心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

この手順の全体的な目標は、定義された細胞組成の人間工学的な心臓組織を作成することです。この方法は、ばらつきや心臓の分化効率の制御、特定の細胞タイプが心収縮機能にどのように影響するかの理解など、心臓組織工学分野における主要な課題に対処できます。この技術の主な利点は、最終結果が制御され定義された組成の人間工学心臓組織であることです。

この技術の複製は、定義された組織が治療介入を評価できる新規で生物学的に関連性のある生物医学的なスクリーニングプラットフォームを提供できるため、心臓病の治療にまで及びます。この方法は、新しい心臓治療への洞察を提供することができますが、人間が操作した心臓組織システムは、心臓細胞治療のメカニズムを理解するためにも使用できます。ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞培養から始めて、細胞をPBSで1回洗浄し、0.04%トリプシン-EDTAを1ミリリットル加えます。

細胞を摂氏37度、CO2 5%で10分間インキュベートします。細胞がインキュベートされているときに、12マイクロリットルのROCK阻害剤を6ミリリットルのトリプシン中和溶液に加えます。インキュベーターからプレートを取り出し、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの中和溶液を加えます。

各ウェルのすべての細胞を1本の15ミリリットル遠心分離チューブに移します。6つのウェルすべてを3ミリリットルの容量のPBS1個で洗浄し、この洗浄液をチューブ内の細胞と組み合わせます。チューブをGの300倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

FACSによる生細胞選別用の細胞を調製するには、氷上の45ミリリットルのPBSに5ミリリットルのFBSと50マイクロリットルのROCK阻害剤を加えて染色バッファーを調製します。ペレット化した細胞から上清を取り除き、1.2ミリリットルの染色緩衝液に再懸濁します。浮遊した細胞の200マイクロリットルを、氷上の新しい予冷済み50ミリリットル遠心分離管に移します。

次に、残りの1ミリリットルの細胞懸濁液を氷上の新しい予冷済み50ミリリットル遠心分離管に移し、2マイクロリットルのSIRP α-PE/Cy7と4マイクロリットルのCD90-FITC抗体を追加します。細胞懸濁液をトランスファーピペットで穏やかに混合し、チューブを氷の上に置きます。ネガティブコントロールとサンプルを入れた2本の50ミリリットルチューブを、摂氏4度の氷上でロッカーシェーカーで1時間インキュベートします。

細胞をインキュベートしている間に、3ミリリットルの分化培地を2本の15ミリリットル遠心分離管にそれぞれ2本ずつ移します。次に、3マイクロリットルのROCK阻害剤を追加し、使用前にこれらのFACSコレクションチューブを氷上に保管します。次に、染色した細胞をGの300倍で4°Cで5分間ペレット

そして、10ミリリットルの氷冷PBSでそれらを2回洗います。サンプルペレットをDAPIを含む1〜3ミリリットルの染色緩衝液で穏やかに再懸濁します。DAPIを含まない500マイクロリットルの染色緩衝液をネガティブコントロールペレットに加えます。

両方の細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーでろ過して細胞塊を取り除き、氷上のポリスチレンFACSチューブに移します。すぐにサンプルをセルソーターに持って行きます。ネガティブ染色コントロールサンプルから始めて、ゲーティングパラメータを設定します。

次に、サンプルセルの実行中に、DAPI陰性生細胞集団を選択します。FITC陽性細胞集団とPE/Cy7陽性細胞集団の両方を20PSIで独立して収集します。テキストプロトコルに示されているように、細胞を培養および再凝集した後、細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、培地を50ミリリットルの遠心チューブに移します。

プレートを3ミリリットルのPBSで洗浄し、洗浄液を同じ50ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、3ミリリットルの0.04%トリプシン-EDTAをプレートに加え、摂氏37度と5%CO2でインキュベートします。5分後、顕微鏡を使用してプレートの細胞剥離を調べます。

すべての細胞が分離したら、プレートに3ミリリットルのトリプシン中和溶液を追加します。細胞を穏やかに混合し、元の50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。プレートを5ミリリットルのPBSで洗い、このウォッシュもチューブに加えます。

