Name: 細胞の Cardiomyogenic の可能性を高めるに同時電気的・機械的刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶ 電気機械刺激法を用いて細胞の心筋形成能を向上させる手法。同時刺激により細胞成熟を促進し、細胞治療や創薬スクリーニングへの応用が期待される。

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著者は、ICREC 研究プログラム (IGTP、バダロナ) と電子と生体計測グループ (UPC、バルセロナ)、特に教授 J. Rosell ・ フェレールのメンバーに感謝したいです。さらに、著者認める幹細胞トランスレーショナル医学ジャーナルと以前公表数値 (Llucià Valldeperas、らの適応を許可するための AlphaMed プレス30). このプロトタイプの開発とプロトコルのデザインは Ministerio デ Educación y サイエンス (SAF 2008-05144) Ministerio デ Economía y Competitividad (SAF 2014 59892)、欧州委員会によって支えられた第 7 フレームワーク プログラム (RECATABI、NMP3-SL-2009-229239)、読書用ラ Marató デ TV3 (080330、201516、201502)、フンダシオン ・ パラ ・ ラ Innovación y ラ Prospectiva en サラッド en エスパーニャ (FIPSE; 06 00001396 15)。

本研究は、患者サンプルから人間の心臓 ATDPCs を使用しています。使用は、倫理委員会によって承認されているし、すべての患者は、インフォームド コンセントを与えた。研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言の原則に準拠しています。
1. 準備
<ol><li>オートクレーブ 2 ピンセット、電気刺激のための 12 のプラチナ PTFE 電極やいくつかの紙タオル、121 ° C、20 分で。</li>
	<li>
12 PDMS カスタムメイド構成 (図 1A) を消毒します。
	<ol>
<li>15 分の室温で 5 mL の滅菌、蒸留水磁気攪拌の各構成体を洗います。</li>
		<li>5 分間室温での磁気撹拌で 70% エタノール 5 mL で 1 x を洗ってください。</li>
		<li>アルコール残基を削除するために、洗浄あたり 10 分の室温で 5 mL の滅菌、蒸留水磁気攪拌と 5 x を洗ってください。</li>
		<li>乾燥フロー キャビネット一晩中滅菌ペーパー タオルの上の構成要素。</li>
		<li>使用するまで滅菌 50 mL 遠沈管に保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞播種 (日-1)
<ol><li>細胞播種前、に転送プレートに滅菌洗浄 PDMS 構造と完全な殺菌を確実に 5 分間紫外線にそれらを公開します。</li>
	<li>35 mm 細胞培養プレート、または 6 ウェル プレート、即時細胞播種のために各構成要素を転送します。</li>
	<li>
心臓 ATDPCs の合流 T75 フラスコを trypsinize します。
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 の 5 mL の T75 フラスコを洗います。</li>
		<li>0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加し、セルをデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>トリプシン-EDTA を不活化する完全培地 5 mL を追加します。</li>
		<li>収集すべては 15 mL チューブの洗浄フラスコ細胞に残っているセルを収集する PBS の 5 mL の 2 倍。</li>
		<li>22 ° C で 5 分間 230 × gで遠心、上清を除去、検定室でそれらをカウントする完全培地 2 mL に細胞を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一日の後、細胞によって 12 の PDMS 構造 (図 1A, B) に覆われたシードの表面の約 80% の細胞のプールに心臓 ATDPCs (2.5 x 10 の5セル/mL) 200 μ L をシードし、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。 注:2-4 h 後セルを添付してください。セル接種は、セル サイズと成長に応じて用意しています。小さい細胞の播種密度を増やす必要があります。</li>
	<li>優しくプレートあたり prewarmed 完全培地 (10% 胎仔ウシ血清, 1 %l-グルタミンおよび 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した α MEM) 2 mL を追加します。</li>
