蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化
January 29th, 2019
ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。
ここでは、免疫蛍光、共焦点顕微鏡、およびコンピュータベースの分析を用いて、参照タンパク質に対するシナプスタンパク質の分布を決定するプロトコルについて説明する。我々の方法は、絶対蛍光レベルではなく比を用いて免疫蛍光染色の固有の変動性を回避する。さらに、この方法を使用すると、異なるレベルでのタンパク質分布の不均一性を分析することができます。
脳全体のスライスから脳領域、海馬の異なる層などのサブ領域まで。この技術は、マウス以外の脳およびモデル系以外の異なる組織におけるタンパク質分布を決定するために適応することができる。原稿に記載されているように、以前に単離された固定されたマウス脳を洗浄することから始めます。
その後、脳を30%スクロース0.1モルPBで15ミリリットル反応チューブに移します。クライオは、脳を48時間、または沈むまで摂氏4度でインキュベートします。その後、関心のある領域に応じてクライオ保護脳をトリミングするために鋭い刃を使用します。その後、クライオ型に脳を配置し、それを埋め込むために最適な切断温度化合物を追加し、泡を避け、切断のコロナ平面を持つように脳を適切に向けます。
氷結型をマイナス80°Cの冷凍庫に入れ、固形物を凍らせるまで置きます。凍結した組織をクライオミクロトームに取り付け、セクションの少なくとも15分前に待ってミクロトーム温度に平衡化します。25マイクロメートルの厚いコロナスライスに脳を切断し始めます。
脳組織に触れることなく、慎重に最初のスライスのOCTにガラスフックを使用してください。OCT はガラスフックにくっつきます。最初の井戸に脳のスライスを転送するためにガラスフックを使用してください。
0.1モルPBで満たされた24ウェルプレートにウェルあたり3つの隣接スライスを収集します。スライスは最大2週間染色されるまで摂氏4度で保管します。免疫染色のためのスライスを準備するには、脳スライスに描画することなく、1つの井戸からPB溶液を除去するためにプラスチックピペットを使用しています。その後、1000マイクロリットルのピペットを使用して、250マイクロリットルの新鮮なPBを追加して、余分なOCTを洗浄します。
スライスを乾燥させないように、その時に井戸ごとにこの洗浄を繰り返します。次に、プラスチック製のピペットを使用して、PB溶液を第1のウェルから除去します。1000マイクロリットルのピッドを使用して、よく働く井戸あたり250マイクロリットルのブロッキングバッファを再びうまく働かします。
シェーカーの室温でプレートを3時間インキュベートします。インキュベーション中に、反応管に1ウェルあたり250マイクロリットルの抗体バッファーを加える。次に、2マイクロリットルのピペットを使用して、適切な量の抗体を溶液に直接ピペット化し、数回軽く上下にピペットして混合します。
次に、この希釈抗体をボルテックスして適切な混合を確認できない。プラスチック製のピペットでブロッキングバッファーをうまく取り除き、井戸当たり250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えます。一晩で摂氏4度でシェーカーにプレートをインキュベートします。
翌日、プラスチック製のピペットで抗体溶液を除去します。300マイクロリットルの洗浄バッファーを1ウェルあたり1回1回洗浄し、各1回10分間を室温でシェーカーで洗浄します。洗浄中、暗闇で働き、蛍光体を反応管内で2番目の抗体に対して、一次抗体と同じ方法で希釈する。
洗浄が完了した後、プラスチックピペットで洗浄バッファーを除去し、ウェルあたり250マイクロリットルの二次抗体溶液を添加する。室温で暗闇の中で90分間インキュベートします。完成後、プラスチックピペットで抗体溶液を除去します。
洗浄バッファー1と同じ方法で洗浄バッファー2でセクションを3回洗浄します。この洗浄の間に希釈DAPIは0.1モルPBで、1〜2000濃度を達成した。プレートから洗浄バッファーを取り出した後、250マイクロリットルのDAPI溶液を加え、シェーカー上の室温で5分間インキュベートする。
プラスチックピペットでDAPI溶液を除去した後、1000マイクロリットルのピッドを使用して、1ウェルあたり0.1モルPBの500マイクロリットルを追加します。顕微鏡スライドをステレオスコープの下に置きます。細かいブラシを使用して、スライドに0.1モルPBの3つの別々の滴を追加します。
ブラシを使用すると、スライド上のドロップごとに1つのスライスを配置し、スライスを平らにして方向を付けます。すべてのスライスが正しく配置された後、紙のティッシュを使用して余分なPBを除去し、スライスを完全に乾燥させることなく慎重に乾燥させます。その後、スライドに埋め込み培地の80マイクロリットルを追加し、慎重に脳のスライスを埋め込むためにカバースリップでそれをカバーします。
スライドを覆って光の露出を避け、煙のフードで1〜2時間乾燥させ、共焦点顕微鏡の準備ができるまで4°Cの顕微鏡スライドボックスに保管します。原稿に記載されているように異なるチャネルのための全体の脳スライスの仮想組織を取得した後、ファイルをクリックしてフィジーにすべての単一のチャンネルまたは1つの画像をロードし、その後開きます。次に、自由な手の選択ツールを使用して、DAPI チャネル内の 1 つの半球を線分化します。
編集をクリックしてから選択し、マスクを作成して、選択した領域のマスクを作成します。次に、分析をクリックし、粒子を測定して、単一チャネルの平均蛍光強度を決定します。各チャンネルの平均蛍光強度値を決定するために、単一のチャンネルを選択することを確認します。
その後、単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。対象領域における単一チャネルの平均蛍光強度を決定するために、フリーハンド選択ツールで領域を線引する。核脳の切片を染色するDAPIで染色した後、細胞密度が低い領域よりも、穿刺パターンと高い細胞密度の領域が明るくなります。
Mover抗体による染色は、シナプトフィシンがより均質な分布を明らかにした脳全体の明るいホットスポット領域と調光領域を有する不均一な分布を明らかにした。画像のオーバーレイは、シナプトフィシンを示す緑色蛍光と比較したMoverタンパク質を示す赤色蛍光の差分布を示した。定量分析後、半球および対象領域にわたる異なるチャネルの蛍光強度値が、MoverとSynaptophysinの両方について決定された。
シナプトフィシン蛍光値に対する引越し物蛍光値の比率は、シナプス小胞に対する高い、低いMoverレベルの領域を有するMoverの不均一な分布を示す。相対的なMoverの豊富さ半球全体と比較して関心のある1つの領域の比率とパーセンテージに翻訳された割合は、平均に対する1つの関心領域にどれだけのMoverが存在するかを示した。相対的な移動量は、海馬のサブフィールド内の異なる層について決定された。
対象となる3つの領域は、それぞれの層の比と対応する半球の比率を比較することによって定量化される。この手順は、簡単に適応し、追加の目的のタンパク質の細胞内分布を決定する追加の超分解能顕微鏡などの異なるイメージング技術と組み合わせることができます。この技術は、遺伝子組み換えや薬物処理動物などの異なるモデルシステムにも適用できます。
これにより、異なる実験条件または種間の比較アプローチが可能になります。
