マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

この手順の全体的な目標は、精製ステップを必要としないモジュール式タンパク質アレイを作成し、任意のタンパク質ライブラリと互換性を持たせることです。これは、まずアセンブリーPCRによって合成遺伝子を生成することによって達成されます。次に、合成遺伝子をエポキシスライド上に配列します。

マイクロ流体デバイスを製造するには、PDMSとシリコーン制御およびフローモールドを使用します。次に、マイクロ流体デバイスをスポットDNAアレイに整列させます。最後に、ウサギ網状赤血球溶解液をマイクロ流体デバイスに流し込み、タンパク質を発現させます。

最終的には、蛍光抗体標識を通じて数千種類のタンパク質の発現を示す結果を得ることができます。マイクロ流体ベースの手法を使用することには、タンパク質マイクロアレイなどの既存の方法に比べていくつかの利点があります。DNAをマイクロアレイ化し、セリスを使用してデバイス上でタンパク質を作製します。

したがって、タンパク質の精製は必要なく、タンパク質が乾燥することはありません。実験中、それらは新鮮さを保ちます。マイクロ流体技術はまた、より高い感度を提供します マイクロ流体デバイスを製造するには、シリコーン制御およびフローモールドをクロロトリメチルシレン蒸気に10分間さらして、エラストマーの放出を促進します。

ベーキングステップの後、シリコーンベースのエラストマーと硬化剤の混合物を、制御金型とフロー金型用にそれぞれ5対1と20対1の2つの異なる比率で調製します。5 対 1 の PDMS を制御層に注ぎます。制御層を脱気し、摂氏80度で30分間焼きます。

次に、20〜1つのPDMS混合物をフロー層に2、600 RPMで60秒間スピンコーティングし、次に摂氏80度で30分間焼きます。SU8パターンが剥がれないように注意しながら、制御層を金型からゆっくりと離します。次に、メスを使用して、デバイスの周囲を切断し、鈍い針を使用して穴を開け、顕微鏡下で制御チャネルにアクセスします。

フロー層と制御層を手動で位置合わせし、左上隅からボタンバルブを反応チャンバーの中央の制御層に配置します。次に、最初の行を揃え、制御レイヤーを行ごとにゆっくりと離します。すべてのボタンバルブが反応チャンバーの中央にあり、アドレスバルブと入力バルブが正しい位置で流路を横切っていることを確認します。

すべての行が整列するまで、このプロセスをローカルで繰り返します。完全に位置合わせされたら、PDMSを側面と角から慎重に持ち上げて、PDMSの張力を解き放ちます。次に、焼いた後、デバイスを摂氏80度で2時間焼きます。

周囲を切断し、フローモールドパンチ穴から2層デバイスをはがして、フローチャネルにアクセスしてデバイスのDNAコンストラクトを生成します。PCRを実施して、T 7プロモーター、リボソーム結合部位、両端に異なるエピトープタグを持つオープンリーディングフレーム、およびT sevenターミネーターで構成される合成遺伝子を作製します。配列のための合成遺伝子を準備するには、ポリエチレングリコールとDトリオース二水和物の混合物を作ります 384のウェルに反応ごとに2マイクロリットルを分注します。

ウェルプレート。合成遺伝子を384ウェルプレートに加えます。次に、蒸留水を最終容量の20マイクロリットルに加えます。

次に、マイクロアレイスポットを使用して、エポキシコーティングされたガラス基板上に一連の合成遺伝子を注入します。ステレオスコープの下で、マイクロ流体デバイスをDNAチャンバーの中央にDNAスポットを配置した遺伝子アレイに手動で位置合わせします。次に、残りの行を揃えます。

デバイス全体を微調整して仕上げることで、PDMSへのストレスを軽減し、PDMSがマイクロアレイにしっかりと結合するようにします。ローカルに持ち上げます。最後に、デバイスを80°Cのホットプレート上で一晩インキュベートすることにより、スライドガラスに接着します。

