 ウェルあたりの 300 μ L を追加します。10 分を繰り返して 3 回 RT で孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗浄のステップの間に抗体の反応管内のバッファーに fluorophore 共役二次抗体を希釈します。ウェルあたり 250 μ L 抗体バッファーを使用し、抗体の適切な量を追加 (表 2参照) で 2 μ L ピペットを使用してソリューションに直接ピペッティングします。上下に数回軽くピペッティングして混合します。適切な混合を確実にその後まもなく渦。 注意: 抗体光に敏感なので、この時点からのすべてのステップを暗闇の中で実行する必要があります。</li>
	<li>洗浄ステップの取り外し洗浄バッファー プラスチック ピペットを 250 μ L/ウェル二次抗体を含む抗体溶液を追加後。暗闇の中で RT で 90 分の二次抗体とスライスを孵化させなさい。</li>
	<li>洗浄液 2 3 とスライスを洗って室温 10 分 x</li>
	<li>洗浄のステップ中 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 配分の濃度 0.1 M pb を希釈します。</li>
	<li>プラスチック ピペットの洗浄バッファー 2 を削除し、250 μ L/ウェル DAPI 溶液を追加します。シェーカーの RT で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>プラスチック ピペットの DAPI ソリューションを削除し、500 μ L 1000 μ L ピペットとウェルあたり 0.1 M PB を追加します。</li>
	<li>顕微鏡のスライドには、スライスをマウントします。<ol>
<li>株分け業顕微鏡スライドを配置します。細かいブラシでスライドに 0.1 M PB の別 3 が値下がりしましたを追加します。顕微鏡スライド ドロップあたり 1 つのスライスを配置します。</li>
		<li>細かいブラシを使用して、平らにし、顕微鏡のスライド上のスライスを方向づけます。</li>
		<li>すべてのスライスが正しく配置、ティッシュで余分な鉛を削除し、スライドを慎重に乾燥します。 注意: は、脳スライスを完全に乾燥を避けます。</li>
		<li>埋め込みスライドに媒体の 80 μ L を追加します。脳スライスのそれによって埋め込みスライドに coverslip へ慎重に置きます。</li>
		<li>発煙のフードに 1-2 時間で乾燥するスライドを残す (光の露出を避けるためにそれらをカバー)、4 ° C で顕微鏡スライドのボックスに保管 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. イメージング
<ol><li>埋め込みメディアを完全に硬化した後は、共焦点顕微鏡顕微鏡スライドを配置します。 注: デコンボリューション ソフトウェアと落射蛍光顕微鏡は、同様の画像品質を得られるはず。</li>
	<li>グレー値の最大分布を確保するためにいくつかのピクセルが露出するようにすべてのチャネルのレーザー強度を強めたり弱めたりレーザーの設定を調整します。</li>
	<li>別のチャネルの全脳スライスの仮想組織を取得します。<ol>
<li>イメージング ソフトウェアで (材料の表を参照)、タイルオプションを選択し、手動でタイル領域セットアップと脳スライスを描きます。</li>
		<li>タイル地域全体のサポート ポイントを配布し、確認タイル領域/位置.を押すことによってさまざまなサポート ポイントのフォーカスを調整
</li>
		<li>結果として得られる画像の解像度とファイル サイズによるとアクイジション ・ モードの設定を調整し、スキャンを開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スキャンが完了したら、仮想組織を処理するのに合成関数を使用します。画像エクスポート機能付き .tif としてファイルをエクスポートします。</li>
</ol>4. コンピューター ベースの分析
<ol><li>フィジー29にファイルをクリックして 1 つのイメージのすべての単一チャネルを読み込む |オープン。</li>
	<li>フリーハンド選択ツール、DAPI チャネルで 1 つの半球を描きます。編集をクリックすると、選択範囲のマスクを作成 |選択 |マスクを作成する。</li>
	<li>分析をクリックして単一のチャネル (発動機およびシナプトフィジン) の平均蛍光強度を決定 |メジャー。 注: 各チャンネルの平均蛍光強度値を決定する別のチャネルを選択するを確認します。</li>
	<li>単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。</li>
	<li>関心のある領域の単一チャネルの平均蛍光強度を確認するには、フリーハンド選択ツールでも領域の輪郭を描きます。マウスの脳アトラスを参照として使用します。</li>
	<li>すべての半球および興味のすべての領域に対して、手順 4.1 4.5. 注: 後で半球の関心の領域の値を比較するために、各半球の値を個別に確認 (5.2 を参照)。</li>
</ol>5 データ処理
<ol><li>蛍光バック グラウンドが高い場合 (ディスカッションを参照)、背景差分が必要になる場合があります。そのためプライマリ参照蛋白抗体なしで処理されるスライスの平均蛍光強度を決定する (ここで: シナプトフィジン) と脳領域と半球で得られたすべての値から値を減算します。</li>
	<li>すべての半球におよび興味のすべての領域の単一チャネルの平均蛍光強度が決定されているとき (表 3を参照)、シナプトフィジン (値 Mover の値で割ってシナプトフィジンに発動機の比率を計算します。表 3では黄色)。別に興味のすべての半球とすべてのこの操作を実行します。</li>
	<li>半球に関心のある分野の比率を決定する対応する半球 (表3 オレンジ) の比率の関心の 1 つの領域の取得比率に分割します。</li>
	<li>Mover 個体を決定するには、(表 3に赤) 1 からの偏差を決定することによってパーセンテージに 5.2 で得られた比を変換します。1.25 の比率は上記の平均 25% の相対的な発動機の豊かさを与えるだろうしたがってと 0.75 の比率が平均以下 25% の相対 Mover の豊かさをもたらすでしょう。</li>
</ol>

