Name: 反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 学ぶ 3D細胞培養の初期形状制御法。ハイブリッドゲルキューブデバイスを用いて反復可能なパターン形成を実現し、多方向イメージングで組織発生を観察します。特殊装置不要で実験の再現性を向上させます。

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この作品は、日本学術振興会科研費 (18 H 04765) とテニュア ・ トラック制度の普及、文部科学省、日本プログラムによって支えられた財政的に。

1. ハイブリッド ゲル キューブ デバイスの作製
<ol><li>ポリカーボネート (PC) 立方体フレーム加工や 3 D プリンターを使用していずれかを準備します。PC フレームのサイズは、サンプル サイズに依存します。本研究では、枝が培養中に延長する十分なスペースを持っていたようにそれぞれの側に 5 mm のフレームを使用しました。</li>
	<li>予冷のガラス スライドまたはアイス ボックスで別の滑らかな表面に PC フレームを配置 (< 0 の ° C) (図 1 a)。</li>
	<li>ピペットと底面に四角い枠の上面から事前に加熱された 1.5% の agarose (w/v) の 12 μ L を追加します。Agarose 広がる平らな面 (図 1 b) を作成するのには、ピペットをストロークします。</li>
	<li>分以内に、agarose が治ります。ピンセットを使用してスライド ガラスの端にスライドさせて、PC フレームをピックアップします。Agarose とガラス スライド (図 1) との間の付着力により立方体のフレームから寒天を取り外すときに垂直方向にスライド ガラスからフレームを拾う可能性があることに注意してください。</li>
	<li>開いて顔を作る、その後再びガラス スライド (図 1) の立方体フレームを回転させます。</li>
	<li>手順 1.3-1.5 を繰り返して 3 つのサーフェスは、アガロース (図 1E) で満ちています。</li>
	<li>4 番目と 5 番目の顔に agarose 壁を形成するには、オープンフェイス (図 1 階) から agarose をドロップします。5 の顔作成されたアガロース壁は、HGC の準備は完了です。</li>
</ol>2. フォトリソグラフィ法や加工法による micromolds の作製
<ol><li>フォトリソグラフィによる作製<ol>
<li>きれいなアセトン、イソプロピル アルコール (IPA) と超音波洗浄によるシリコンウェハ (Si) では、その 5 分 (DI) が、蒸留水。窒素窒素 Si ウエハを吹いて後、20 分 (図 2 a(i)) の 140 ° C のオーブンで脱水します。</li>
		<li>ロアやアリゾナ州など犠牲層 Si 基板上レジスト スピン コート (2,000 rpm, 30 s) 黄色の光の下でスピンコーターを使用しています。スピン コーティング後すぐに 3 分 (図 2 a(ii)) 90 ° C のホット プレートにウェハを加熱します。犠牲層の所望の厚さ、リフトオフ プロセスは簡単に実施することができますが、正確な厚みは必要ありません、以上 1 μ m であります。</li>
		<li>70 ° C のホット プレートにウェハを置き、ハンド ローラー (図 2 a(iii)) を使用して犠牲層を所望の厚さの厚いネガ型フォトレジスト シートを積層</li>
		<li>ラミネート後の 5 分は、紫外線暴露のマスクアにウェハを配置します。シート抵抗の所望のパターンとフォトマスクを設定し、適切な時間のために紫外光を用いた公開します。露光時間はレジストの厚さと紫外線の強度によって決定されます。その後、60 ° C、5 分、10 分 (図 2 a(iv)) 90 ° C で焼成の順で露光後ベーク用ホット プレート上のウェハを配置します。</li>
		<li>非公開エリア (約 20 分) を完全に溶解するまで、プロピレングリコールモノメチル エーテル アセテート (PGMEA) 内のウェハを浸すことによってネガ型フォトレジストを開発 (図 2 a(v))。</li>
		<li>超音波洗浄の微細構造から持ち上げて IPA を使用して犠牲層を溶解します。ウェハから微細構造を剥がして、一度 10 分 (図 2 a(vi)) には超音波洗浄で DI 水ですすぎます。</li>
		<li>30 分間室温 (約 20 ° C) に完全に乾くの MPC ポリマーの 30 μ L で金型を浸します。図 2 bは、製作されたプリズム金型を示しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>円筒金型の作製<ol>
<li>加工プロセスによって希望のサイズと鋼製円筒金型を作製します。また、市販のステンレス鋼を使用します。(本研究では、φ 600 μ m シリンダーは使用される)。</li>
		<li>30 分間室温 (約 20 ° C) に完全に乾くの MPC ポリマーの 30 μ L のシリンダー鋼を浸します。</li>
		<li>ベース樹脂とその触媒を混合することによって液体ポリジメチルシロキサン (PDMS) を準備 (材料表参照) 後 20 分間システムを脱気真空脱ガスに 10:1 の比率で。その後、12 ウェル プレートで、PDMS を注ぐ。</li>