細胞をGの300倍で室温で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルの新生児ウシ血清またはNBS培地に再懸濁します。.次に、細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

細胞をGの300倍で室温で5分間ペレット化し、上清を除去します。6つの人工心臓組織の生成を開始するには、1モルの水酸化ナトリウム1.5マイクロリットル、10X PBSの9.6マイクロリットル、および滅菌超純水24.9マイクロリットルで、5ミリグラム/ミリリットルのコラーゲンストックの60.0マイクロリットルを1ミリリットルあたり3.125ミリグラムに希釈します。ここでは、気泡が粘性溶液から放出されるのが遅く、組織圧縮中の組織形成を妨げる可能性があるため、コラーゲン混合物への気泡の混入を避けることが重要です。

15ミリリットルのチューブの側面にピペットで移動し、10X MEMとpH 9の0.2ノーマルヒープをそれぞれ12.0マイクロリットル加え、コラーゲン混合物を希釈します。次に、基底膜マトリックスをコラーゲン混合物に最終濃度0.9ミリグラム/ミリリットルまで加え、穏やかに混合します。この最終的なティッシュミックスを氷上に保存します。

次に、組織混合物全体を細胞ペレットに移し、テキストプロトコルに示されているように補足細胞を添加します。チューブを最終容量150マイクロリットルまで無細胞NBS培地で満たし、穏やかに混合します。25マイクロリットルの細胞懸濁液をバイオリアクターベースプレートの6つのウェルのそれぞれに慎重にピペットで移します。

各ウェル間で混合手順を繰り返して、沈降した可能性のある細胞を再懸濁します。一度に1ウェルにつき1つの組織のみをピペットでピペットし、組織ごとに一貫した量と細胞数を確保します。これとは別に、2列のポリジメチルシロキサン(PDMS)を押し込み、センサーをポリスルホンフレームの両側に押し込み、6対のポストを形成します。

ベースプレート上部のフレームを反転させて、セル懸濁液を含む各ウェルに1対のポストが入るようにします。次に、バイオリアクターを60mmの皿に入れ、その皿をカバーせずに10cmの皿の中に置きます。10cmの皿に蓋をして、バイオリアクターアセンブリ全体を組織培養インキュベーターに移します。

2時間のインキュベーション後、バイオリアクターアセンブリを取り外し、ベースプレートを覆うために14ミリリットルのNBS培地を追加します。バイオリアクターを細胞培養インキュベーターに戻し、培地の半分を毎日交換します。48時間後、ベースプレートを一度に数ミリメートルずつゆっくりと取り外します。

次に、組織を下にしてバイオリアクターを培地に戻します。ベースプレートを取り外すときにティッシュがポストから落ちた場合は、ティッシュをポストにそっと取り付け直してください。ヒト胚性幹細胞の分化により、主に心筋細胞と線維芽細胞の混合培養が行われ、これらの細胞は自己組織化してクラスターを形成し、皿全体に強く鼓動するウェブを形成します。

これらの培養物のFACS選別により、この分化法により、少なくとも65%のSIRPアルファ陽性細胞と10%のCD90陽性細胞を含む集団が得られることが明らかになりました。ベースプレートを取り外した後、人工心臓組織(HECT)はバイオリアクター内で自己組織化されます。成熟した圧縮されたHECTは、平均5〜15マイクロニュートンの力で統合された力感知ポストを目に見えて偏向させます。

Twitch力の測定により、孤立した変数がこれらの定義された人工組織の収縮力をどのように変化させるかが明らかになります。ここでは、組織に10%のヒト間葉系幹細胞を補充すると、1ヘルツと2ヘルツの両方のペーシング周波数で収縮力の大幅な増強が観察されます。習得すると、分化には約20日、細胞の選別には約5時間、組織の構築には約3時間かかります。

建設後、適切な組織形成にはさらに7日かかります。この手順に続いて、特定の細胞間相互作用の影響に関する追加の疑問に答えるため、または細胞療法のメカニズムを決定するために、細胞標識および組織混合物の補充を含む他の方法を実施することができる。このビデオを見れば、既知で制御された細胞組成を持つ人間が操作した心臓組織を作成する方法を十分に理解できるはずです。