<ol><li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).</li>
<li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li>
<li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li>
<li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li>
<li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li>
<li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+p38%3A+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li>
<li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li>
<li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li>
<li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vesicular+GABA+transporter%2C+VGAT%2C+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic%2C+Presynaptic%2C+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li>
<li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+%3A+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li>
<li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li>
<li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+M+%22Understanding+the+molecular+diversity+of+GABAergic+synapses%22">Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses</a>. 5, 1-12 (2011).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li>
<li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li>
<li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network%3A+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li>
<li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tprg%2C+a+gene+predominantly+expressed+in+skin%2C+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li>
<li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation%3A+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li>
<li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Körber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li>
<li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+in+brain+sections%3A+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , ACADEMIC PRESS. (2001).</li>
<li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li>
<li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

メソッドは、既知の分布とマーカー蛋白質の豊かさに対する興味の蛋白質の分布の定量化を目指すを紹介しました。免疫蛍光染色染色強度の異なるスライスの間の高い可変性を示すことができます。ここで説明した定量化手法半球間なかに興味の蛋白質の比率を決定することによってこの問題を回避できます。したがって、スライス全体染色強度の違いキャンセルされ、定量的な説明を可能にします。
すべての蛍光抗体のプロトコルと同様質的または量的、いくつかの要因が成功に影響を与える、それにより分析を混同します。したがって、特別な注意はプロトコルの重要なステップに支払われる必要があります。まず、組織の適切な固定が必要です。この固定は、成功 transcardial 潅流によって通常達成できます。灌流の品質は、血を洗った後まもなく肝臓をチェックすることによって確認できます。正常な血流のため最初のインジケーターは肝臓と四肢の28のクリアです。灌流が遅すぎるかもしれないが、次回より高速に実行する必要があります血栓の存在を示したりできます。いくつかのタンパク質は、PFA で化学固定は...