		<li>鋼製円筒データム平面に垂直になるようにとセット固定線形 z 段 z ステージを移動することによって同じデータム サーフェス上に配置 12 ウェル プレートで未硬化の PDMS 表面に垂直に挿入できます。硬化のための 90 ° C で 20 分間オーブンでシリンダー鋼を PDMS を孵化させなさい。次のプロセス (図 2) で、ピペットを挿入できるように、側面サーフェスを形成する PDMS をカットします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ハイドロゲルの初期細胞クラスター形状の制御
<ol><li>文化の領域 (図 3 a) に HGC にコラーゲンと人工基底膜など、必要な細胞培養のための適切な ECM を挿入します。</li>
	<li>設定捏造マイクロモールド HGC の直接または間接的適切なホルダー付き図 3Bに示すように。その後、それを硬化の 37 ° C で 25 分の CO2インキュベーターに HGC を配置します。</li>
	<li>ECM (図 3) を劣化しないように、慎重に、マイクロモールドを取り出します。ポケットの ECM ので必要な金型形状としてが作製されます。</li>
	<li>トリプシン-EDTA や細胞の種類によって等価で培養皿から細胞を採取します。その後、高濃度の細胞を取得する細胞を遠心分離機 (NHBE 文化の 0.25% トリプシン-EDTA を適用 3 分のセルをインキュベートし、FBS を含む中、4 分の 300 × gで遠心分離の効果を中和するため)。</li>
	<li>遠心分離後、細胞を凝縮して上清培地を取り除き、高濃度細胞 (3.0 × 104細胞/μ L NHBE 細胞) を注入 (図 3 D) の ECM のポケット。</li>
	<li>セルは、micromolds によって作成されたスペースを埋めるための ECM ポケットに落ちるように、37 ° C で 20 分のための CO2インキュベーター内のセルに HGC を孵化させなさい。過剰な媒体または細胞が表面に存在する場合は、ピペットを使用して慎重に取り外します。</li>
	<li>24 ウェル プレートに HGC を配置し、適切な媒体 (図 3E) の 100 μ L を追加します。NHBE 細胞 NHBE と血管内皮細胞 (材料の表を参照) を市販の専門媒体の 1:1 の混合物を使用します。</li>
	<li>ECM でポケットを閉じるし、25 分の 37 ° C で、孵化させなさい他の ECM を注入します。</li>
	<li>室温 (約 20 ° C) に予熱した 1.5% の agarose を冷やします。ECM が養殖とイメージング (図 3 f) の間に HGC から落下するを防止し表面を閉じて HGC の上面に agarose の約 10 μ L をドロップします。その後、37 ° C で別の 20 分間 agarose を治すための HGC を孵化させなさい。</li>
	<li>浸透圧は、HGC の中の細胞に栄養を提供することで助けることができるので、全体の HGC をカバーする媒体を追加します。</li>
</ol>4. 多方向画像
<ol><li>多方向観察による非侵襲的 3次元形状認識<ol>
<li>培養皿または顕微鏡の HGC を含むウェル プレートを配置し、カメラのフレームに HGC を方向づけます。その後、明るいフィールドまたは位相コントラストによるサンプル画像を取得します。</li>
		<li>ピックアップし、別の面を下に置くに HGC を回転させます。</li>
		<li>4.1.1 と 4.1.2 の手順を繰り返して、すべての六つの側面からの画像が得られます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>多方向観察による免疫蛍光イメージング<ol>
<li>固定のため PBS の 10 分間のリンス 2 つ続いて、20 分間のサンプルに HGC 室温 (約 20 ° C) の上の 4% パラホルムアルデヒドを適用しています。</li>
		<li>PBS の HGC を permeabilize 0.5% を含む 4 ° C で 10 分間のトリトン X-100 PBS で 10 分の 3 x を洗います。</li>
		<li>場合バッファーで 10% ヤギ血清 HGC を孵化させなさい (0.2% トリトン X-100、0.1% ウシ血清アルブミン、0.05 %pbs でトゥイーン 20) 主なブロッキングのため室温で 60 分。</li>
		<li>特定の分子の染色、適切な抗体を使用します。集合的なセル形状を観察するには、Alexa Fluor 488 ファロイジンをアクチンを染色する使用できます。</li>
		<li>レーザーや蛍光顕微鏡でガラス底皿の上 HGC を置き、サンプル全体の画像を得るための六つの側からスキャンを実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
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<li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li>
</ol>