	<li>一晩培養条件 (通常 37 ° C、5% CO2) で構造を孵化させなさい。</li>
</ol>3. 電気機械刺激セットアップ (0 日)
<ol><li>手順を開始する前に、電気刺激の六つの構成要素と nonstimulated コントロールとして六つを取る。刺激のより少ない 6 枚と同じミディアム ボリュームに空の構造を使用する適切な電気刺激。</li>
	<li>70% のエタノールの刺激を清掃、キャビネット フロー内に置きます。</li>
	<li>滅菌電極と流れのキャビネット内のピンセットをもたらします。</li>
	<li>電極と構成要素を簡単に操作する培養プレートからメディアの 90% を削除します。まず、固定とモバイルの両方の磁石の磁力 (PDMS 変位磁石に向かって培養プレート内) を確実に正しい位置に PDMS 構成要素を配置します。次に、電極コネクタと PDMS コンス トラクターに指定された空間に PTFE 部分に白金線を接続します。</li>
	<li>新鮮な prewarmed 完全な媒体の 2.5 mL を各構成要素に追加します。 注:プロシージャ全体で無菌性を維持し、一度に 1 つ構築する上で動作します。使用するまで 37 ° C、5% CO2インキュベーター内の構成体の残りの部分を保持します。</li>
	<li>一度すべての PDMS 構造体の配置し、電気的に接続された、プラットフォームに戻して 37 ° C、5% CO2インキュベーター。</li>
	<li>電気的・機械的ソースに接続します。</li>
	<li>
刺激プログラムを構成します。電気刺激や機械的刺激を制御するアプリケーションのユーザー インターフェイスを通じて電気的および機械的刺激による体制を指定します。同期を設定します。
	<ol>
<li>電気刺激装置に切り替えます。メイン メニュー画面に表示するを待ちます。<ol>
<li>次に、選択オプション 2: 編集シーケンス + 入力。</li>
			<li>シーケンスメニューを次のように編集します。<ol>
<li>電圧または電流のどちらかを選択するのに、[モード] タブを使用します。+をクリックして現在選択し、 Enterキーを押します。</li>
				<li>振幅タブの+/-に1 (mA)を選択し、 enter。</li>
				<li>期間 (T)の+/-に1000 (ms)を選択し、 enter。</li>
				<li>パルス持続時間 (Tw)と+/- 2 (ms)に設定し、 Enterキーを押します。</li>
				<li>トリガー モード] タブで、ソフトウェアによって外部を選択し、 Enterを押してください。</li>
				<li>メイン メニューに戻るを選択オプション 4: シーケンスを生成するキーを押します。 注: 電気刺激装置は、シリアル ・ ポートを介して機械的刺激装置アプリケーションからトリガー コマンドを受け取るまでにスタンバイにかかっています。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>コントロール アプリケーション パネル (図 2C) の機械的刺激のセクションで以下の手順を実行します。<ol>
<li>パルス周期テキスト コントロールで 1,000 (ms) を記述します。</li>
			<li>機械的パルス持続時間を設定するの時間 (Tw)テキスト コントロールで 500 (ms) を記述します。</li>
			<li>書き込み 2,000年 (AU)遠足テキスト コントロールで 10% コンストラクト伸長を提供します。これは、線形制御モーターのステップ数です。 注: ここに適用刺激プロトコル 1 Hz と 7 日間のストレッチ 10 %50 mV/cm の交互になる電流 2 ms 相性矩形波パルスので構成されます。機械的パルスの立ち上がりと立ち下がり時間は、大体炉圧力パルスの形状を模倣する、100 ミリ秒に設定されます。また、繰り返しモード連続に設定されて、パルスの数を表示するカウンターがあります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>メディア 2 倍の週 (月曜日と木曜日の午後) を変更します。最初に、古いメディアを削除します。次に、PDMS サポート、決して直接細胞のプールの両側に暖かいメディアを追加します。 注:セルは、高い成長率を持っている、メディアは変更された 3 倍の週 (例えば、月曜日、水曜日、および金曜日) をする必要があります。切断、すべてのケーブルを再接続する必要があるが、培養皿と電極の場所から削除する必要はありません。</li>
	<li>実験の実行後は、サンプルを収集します。</li>
</ol>4 実験 (7 日目) の終わりサンプル コレクション
<ol><li>
RNA の解析
	<ol>
<li>構造体を洗って 3 ml の 1x PBS 室温で 5 分間の 2 倍。</li>