ニューロン間の通信は、シナプスと呼ばれる特殊な接触部位で発生します。シナプスには、無数組み合わせによって、シナプス伝達の異なった蛋白質にはが含まれています。それらの蛋白質のいくつかは神経系全体の不均質分布を示しシナプス1には存在しません。そのような蛋白質のための 1 つの例は Munc13 は、シナプス小胞のプライミング プロセスに関与しています。2脳全体に分散不均一、Munc13 の異なるアイソ フォームがあるし、特定のアイソ フォームの存在の有無に影響を与える短期シナプスとシナプス小胞ダイナミクス3,4,5します。 したがって、極めて重要な脳の領域間で異なるシナプス蛋白質の存在を識別することができるためです。
シナプス蛋白質の - 今のところ - 定量化のための選択の方法は、質量分析法とウエスタンブロットというよりも、免疫組織化学6,7,8,9。量と (すなわち、ヴィルヘルムら特定の蛋白質の局在化の両方を評価するためにお互いを補完するためにいくつかのケースでいくつかのメソッドを使用します。10). ここで述べる手法によりローカリゼーションと単に蛍光染色を用いて、生化学的方法を使用を必要とせず興味の蛋白質の定量。ここでもう一つの利点は小さい領域上の定量化を行うことができ、したがって、それらよりも、具体的、他の方法で達成します。ただし、信頼性の高いリファレンス タンパク質が興味の蛋白質の分布を評価するために必要なことを考慮する必要があります。
免疫組織化学的蛍光染色異なる神経細胞コンパートメント内にあるだけでなく、脳の領域にわたって日常的にタンパク質の局在を識別することができます。別のコンパートメントを識別するために特定のマーカーが使用されます。通常、synapsin、シナプトフィジン11に対する抗体はファゴット抗体ラベル シナプス前ターミナル12のアクティブ ゾーン間シナプス小胞のラベルに使用できます。小胞性の GABA トランスポーター vgat (ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGluT) などの小胞輸送は、それぞれ興奮13と14抑制シナプス前ターミナルをラベルに使用されます。シナプス後側、シナプス ターミナルとシナプス後密度タンパク質 95 (PSD95)15,16,17または gephyrin18に対する抗体をマークするホーマー タンパク質に対する抗体を用いることができます。,19,興奮性、抑制性シナプス ターミナルにそれぞれラベル20を使用できます。関心と上述のものなどのマーカー蛋白質に対する抗体を使用して、このようなタンパク質の局在を決定できます。これまで多くの研究は、質的方法21でこれを行っています。ただし、特定のシナプス蛋白質の特異的分布を確実に判断するには、いずれかの必要がありますのみ決定その存在または不在だけでなく、その相対濃度。サイズの不均一性と密度シナプスのシナプス マーカーと興味の蛋白質の比率を確立することが重要になります。海馬の非錐体層、小脳分子層などのシナプスの豊富な地域がシナプス蛋白質、その蛋白の強い存在のためにないが、シナプスの密度が高いためだけの高密度が表示されますそれ以外の場合、それぞれのシナプスは (例えば、Wallrafen および Dresbach の1)。(例えば、TGN3822) 神経細胞体でタンパク質、海馬錐体細胞層や神経細胞の細胞体の高濃度のため海馬や小脳顆粒細胞層で強力なプレゼンスを通常表示する一方、それらの領域。したがって、構造、この非均一に分布はこの場合、シナプス、自体興味の蛋白質の分布の偽の推定につながることができます。さらに、免疫組織化学的染色のサンプル間で強度を染色に本質的な可変性があります。ここで説明されているプロトコルはこれを考慮し、免疫組織化学的方法から生じるその他の注意事項と同様に、そのようなバイアスを回避できます。
私たちの最近の研究は、我々 は 16 異なる脳領域1にわたって Mover (TPRGL23または SVAP3024とも呼ばれます) の差分式を記述するこのメソッドを使用しています。発動機は脊椎動物に固有のシナプス蛋白質シナプス小胞との関連で見つけることができますし、神経伝達物質のリリース25,26,27に影響を与えます。シナプス小胞の豊かさに発動機式シナプス小胞参照マーカーとしてシナプトフィジンの染色関連ている。特に中隔核, 腹側フトゲツツガムシと扁桃体に発動機の高レベルを見つけた。海馬はわかった海馬内計算と入力と出力層の低レベルに関連付けられているレイヤーのレベルが高い、Mover の不均質分布