著者、大阪府立大学、九州工業大学はハイブリッド ゲル キューブ デバイス、日本医療や化学計測器 (株) の特許出願を提出した、日本は最近、キューブを製品化しました。当社は、デザイン、プロセス、および説明する方法のいずれかを影響しませんでした。

本稿で紹介した方法は簡単、ハイテク機器なく実行できます。同時に、ハイドロゲルの 3 D 空間で正確なセル クラスター形状制御結果が得られます。最初のコントロールの後、皿に培養すると、同じくらい、HGC の細胞が伸長できます。多方向の画像が、顕微鏡を用いた HGC とサンプルを回転させることにより実行され、画像の品質が向上します。彼らは生体適合性がある限り、HGC フレームとマイクロモールド用材料の選択は柔軟です。3 D プリンターは、3 D プリンターの精度が彼らのアプリケーションのために十分である場合、HGC フレームやマイクロモールドを生成する使用ことがあります。提案手法は透明性試薬20,21光シート顕微鏡システムなどの技術を向上させる多くのイメージと互換性が。これらの技術を採用し、画像の品質を向上できます。
アガロース、ECM、および高密度細胞に注入する量は、HGC と金型のサイズによって異なります。空気の泡を注入しない慎重な手動操作が必要で、はじける泡が制御...

二次元文化よりもよりよい生物的環境を模倣する 3 D 文化の重要性は、細胞・組織培養1,2,3でかなり強調されます。細胞と細胞外マトリックス (ECM) との間の相互作用は、形態形成4,5について重要な手がかりを提供します。多くの組織の形成は、折りたたみプロセス6、7、陥入8、管状形成9,10などの 3 D 環境の下でだけ現れることができます。ただし、多くの困難は、皿の上実験 2 D から 3 D の実験へと移行研究者を防ぐ。3 D の実験で主な困難の 1 つは、画像の 3 D サンプルの問題です。平面実験と比較して、適切な 3 D 画像の取得はまだ多くの場合困難です。特に、サンプル サイズ低倍率レンズの大きな焦点深度によりミリ波領域に達すると困難な作業は、適切な 3 D 画像を得るします。たとえば、焦点深度は、倍率 × 10 を使用すると、単一のセルのサイズが通常よりも少ない 10 μ m 以上 50 μ m を達する。画像品質を高めるためには、ハイテク顕微鏡システムが開発されている (例えば、2 光子励起顕微鏡11と光シート顕微鏡システム12)、彼らはその高価な価格により限られてが。代わりに、我々 はこれまでハイブリッド ゲル キューブ (HGC) デバイス13をした.デバイスは、ゲルの 2 種類で構成されています: サポート ゲル、コラーゲンなど ECM または文化ゲルとしてマトリゲル agarose。HGC 培養中にサンプルを収集し、アドレスを焦点深度の問題14多方向画像を達成するためにキューブを回転させることができます。
3 D の実験のもう一つの難しさは、3 D 環境の悪い制御により、低再現性です。プラスチックの皿に平面文化とは異なり、初期培養条件の変化は簡単に柔らかい素材で囲まれた 3 D 空間で発生します。実験結果では有意な変化は、次の分析を劣化し、基になるメカニズムをマスクします。空間的バイオプリンティング15,16、17、および足場18、織物繊維などの単一のセルを配置する多くの工学技術が開発されているが、複雑な前処理が必要か具体的には設計された機器。対照的に、HGC19の 3 D セルの配置を達成するための方法論を開発しました。
このプロトコルでは、一般的に使用される装備、HGC の 3 D の初期細胞クラスターの形を制御するための簡単な手順を示します。まず、HGC の作製プロセスを示した。その後、フォトリソグラフィ法や加工法により作製した micromolds は、ECM の任意形状のポケットを生成する HGC に置かれました。その後、遠心分離後の高密度の細胞は、HGC の初期細胞クラスター形状を制御するポケットに注入しました。正確に制御された細胞のクラスターは、HGC のため多くの方向から描出できた。正常ひと気管支上皮 (NHBE) 細胞は、画像品質を高めるための複数方向から初期細胞クラスター形状の制御と枝の画像を示すため使用されました。