		<li>(構造体全体をカバーするために十分な) 各プレートに 0.05% トリプシン-EDTA の 3 mL を追加し、37 ° C で 5 分間待つ</li>
		<li>セルが切り離された後は、トリプシン-EDTA を不活化する完全培地 2 mL を追加します。</li>
		<li>15 mL のすべてのセルがチューブし、コンストラクトを洗う収集 3 ml に残っているセルを収集する PBS の 2 倍。</li>
		<li>230 x gで 22 ° C で 5 分間遠心</li>
		<li>上澄みを除去し、1 mL の PBS でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>1.5 mL チューブ、230 x gで 5 分間遠心する携帯ソリューションに転送します。</li>
		<li>上澄みを除去し、さらに RNA の隔離のための溶解試薬の 700 μ L で-80 ° C でペレットを格納します。</li>
		<li>製造元の指示に従って商業キットを使用して RNA を分離します。</li>
		<li>キットと製造元のプロトコルによると、ランダムな hexamers を使用して隔離された RNA を逆転写。</li>
		<li>小さな RNA 濃度 preamplify し、RNase フリー、希釈 1:5 水以降のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を実行する前に。リアルタイム RT-PCR のための標準プロトコルを続けるし、主な心疾患マーカーをチェックします。 注: 典型的な心筋マーカーを構成する心筋転写因子などの異なる種類の初期と後期のマーカー (心筋固有エンハンサー要因 2 a [MEF2A] GATA 結合タンパク質 4 [潟-4]) と構造 (心筋トロポニン私 [cTnI] 心臓トロポニン T [cTnT] α-アクチニン) とカルシウム調節 (Connexin43 cx [43] サルコ-/小胞体 ca 2 +-[SERCA2] atp アーゼ)30。蛋白質の隔離は、必要な場合にも実行できます。RNA および蛋白質の同時分離は、サンプル量が少ない場合、市販試薬・ キット (材料表) を使用して、同じサンプルを実行できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostainings の 注:これは PDMS コンストラクトの細胞のプールに接続されているセル上で直接実行されます。したがって、お勧めします配置、プレートから離れて細胞のプールの上にパラフィン フィルムの 1 cm x 1 cm の蓋を培養溶液の蒸発を最小限にするたびに。<ol>
<li>構造体を洗って部屋の温度で 5 分間 3 mL の PBS で 2 倍。</li>
		<li>2 ml の 10% ホルマリン室温で 15 分間の構成要素に接続されているセルを修正します。</li>
		<li>洗浄セル 3 x 3 ml の PBS の室温で 5 分間。長期保存のためサンプルを PBS で 4 ° C では、0.1% アジ化ナトリウムを残す</li>
		<li>3 ml の PBS + 0.5% 洗剤のセルを permeabilize (x, それぞれ 3 時間室温での 5-10 分)。</li>
		<li>非特異的な抗体の結合をブロックする 100 μ L の PBS + 10% 馬血清 0.2% 洗剤 + 1 時間室温で 1% ウシ血清アルブミンの細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>100 μ L の PBS + 10% 馬血清 0.2% 洗剤 + 1% ウシ血清アルブミン + 1 時間室温で一次抗体と細胞を孵化させなさい。たとえば、一次抗体配列とコネキシン 43 (1: 100)、サルコメア α-アクチニン (1: 100) 潟 4 (1:50)、MEF2 (1:25)、および SERCA2 (1:50)。</li>
		<li>5 分間室温で 3 mL の PBS で 3 x を洗います。</li>
		<li>100 μ L の PBS + 1 h、暗所に室温で二次抗体と細胞を孵化させなさい。 注:二次抗体は異なった fluorophores が付いている共役し、counterstaining エージェントが使用されました。</li>
		<li>洗って 5 分、暗所に室温で 3 mL の PBS と 3 倍。</li>
		<li>室温 15 分間暗闇の中で核染色 (0.1 μ g/mL) 100 μ L で細胞を PBS で孵化させなさい。</li>
		<li>洗って 5 分、暗所に室温で 3 mL の PBS と 3 倍。</li>
		<li>4 ° C では、0.1% アジ化ナトリウムを 3 mL の PBS で取得までのサンプルを格納します。 注:施工厚は約 0.5 mm のため長作動距離対物レンズで倒立蛍光と共焦点顕微鏡に顕微鏡の獲得です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者は、刺激デバイスおよびプロトコルは (WO 2013185818 A1、WO 2017125159 A1) 以前に特許を取得したことを除いて開示、何もありません。