このセクションでは、視覚化の目的で食用色素を使用します。制御層のバルブは、ラボビューを使用してコンピューターから作動します。ラボビュースクリプトは、電子制御ボックスを介して一連のソレノイドマイクロバルブを制御します。

ソレノイドバルブマニホールドは圧縮空気に接続されており、圧縮空気はデバイスの制御バルブへの空気の流れと圧力を制御します。内径0.02インチの柔軟なプラスチックチューブとステンレス鋼ピンを使用して、デバイスをソレノイドバルブマニホールドに接続します。チューブに二重蒸留水を入れ、ピンを制御層のアクセス穴に挿入します。

各チューブが対応する制御チャンネルに接続されていることを確認してください。制御チャネルをアクティブにするには、ラボビューアプリケーションを実行し、空気圧を5PSに設定します。次に、ラボビュースクリプトからバルブをアクティブにして空気圧を加えます。これにより、PDMS制御チャネルに水が押し込まれ、欠陥のあるデバイスの制御チャネル間の潜在的なクロストークが特定されます。

最初にサンドイッチとアドレスバルブを充填します。結局のところ、制御チャネルとバルブは水で満たされているため、バルブをプライミングして、その下の流路をブロックします。最初に空気圧を15 PSIに上げ、次にラボビュープログラムで、個々のソレノイドバルブに接続された一連のオンオフスイッチを使用します。

すべてのスイッチボタンをオンにしてすべてのバルブをアクティブにし、すべてのバルブが開いていることを確認します。チューブをフローインプットの1つに接続し、4〜5PSIでデバイスに空気を流します。これにより、スライドガラスから粘着性のあるバルブが解放されます。

これで、デバイスは準備が整い、視覚化の準備が整いました。黄色の食用色素は、このセクションの試薬を視覚化するために使用され、無色の溶液はヒッピーを表して、表面上のタンパク質配列の自己組織化を促進し、マイクロ流体デバイス内での非特異的吸収を防ぎ、最初に必要な溶液を含む新しいチューブをデバイス内の流路の1つに接続することにより表面を化学的に修飾します。次に、チューブの自由側を手動マニホールドに接続し、空気圧の流れを開きます。

40マイクロリットルのビオチン高揚BSAを新しいチューブに装填し、その約半分を装置内に20分間流します。50ミリモルのヒッピーを使用して、各ステップの間に反応しない基質を洗い流します。次に、25マイクロリットルのストレプトアビジンを20分間流します。

ビオチンの上で、ビオチンの高揚したBSAの上に、ボタンの周りの表面を食べるために5分間ヒースで洗い、ボタンバルブを閉じて残りのビオチン化BSAを流し、その後、エンドウ豆で再び5分間洗浄します。最後に、ボタンの下に抗ヒスタグアレイを作成するには、ボタンバルブを放し、30マイクロリットルのペンタヒスビオチンを20分間流して、デバイス上にタンパク質のアレイを作成します。ネックバルブを開き、ウサギの網状赤血球を流します。

転写および翻訳反応溶液をデバイスを介してDNAチャンバーに迅速に結合します。次に、サンドイッチバルブを閉じて各遺伝子をその環境から分離し、デバイスをホットプレート上で摂氏30度で2.5時間インキュベートします。次に、タンパク質の末端をC mix SI 3抗体で標識します。

最後に、532ナノメートルのレーザーと575ナノメートルの発光フィルターを備えたマイクロアレイスキャナーを使用します。タンパク質レベルを決定します。この図は、タンパク質アレイ上のタンパク質発現のさまざまなレベルを示しています。

通常、遺伝子ライブラリーの20%が検出可能なレベルまで発現しません。バックグラウンドレベルは、DNAで発見されなかったチャンバーを使用して決定しました。したがって、対応するタンパク質チャンバーからのシグナルは、標識抗体のノイズまたは非特異的吸収によるものです。

適切に実行されていれば、そのデバイスの検証には 4 時間、チップの実験には 5 時間かかります。