<table><tbody><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-メトキシ-1-メチルエチルアセテート</td><td>富士フイルム和光純薬(株)</td><td>130-10505</td><td>PGMEA、CAS:108-65-6&nbsp;</td></tr><tr><td>4%パラホルムアルデヒド</td><td>富士フイルム和光純薬(株)</td><td>161-20141</td><td>CAS:30525-89-4</td></tr><tr><td>アガロース、低ゲル化温度&nbsp;BioReagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ファロイジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>AZ1512</td><td>メルク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BEGM 弾丸キット</td><td>ロンザ</td><td>CC-3170</td><td>NHBE細胞専用培地</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン溶液 (10%)</td> <td>シグマアルドリッチ</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 弾丸キット</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td>内皮細胞専用培地</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF co.</td><td></td><td>MPCポリマー</td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子低減基底膜マトリックス</td><td>Corning&nbsp; Inc.</td><td>354230</td><td></td></tr>正常な<tr><td>ヤギ血清(10%)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>正常なヒト気管支上皮細胞</td><td>ロンザ</td><td>CC-2541</td><td></td></tr>シル<tr><td>ポット184 W / C</td><td>ダウコーニング株式会社</td><td>3255981</td> PDMS SUEX D300 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>DJ MicroLaminates, Inc</td> 用ベース樹脂・触媒 <td>厚ネガ型フォトレジスト(厚さ300mm)</td></tr><tr><td>トリトン X-100 (1%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 d 細胞クラスター制御

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

3 D 培養の重要性は、細胞培養でかなり強調されます。ただし、実験の再現性の欠如は、その制限の 1 つです。自己組織化メカニズムの解析を低下パターン形成のいくつかの反復可能な結果を生成します。セル密度と細胞外マトリックス (ECM) の分布などの初期培養条件の変化を減らすことは、3次元培養の再現性を強化することが重要です。この記事では、再現性の高いパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するためのシンプルだが強力な手順を示しています。所望の形状とマイクロモールドは、フォトリソグラフィ法や加工法を使用して作製した、ハイブリッド ゲル キューブ (HGC) に含まれる ECM で 3 D ポケットが形成されました。高濃度細胞は、細胞クラスター形状試作金型の形状と一致するよう、ポケットに注入されました。採用の HGC 許可でも、低倍率のレンズを使用した高解像度イメージングと全体の組織構造のキャプチャを有効にその回転走査型多方向。正常ひと気管支上皮細胞は、方法論を示すため使用されました。

正常ひと気管支上皮 (NHBE) 細胞は、図解の方法論を示し、円筒形と ECM 環境でそれぞれのプリズム形状を達成するために初期集団細胞ジオメトリをコントロールに使用されました。ファロイジン染色シリンダー形状 (図 4 a, B) とプリズムの形状 (図 4、D) のと同様、段階の対照によって多方向撮像結果が掲載されています。セルは適当に ECM 環境で必要な 3次元形状を生成するために配置されます。その後、細胞は特定の形状を形成する 4 日間の培養し、多方向のイメージングを行った.大規模なサンプル サイズはそれに非常に困難 1 つの方向から全体の組織のイメージをキャプチャするにはただし、HGC は、全体組織形状を明らかに最大六つの側面からのイメージ投射を可能しました。NHBE 細胞から成長した気管支樹の染色結果を図 5に示しま...