電気刺激は、敵対心環境の細胞を準備および心臓のコミットメントの強化の安全な代替案のように見えます。ここでは、プロトコルの主な心臓マーカーの発現を増加され、心臓前駆細胞で説明報告梗塞マウス心筋30次の注入のために有益であること。一般に、電気機械的刺激の心臓 ATDPCs は早期に関連、構造解析、遺伝子やカルシウム調節前の電気的または機械的刺激と個別に達成されたことの表現を高めた。実際、電気機械的刺激心 ATDPCs はより完全なプロフィールを表示、以前の報告よりもより心臓の血統にコミットするように見えた。
変調心臓遺伝子発現はした皮下 ATDPCs と比較して心臓の ATDPCs の顕著な豊胸後は特に電気の刺激の後、両方のセルの種類。この結果はそれぞれのセル隔離、すなわち、心外膜や皮下脂肪用脂肪組織の起源の結果かもしれない。心臓と心膜の両方を取り巻く、心外膜脂肪組織は代謝活性の高いオルガンと前駆細胞のソースです。関心、心外膜脂肪が心筋の解剖学的および機能の継続性。通常の状況で、心外膜脂肪が生化学的および発熱心保護のプロパティ逆に、病理学...

心臓の機能は、電気刺激や機械的収縮の結合に基づいています。簡潔に、心筋細胞間の接合は、全身および肺システムを介して血液を送り出す心臓のほぼ同期の収縮を生成への電気信号の伝達を許可します。心筋細胞は、したがって、遺伝子発現と細胞機能を調節する電気と機械の両方の力を受けます。したがって、多くのグループが機械的・電気的刺激が心臓の開発、機能、および成熟の役割を理解する心の生理環境を模倣文化のプラットフォームを開発しようとしています。In vitro電気的・機械的刺激個別に適用されている広範囲機能特性を高める細胞の成熟を増やすか、細胞間結合とカルシウムの処理1を改善する心臓組織工学,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. それにもかかわらず、同期電気機械式エアコン残る未踏刺激およびプロトコルの開発の挑戦のため、必須の最適化22のため。
予備的な作業対応電気刺激電気刺激および灌流; の組み合わせとしてしかし、流れは心室充填23,24,25の典型的な歪みベースの変形を伴わない。多くの生理学的アプローチが物理的な変形と等容収縮26,27,28,29,30 を模倣するストレッチ電気刺激を併用後、 ,31。風水ら 2005、心筋収縮と26を強化されたレポートにおける電気刺激の最初のデモンストレーションを説明しました。王ら 5-アザシチジンと間葉系幹細胞を前処理し、同時の電気的・機械的エアコン、recellularization、細胞生存率、心筋分化と改造27組織改善を適用します。これらの出版物以来より多くのグループが細胞の電気刺激に関する報告または設計組織 (例えば、黒28、Vunjak ノバコビチ29,31, と私たちのグループの30)、最初の調節された細胞は、生体内で30をテストしました。簡単に言えば、モーガンと黒いくつかの組み合わせをテスト電気的・機械的刺激の刺激間のタイミングあった重要なため遅延結合された電気刺激が最高の結果28を得られたことを報告します。次に、Godier Furnémont との共同研究ラット新生児心筋細胞から人工心臓の筋肉構造のため電気刺激プロトコルを最適化し、肯定的な力周波数関係29を最初に達成。その後、私たちのグループ報告、電気機械的前処理細胞主な心臓マーカーの in vitro発現の増強、その広範な有益な生体内での効果など心機能を改善または、梗塞で血管密度を増加国境地域30。最も最近の出版物を示した心筋組織幹細胞由来心筋細胞からは受ける成熟レベル人間に近い成人心臓の構造と機能31に達した電気機械をご利用いただけます。また、代替三次元刺激プラットフォーム構成には、電気、機械、ゲルロボット足場、32がセルに地形のキューに接続されています。また、機械的変形 (細胞膜のストレッチと圧縮) は、極端な条件33と同様に、通常の生理学的条件を模倣した伸縮性電極を用いた誘導もことができます。
したがって、理論的根拠は生理学的条件に基づく in vitro における電気刺激が細胞の cardiomyogenic の可能性を高めることができます。確かに、この刺激がさらに臨床シナリオで心筋に治療用細胞の統合の恩恵を受けるか薬剤スクリーニング用組織の成熟を増やします。
また、孤立し、心のひと脂肪組織由来神経前駆細胞の人口を特徴と起源 (心臓 ATDPCs)34。これらの細胞は、心外膜脂肪にあります。これらの細胞は心筋梗塞の治療に有益な病理組織学的、機能的な効果を表示、また潜在的な心臓と血管内皮分化を維持します。30,35です。 これらの利点が生物物理刺激後増加を。
その結果、デバイスと興味のセル人口のための刺激体制を開発し、効果を検討した.このメカニカル プロトコルをアクティブ セルの滅菌方法でストレッチを誘発する新たな戦略して前出版物36, 電場刺激との組み合わせと比較して非侵襲的です。技術がここに報告は、装置と細胞の電気、機械、および電気刺激の使用方法の詳細について説明します。