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 反応チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 反応チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>マルチウェル 24 ウェル</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;087721H</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックピペット (使い捨て)</td><td>Sarstedt</td><td>861,176</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL ピペット</td><td>レイニン</td><td>&nbsp;</td><td></td>17014382</tr><tr><td>2 ml ピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Menzel顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM800</td><td>ツァイス</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>凍結ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>ロシュ</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>11666789001 PFA</td><td>シグマ</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>neoFroxx</td><td>1104KG001</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ テック</td><td>さくら&nbsp;</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>メルク</td><td>1,063,460,500</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギの血清</td><td>メルク ミリポア</td><td>S26-100ML</td><td></td></tr><tr><td>正常なロバの血清</td><td>メルク</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>メルク</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ アンチムーバー</td><td>シナプス システム</td><td>RRID:AB_10804285</td><td></td></tr><tr><td>モルモット抗シナプトフィジン</td><td>シナプス系</td><td>RRID:AB_1210382</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギAF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID:AB_2492288</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスAF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>RRID:モ</td>ヴィオール4-88 AB_2337438 <td></td></tr><tr><td></td><td>Calbiochem</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td>475904</tr><tr><td>ZEN2 blueソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopy software</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Analysis software</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

有無または特定のシナプス蛋白質のレベル、重度なシナプス伝達に影響を与えます。蛋白質の機能を解明、に加えてまたその分布を決定することが重要です。ここでは、蛍光抗体法、共焦点顕微鏡、シナプス蛋白質 (TPRGL または SVAP30 とも呼ばれます) の発動機の分布を決定するためのコンピュータ ベース解析を用いたプロトコルについて述べる.我々 はシナプス小胞の豊かさに対する定量的方法で発動機の分布の決定によりシナプス小胞タンパク質シナプトフィジンの発動機の分布を比較します。特に、このメソッドは、異なる研究内または異なる抗体または顕微鏡を用いたタンパク質の分布の比較を許可する実装潜在的可能性があります。本手法は、絶対蛍光レベルではなく、比率を生成することによって蛍光染色の固有の変動を回避できます。また、述べるメソッドにより、さまざまなレベルでのタンパク質の分布を分析する研究者: 海馬のまたは感覚の異なるレイヤーなどの一つの脳領域で異なるサブ領域に脳を全脳スライスから野。Mover は、シナプス小胞に関連付けられている脊椎動物に固有のタンパク質です。この方法では、頭脳区域、扁桃体、中隔核、腹側フトゲツツガムシとまた海馬の異なる層などの単一の脳領域内で高レベルの分散不均一の発動機を紹介します。

染色パターンの別のマーカーの代表は、図 1に見ることができます。パターンは、タンパク質の分布に応じて異なります。5 つの吻尾側レベルの例の列 (A)-(E)。最初の行に示すように、代表的な DAPI 染色: DAPI は細胞の DNA に付着し、従って核が染色します。点状のパターンでこの結果します。高細胞密度の領域は、低細胞密度の領域よりも明るい。不均一分散蛋白質の例は、2 番目の行で見ることができます。染色 Mover は、明るいホット スポット領域と調光器の分野で、脳全体の差分分布を明らかにします。3 番目の行でより均一分散参照マーカー シナプトフィジンの例を示します。2 つの蛋白質のオーバーレイ (4 行目)、差分の分布を示す Mover (赤) マーカー タンパク質シナプトフィジン (緑) と比較して。
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ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