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概要
この研究は、免疫蛍光と共焦点顕微鏡を用いてシナプス蛋白の分布を定量的に分析する方法を提示しています。この方法は、絶対蛍光レベルではなくタンパク質分布比を評価することができ、脳以外にも様々な生物学的組織に適応可能です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫蛍光技術
背景
- シナプス蛋白の検出は神経機能を理解する上で重要です。
- 免疫蛍光染色は変動しやすい傾向がありますが、この方法はその変動を軽減します。
- この技術は異なる組織やモデル生物にわたって使用できます。
研究の目的
- シナプス蛋白分布を定量化するための正確なアプローチを開発すること。
- 様々な脳レベルでのタンパク質分布の不均一性を評価すること。
- 複数の生物学的文脈に適したタンパク質分析技術を改良すること。
使用された方法
- 脳切片に対する免疫蛍光と共焦点顕微鏡の組み合わせ。
- 以前に分離されたマウス脳組織を生物学的モデルとして使用。
- 脳組織の凍結保存と25マイクロメートル厚の切片化。
- 抗体適用と染色のための段階的な洗浄とインキュベーション手順。
- 蛍光強度の定量化のためのFIJIソフトウェアを使用した画像分析。
主要な結果
- この方法は脳領域全体にわたるタンパク質分布の明確な描写を提供します。
- 異なるシナプス蛋白は分布において不均一および均一パターンを示します。
- 高細胞密度領域ではより明るい信号が観察され、DAPI染色の有効性が示唆されます。
結論
- この研究はシナプス蛋白分布を定量的に評価する能力を強化します。
- この方法は多様な組織とモデルシステムにわたって分析を可能にし、汎用性があります。
- これらの分布パターンを理解することで、神経機構や潜在的な疾患モデルへの洞察が得られます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of synaptic protein distribution using immunofluorescence and confocal microscopy addresses a critical need for reproducible, comparative protein localization in neurobiology and CNS drug discovery. By leveraging ratio-based fluorescence analysis, this method enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity across preclinical models. The approach enables robust cross-study and cross-platform comparisons, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of synaptic protein localization relative to reference markers.
- Supports functional target validation by revealing heterogeneous protein distribution across brain regions and subregions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing region-specific protein abundance patterns.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain tissue systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes immunofluorescence outputs by using ratio metrics, reducing inter-experiment variability.
- Enables reproducible, scalable quantification of protein distribution for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on synaptic protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein distribution data with disease-relevant brain regions and subfields.
- Enables comparative studies across genetically modified or drug-treated animal models.
- Supports translational biomarker identification by quantifying protein heterogeneity at multiple anatomical levels.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative spatial protein data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in CNS-focused R&D.
- Discovery Biology: Provides quantitative, region-specific protein distribution data for hypothesis-driven target validation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates ratio-based fluorescence measurements for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-model and cross-condition analyses.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable workflow for diverse tissues, antibodies, and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of protein localization studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Depends on access to high-quality antibodies and advanced imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to various tissues, model systems, and imaging platforms with protocol optimization.
- Potential limitations include antibody specificity and photobleaching during imaging.