このデバイスは、個別または同時に電気的・機械的刺激を提供することができます。刺激は、presterilized セル サポート、標準培養プレート、機械的および電気的力 (図 1) を誘導するプラットフォーム内部電極を含む非侵襲的かつ無菌の新たなアプローチで実行されます。
プラットフォームは、プレート、サンドイッチ構造レーザー カット poly(methyl methacrylate) ・ プリント基板部分成っている六つの文化まで保持できます。プラットフォーム プロトタイプは、単相性プログラム可能なコンピューター制御電気刺激装置、電極、および配置 6 10 mm x 10 mm x 5 mm ニッケル メッキ ネオジム固定磁石の堅牢な接続のため、プリント回路基板の組み合わせに依存しています。培養皿の片側に近い6 駆動磁石 (同じモデル) 前培養皿の反対側に置かれ、リニア サーボモータと移動とアルミのバーもあります。電動モーター コント ローラー、RS-232 ポートを通じて商業ソフトウェアが運営によって (材料の表を参照してください)。ユーザー インターフェイスとプログラミング可能な刺激、電気的強度、脈拍の持続期間、頻度、機械的刺激、そのデューティ サイクル、パルス振幅 (磁石遠足)、パルス数の周波数をプログラムすることが可能です。斜面。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> 図 1: 電気刺激装置。(A) PDMS 構造細胞調節のために使用されます。(B) 電極と磁石を含む PDMS コンストラクトの図面。(C) 電気機械の調節を行うためのプリント回路基板 (プラットフォーム) の詳細。このパネルは、Llucià Valldeperas から変更されているら30。(D) 電気刺激プラットフォームとユーザー インターフェイス (コンピューター) の画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
刺激と電気エアコンのメソッドは、2 つの国際特許 WO 2013185818 A137ヲ 2017125159 A138で詳しく説明します。
構成要素のセル、電極、および磁石に構造サポートを提供するように設計されている生体適合性シリコーンは前述10,21。簡単に言えば、彼らはポリジメチルシロキサン (PDMS) 成形し、生理学的レベルに近い、1.3 MPa のヤングと常温で硬化ので構成されます。構築には柔軟な地区 (10 × 10 × 2 mm) 細胞培養プールが含まれて、電極を保持するために 2 つの内側横スロットと 2 つに 6 mm × 2 mm × 4 mm ニッケル メッキのネオジム磁石が埋め込まれています。電極は 0.2 mm プラチナ線 2 mm × 3 mm x 12 mm ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) に巻きつけて (電極、約 23 ターンごと 21 cm) バー コアし、誘導電界を作成する柔軟なエリアの反対側に配置で構築されて電気刺激。メカニカル ストレッチ サポートに埋め込まれた磁石と培養プレートの横にある、および移動のアルミ製アームに外部の磁石の磁力によって実現されます。このように、無菌バリアを壊すことがなく細胞サポートを拡張できます。このアプローチは、細胞膜に適していますが、三次元構造体に適応することができます。
さらに、規則的なパターンされない可能性があります、セルがシードされて印刷ルールド回折格子 (1,250 溝/mm) を使用します。その透明性と 0.5 mm 厚のため明視野と蛍光顕微鏡下で PDMS 構築する上で培養した細胞の直接可視化が可能です。PDMS 培養プールがある現在のケースでは、セル間の電場勾配を最小化する電界に垂直にセルを配置する、伸縮力に垂直な垂直面パターン。
図 1は、構成や刺激のために使用されるデバイスの詳細な説明を示します。PDMS を構築し、ストレッチ (図 1 a, B) のセルの特性が最適化されています。刺激は、PDMS の構成要素に接続されているセルに必要な電気的・機械的刺激の効果的なアプリケーションの検証します。このプロセスでは、ソフトウェアのインターフェイス (図 1、D) を通じて良い接続とユーザー操作性を確保する含まれています。
細胞刺激このカスタムメイドのデバイスを使用するための手順はプロトコル」に記載されています。