ここでは、免疫蛍光、共焦点顕微鏡、およびコンピュータベースの分析を用いて、参照タンパク質に対するシナプスタンパク質の分布を決定するプロトコルについて説明する。我々の方法は、絶対蛍光レベルではなく比を用いて免疫蛍光染色の固有の変動性を回避する。さらに、この方法を使用すると、異なるレベルでのタンパク質分布の不均一性を分析することができます。脳全体のスライスから脳領域、海馬の異なる層などのサブ領域まで。この技術は、マウス以外の脳およびモデル系以外の異なる組織におけるタンパク質分布を決定するために適応することができる。原稿に記載されているように、以前に単離された固定されたマウス脳を洗浄することから始めます。その後、脳を30%スクロース0.1モルPBで15ミリリットル反応チューブに移します。クライオは、脳を48時間、または沈むまで摂氏4度でインキュベートします。その後、関心のある領域に応じてクライオ保護脳をトリミングするために鋭い刃を使用します。その後、クライオ型に脳を配置し、それを埋め込むために最適な切断温度化合物を追加し、泡を避け、切断のコロナ平面を持つように脳を適切に向けます。氷結型をマイナス80°Cの冷凍庫に入れ、固形物を凍らせるまで置きます。凍結した組織をクライオミクロトームに取り付け、セクションの少なくとも15分前に待ってミクロトーム温度に平衡化します。25マイクロメートルの厚いコロナスライスに脳を切断し始めます。脳組織に触れることなく、慎重に最初のスライスのOCTにガラスフックを使用してください。OCT はガラスフックにくっつきます。最初の井戸に脳のスライスを転送するためにガラスフックを使用してください。0.1モルPBで満たされた24ウェルプレートにウェルあたり3つの隣接スライスを収集します。スライスは最大2週間染色されるまで摂氏4度で保管します。免疫染色のためのスライスを準備するには、脳スライスに描画することなく、1つの井戸からPB溶液を除去するためにプラスチックピペットを使用しています。その後、1000マイクロリットルのピペットを使用して、250マイクロリットルの新鮮なPBを追加して、余分なOCTを洗浄します。スライスを乾燥させないように、その時に井戸ごとにこの洗浄を繰り返します。次に、プラスチック製のピペットを使用して、PB溶液を第1のウェルから除去します。1000マイクロリットルのピッドを使用して、よく働く井戸あたり250マイクロリットルのブロッキングバッファを再びうまく働かします。シェーカーの室温でプレートを3時間インキュベートします。インキュベーション中に、反応管に1ウェルあたり250マイクロリットルの抗体バッファーを加える。次に、2マイクロリットルのピペットを使用して、適切な量の抗体を溶液に直接ピペット化し、数回軽く上下にピペットして混合します。次に、この希釈抗体をボルテックスして適切な混合を確認できない。プラスチック製のピペットでブロッキングバッファーをうまく取り除き、井戸当たり250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えます。一晩で摂氏4度でシェーカーにプレートをインキュベートします。翌日、プラスチック製のピペットで抗体溶液を除去します。300マイクロリットルの洗浄バッファーを1ウェルあたり1回1回洗浄し、各1回10分間を室温でシェーカーで洗浄します。洗浄中、暗闇で働き、蛍光体を反応管内で2番目の抗体に対して、一次抗体と同じ方法で希釈する。洗浄が完了した後、プラスチックピペットで洗浄バッファーを除去し、ウェルあたり250マイクロリットルの二次抗体溶液を添加する。室温で暗闇の中で90分間インキュベートします。完成後、プラスチックピペットで抗体溶液を除去します。洗浄バッファー1と同じ方法で洗浄バッファー2でセクションを3回洗浄します。この洗浄の間に希釈DAPIは0.1モルPBで、1〜2000濃度を達成した。プレートから洗浄バッファーを取り出した後、250マイクロリットルのDAPI溶液を加え、シェーカー上の室温で5分間インキュベートする。プラスチックピペットでDAPI溶液を除去した後、1000マイクロリットルのピッドを使用して、1ウェルあたり0.1モルPBの500マイクロリットルを追加します。顕微鏡スライドをステレオスコープの下に置きます。細かいブラシを使用して、スライドに0.1モルPBの3つの別々の滴を追加します。ブラシを使用すると、スライド上のドロップごとに1つのスライスを配置し、スライスを平らにして方向を付けます。すべてのスライスが正しく配置された後、紙のティッシュを使用して余分なPBを除去し、スライスを完全に乾燥させることなく慎重に乾燥させます。その後、スライドに埋め込み培地の80マイクロリットルを追加し、慎重に脳のスライスを埋め込むためにカバースリップでそれをカバーします。スライドを覆って光の露出を避け、煙のフードで1〜2時間乾燥させ、共焦点顕微鏡の準備ができるまで4°Cの顕微鏡スライドボックスに保管します。原稿に記載されているように異なるチャネルのための全体の脳スライスの仮想組織を取得した後、ファイルをクリックしてフィジーにすべての単一のチャンネルまたは1つの画像をロードし、その後開きます。次に、自由な手の選択ツールを使用して、DAPI チャネル内の 1 つの半球を線分化します。編集をクリックしてから選択し、マスクを作成して、選択した領域のマスクを作成します。次に、分析をクリックし、粒子を測定して、単一チャネルの平均蛍光強度を決定します。各チャンネルの平均蛍光強度値を決定するために、単一のチャンネルを選択することを確認します。その後、単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。対象領域における単一チャネルの平均蛍光強度を決定するために、フリーハンド選択ツールで領域を線引する。核脳の切片を染色するDAPIで染色した後、細胞密度が低い領域よりも、穿刺パターンと高い細胞密度の領域が明るくなります。Mover抗体による染色は、シナプトフィシンがより均質な分布を明らかにした脳全体の明るいホットスポット領域と調光領域を有する不均一な分布を明らかにした。画像のオーバーレイは、シナプトフィシンを示す緑色蛍光と比較したMoverタンパク質を示す赤色蛍光の差分布を示した。定量分析後、半球および対象領域にわたる異なるチャネルの蛍光強度値が、MoverとSynaptophysinの両方について決定された。シナプトフィシン蛍光値に対する引越し物蛍光値の比率は、シナプス小胞に対する高い、低いMoverレベルの領域を有するMoverの不均一な分布を示す。相対的なMoverの豊富さ半球全体と比較して関心のある1つの領域の比率とパーセンテージに翻訳された割合は、平均に対する1つの関心領域にどれだけのMoverが存在するかを示した。相対的な移動量は、海馬のサブフィールド内の異なる層について決定された。対象となる3つの領域は、それぞれの層の比と対応する半球の比率を比較することによって定量化される。この手順は、簡単に適応し、追加の目的のタンパク質の細胞内分布を決定する追加の超分解能顕微鏡などの異なるイメージング技術と組み合わせることができます。この技術は、遺伝子組み換えや薬物処理動物などの異なるモデルシステムにも適用できます。これにより、異なる実験条件または種間の比較アプローチが可能になります。