<table><tbody><tr><td><強力>刺激装置</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニッケルメッキネオジム磁石</td><td>スーパーマグネテ</td><td>Q-10-10-05-N</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルメッキネオジム磁石</td><td>スーパーマグネテ</td><td>Q-06-04-02-HN</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS) SYLGAR 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>ルールド回折格子 (1250溝/mm)</td><td>ニューポート</td><td>05RG150-1250-2</td><td></td></tr><tr><td>モーターコントローラー</td><td>Faulhaber</td><td>MCLM-3006-S</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-065</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>BD Falcon</td><td>45353001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM、100x</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ペニチリナ/ストレプトマイシン、10.000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地イーグル (アルファ-MEM)</td><td>Sigma</td><td>M4526-24x500ML</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>プロテイン&RNA分析</ストロング>プロ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>テアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>QIAzol 溶解試薬</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep RNA/Protein Kit</td><td>Qiagen</td><td>50980404</td><td></td></tr><tr><td>Rneasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal Probes One-Step Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>172-5140</td><td></td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー</td><td>Qiagen</td><td>79236</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp MasterMix 2x</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR MasterMix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% ホルマリン</td><td>Sigma</td><td>HT-501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td></td><td>Σ H1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Σ</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清 Albumina (BSA)</td><td>Σ</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td>Σ P6543</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Σ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン アレクサ 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S8032-100g</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Connexin-43 rabbit 一次抗体</td><td>Sigma</td><td>C6219 lot#061M4823</td><td></td></tr><tr><td>sarcomeric &α;-actinin mouse 一次抗体</td><td>Σ</td><td>A7811 lot#080M4864</td><td></td></tr><tr><td>GATA-4 ヤギ一次抗体</td><td>R&D</td><td>AF2606 VAZ0515101</td><td></td></tr><tr><td>MEF2 ウサギ一次抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-313 lot#E0611</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2 ヤギ一次抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8095 lot#D2709</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 二次抗体抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-225-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy2二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy2二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-225-147</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞の cardiomyogenic の可能性を高めるに同時電気的・機械的刺激

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

心血管疾患は、先進国の主要な死因です。その結果、効果的な心臓の細胞療法のための要求は基礎研究と臨床応用のための in vitro忠実度の高いひと心筋を開発する幹細胞とバイオ エンジニア リング分野の研究者に動機を与えた。ただし、心筋細胞の未熟な表現型は機能的模倣は機械的および電気的信号によって主に特徴付けられる大人の心筋組織の取得に制限です。したがって、このプロトコルの目的を準備し、生理学的パラメーターをさた電気刺激による標的細胞のポピュレーションを成熟です。心臓ティッシュ エンジニア リングの進化のより多くの生物学的アプローチ、方向、したがって、生物の刺激に基づく戦略が勢いを増しています。この目的のために開発した装置は、ユニークで個別または同時電気的・機械的刺激、慎重に検証し、特徴をことができます。さらに、方法論はこの刺激と特定のセル人口のために最適化されているが簡単にこと他のデバイスおよび細胞ラインに適応です。ここでの結果は、電気刺激後の細胞集団の心臓のコミットメントの増加の証拠を提供しています。基づかせ刺激細胞は初期・構造・ カルシウム調節遺伝子を含むメインの心臓マーカーの発現の増加を表示します。この携帯エアコンはさらに再生細胞療法、疾患モデル作製、高スループットの薬剤のスクリーニングに役に立つかもしれません。

図 2は、細胞の刺激の一般的なスキーマを表します。簡単に言えば、細胞 PDMS コンストラクトでシード, 週に 2 回を行うメディア変更で電気刺激を受ける.Nonstimulated セルは、電気エアコンのコントロールとして使用されました。また、我々 は、実験に余分なコントロールを追加、皮下 ATDPCs 心臓 ATDPCs コントロールとして使用されていました。皮下の ATDPCs は、次の心臓 ATDPCs33と同じ分離と培養手順皮下脂肪から取得されます。PDMS の構成要素に接続されている細胞は、刺激の前後に典型的な紡錘状の表現型を証明されています。また、この場合次の垂直パターン、パターン付きのサーフェスによるとセルが配置されます。
電気的・機械的刺激が個別に最適化された最初。まず、電気刺激は、心臓の ATDPCs<sup class="x...

ここで心臓の生理学をエミュレートする電気的・機械的刺激を用いたセル人口をトレーニングするためのプロトコルを提案する.この電気刺激は扱われた細胞の cardiomyogenic の可能性を高めるもの、さらに細胞療法、疾患モデル作製、および創薬スクリーニングの有望な戦略です。

細胞の Cardiomyogenic の可能性を高めるに同時電気的・機械的刺激

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

これは、細胞に電気機械刺激を適用する方法です。細胞集団への影響を研究するための複数のアプリケーションを有し、生体内送達の事前トレーニング、および細胞成熟を行う。利点は、電気および機械的刺激は、無菌ウイルスをそのまま維持しながら、個別に、または同時に同じデバイスで適用することができるということです。この技術は、私たちの治療への間接的なアプローチです。細胞療法は、電気機械的に刺激された細胞が、イントロ心筋を治療する興味深い細胞集団であり得る。この方法は一般的に心血管分野に属するが、神経系にも適用できる。これは忍耐を必要とする簡単なテクニックです。最も困難な部分は、小片で作業し、全体の無菌性を保ちます。説明が難しい操作の詳細はほとんどないので、視覚的なデモンストレーションは本当に役に立ちます。まず、12個の洗浄PDMSコンストラクトを無菌10センチメートルプレートに移すことから始めます。完全な滅菌を保証するために、プレートをUV光に5分間照射します。次に、各構成体を別々の35ミリメートルの細胞培養プレート、または6ウェルプレートに移して即時細胞播種を行います。