quantifying-heterogeneous-distribution-synaptic-protein-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、解離神経培養および免疫細胞化学を用いて脳切片の両方シナプス数を定量化する方法を詳しく説明します。コンパートメント特異的抗体を用いて、我々は、シナプス前終末だけでなく、シナプス後部の専門のサイトにラベルを付けます。我々は、これらのマーカーによって生成された信号間の共局在のポイントとしてシナプスを定義します。...

定量シナプス：シナプス数を定量する免疫細胞ベースのアッセイ

シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する...

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

このビデオでは、特定のシナプス前タンパク質の分布を定量化するためのマウス脳切片の免疫蛍光染色を実演しています。このプロセスでは、非特異的な部位をブロックし、標的タンパク質と参照マーカーに一次抗体を適用し、続いて二次抗体の標識と核対比染色を行います。リファレンスマーカーは、一貫したベースラインを提供することで正確な定量を保証し、シナプス前タンパク質の分布は共焦点顕微鏡を使用して脳領域全体で分析されます。...

免疫蛍光法を用いたマウス脳におけるシナプス前タンパク質の分布の定量化

出典:Schönherr, S., et.al. は、マウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力特異的配置を調べるために、光遺伝学的免疫標識と凍結骨折レプリカ免疫標識を組み合わせました。J. Vis.

マウス脳組織の凍結破砕標本における神経膜タンパク質の免疫標識

出典:McLeod, F., et al.海馬のげっ歯類の脳スライスにおけるシナプス密度の評価。J. Vis. Exp.

免疫蛍光法を用いたマウス海馬切片のシナプスの顕微鏡解析

この記事は、神経伝達物質受容体の発現を定量化する方法と、光遺伝学的ツールのウイルス形質導入と凍結骨折レプリカ免疫標識技術の組み合わせを使用して、シナプス前およびシナプス後要素が特定されたシナプスでのパターンを分析する方法を示しています。...

複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

ここでは、近赤外染料と免疫組織化学、高分解能走査を併用し、脳領域におけるアッセイタンパク質を測定するプロトコルを紹介します。...

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

このプロトコルは、マウスの脳から高純度のシナプトソーム、シナプス小胞、およびその他のシナプス画分を取得するための堅牢で詳細な方法を提供します。この方法は、タンパク質の局在と機能の生化学的分析を含むシナプスプロセスのコンパートメント分解能での評価を可能にします。...

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

学ぶ 蛍光抗体法と共焦点顕微鏡を用いてマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布を定量化する手法。この方法は蛍光強度比を用いることで変動性を低減し、脳領域や海馬層など多階層の解析に応用可能である。

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

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