細胞の播種を開始するには、まず、1x PBSの5ミリリットルで心臓ATPPCのコンフルエントT75フラスコを洗浄します。細胞を取り外すには、0.05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを加えます。そして、5分間摂氏37度でインキュベートします。その後、完全な培地を5ミリリットル加えてトリプシン-EDTAを不活性化する。15ミリリットルのチューブ内のすべての剥離細胞を収集します。残りの細胞を収集するためにPBSの5ミリリットルで細胞ガラスを2回洗浄し、15ミリリットルチューブに追加します。摂氏22度で5分間230gで遠心分離機。上清を取り除き、完全な培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターでそれらを数えます。PDMSを用いた各プレートに200マイクロリットルの心臓ATPCをシードし、翌日細胞で覆われた播種表面の約80%を得た。摂氏37度、5%CO2でインキュベートします。プレートごとに温め込んだ完全な媒体を2ミリリットル軽く加えます。37°C、一晩で5%CO2で構築物で細胞をインキュベート。この手順を開始する前に、電気機械刺激のための12の構造のうち6を割り当て、非刺激制御のために6を保つ。70%エタノールを使用して刺激ユニットを洗浄します。刺激装置、滅菌電極、ピンセットをフローキャビネットの内部に設置します。電極および構成物を容易に操作するために、各細胞培養板から培地の90%を取り除く。PDMSの構成体を磁石の方向に正しい位置に配置して、固定磁石と移動磁石の両方の磁気的な魅力を保証します。この2つのステップでは、プロセス全体にわたって無菌性を保ちながら、細胞の播種PDMS構成体と電極を操作することが最も重要です。次に、白金線を電極コネクタに接続します。PDMSコンストラクトの指定されたスペース内の電極のPTFE部分を向けます。各構成体に2.5ミリリットルの新鮮な、事前に温めた完全な媒体を加えます。すべてのPDMS構成体を配置し、プラットフォームに電気的に接続したら、プラットフォームを摂氏37度、および5%CO2インキュベーターに戻します。次に、電気と機械のソースを接続します。刺激プログラムを構成するには、電気刺激装置のユーザーインターフェースと、機械的刺激を制御するアプリケーションを通じて、電気および機械刺激のレジームを指定します。同期を設定するには、電気刺激装置のスイッチをオンにして、メインメニューがディスプレイに表示されるのを待ちます。次に、オプション 2 を選択し、シーケンスを編集し、Enter キーを押します。シーケンスメニューを編集するには、モードタブを使用して現在の「+」をクリックし、Enterキーを押して、期間 1000"をプラス/マイナスで選択し、Enterキーを押してトリガモードタブを選択し、外部を選択して[振幅]タブを押し、プラス/マイナスで1"を選択してEnterを押します。次に、メインメニューに戻り、オプション4を選択し、シーケンスを生成し、Enterキーを押します。その後、ON時間テキストコントロールに500"と書き込み、機械的パルス持続時間を設定します。最後に、エクスカーションテキストコントロールに2000"と書き込み、10%の伸びを実現します。セルメディアを週に2回変更し、まず古いメディアを取り外し、次にPDMSサポートの側面に温かみのある新鮮なメディアを追加します。7日目、実験の終わりに、原稿に記載されているサンプルを収集する。電気機械刺激心臓ATDPCは、心筋原性の可能性を高める。これは、心臓転写因子GATA-4、β-ミオシン重鎖の構造マーカー、およびカルシウム関連遺伝子Connexin43を特異的に早期および後期の心臓遺伝子の発現増加を示すリアルタイムPCRによって示された。アクチン繊維に対するファロイジン染色は、大部分の細胞が垂直パターンに従って整列することを示した。Connexin43分布は、主に細胞質中で、そして形質膜において、ギャップ接合を通して細胞内コミュニケーションに寄与した。MEF2およびGATA-4転写因子は、心臓ADPCsの核に位置していた。しかし、GATA-4は皮下ADPでは検出されなかった。細胞質マーカーSERCA2、および肉体α-アクチニンは、心筋細胞に典型的な成熟したサルコメア組織を示さなかった。そして、鼓動は対照的に観察されず、細胞集団を刺激した。このプロトコルの開始時に健康な細胞単層と手順全体で無菌性を維持することは非常に重要です。サンプル採取後、標準ゲノムタンパク質発現技術を行うことができる。この技術は、細胞の電気的および/または機械的刺激の効果をよりよく理解するのに役立ちます。最近まで、両方の刺激に同じデバイスを使用することは不可能だったので、結果を比較するのが難しくなりました。

simultaneous-electrical-mechanical-stimulation-to-enhance-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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