反復可能なパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するための手順を紹介します。組織パターン形成のための多方向の画像を達成するために 2 つの異なるゲルを含む立方デバイスを採用します。

反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

このプロトコルは、特別な装置を使用せずに3D細胞培養モデルの信頼性を高める簡単な方法を使用します。この技術の主な利点は、立方体装置内の初期培養条件を制御することによって、再現可能な3D培養実験を行うことができる点である。5ミリメートルポリカーボネート立方体フレームを準備した後、事前に冷却されたスライドとアイスボックスにフレームを置き、ピペットを使用して、立方体フレームの上面から下面に予熱された1.5%アガロースの12マイクロリットルを追加します。アガロースを広げて平らな表面を得て、ポリマーを治癒させます。ピンセットを使用してフレームをガラスの端までスライドさせ、開いた側がスライドに戻す前にフレームを下向きにするようにフレームを回転させます。フレームの次の2つの表面をより多くのアガロースで満たした後、ちょうど示したように、アガロースを開いた面から容器に落とし、第4および第5の側面にアガロース壁を形成する。初期細胞クラスター形状を設定するには、目的とする細胞培養用の適切な細胞外マトリックスをハイブリッドゲルキューブ培養空間に注入し、作製したマイクロモールドをキューブにセットする。その後、立方体を摂氏37度で25分間二酸化炭素インキュベーターに入れます。細胞外マトリックスが硬化したら、マトリックスが劣化しないように慎重にマイクロモールドを持ち上げます。所望の型状のポケットは、細胞外マトリックスで製造される。細胞を濃縮するには、適切な実験細胞培養培地で遠心分離後の実験細胞懸濁液を濃縮し、細胞外マトリックス内のポケットに細胞を注入する。立方体を37°Cで20分間二酸化炭素インキュベーターに入れ、細胞が細胞外マトリックスポケットに落ちるようにし、マイクロモールドによって作成されたスペースを満たします。インキュベーションの終わりに、24ウェルプレートの1つのウェルに立方体を置き、適切な細胞培養培地の100マイクロリットルをウェルに加えます。追加の細胞外マトリックスを注入してポケットを閉じ、キューブをインキュベーターに25分間戻します。細胞外マトリックスが硬化すると、20°Cのアガロースの約10マイクロリットルを立方体に上面に落とし、表面を閉じ、37°Cで10〜20分間滴を硬化させた。その後、キューブ内の細胞への栄養の移動を促進するための浸透圧を促進するために、新鮮な媒体で立方体全体をカバーします。多方向観察による非侵襲的な3D形状認識のために、プレートを顕微鏡ステージに配置し、明視野または位相コントラスト顕微鏡で立方体の各辺の画像を取得し、ピンセットを使用して、キャプチャ間で画像化されるキューブサービスを回転させます。多方向観察による免疫蛍光イメージングの場合、まずキューブを含むウェルから上澄み物を吸引し、室温で20分間4%パラホルムアルデヒドで立方体を固定する。固定の終わりに、1回の洗浄につき10分間PBSでキューブを2回洗います。0.5%トリトンx-100で立方体を非浸透させ、摂氏4度で10分間PBSを行います。次に、室温で60分間、ヤギ血清および免疫蛍光バッファーとの非特異的結合を遮断する前に、1回の洗浄につき10分間、PBSで立方体を3回洗浄します。次に、標準的な抗体染色プロトコルに従って目的の適切な一次抗体で細胞を染色します。次に、ちょうど実証したように、レーザーまたは蛍光顕微鏡上の立方体の6つの側面すべてを画像化します。この代表的な実験では、ハイブリッドゲルキューブの多方向イメージングにおいて、通常のヒト気管支上皮細胞で培養し、培養物の位相コントラストおよび免疫蛍光イメージングによる初期円筒形またはプリズム形細胞培養の生成を示す。ここで、ハイブリッドゲルキューブにおいて、まずは通常のヒト上皮細胞の免疫染色が円筒形に制御され、気管支樹の生成後に示される。多次元イメージングによって明らかにされるように、枝は円筒軸に対して垂直を示す。細胞の密度が低いとインキュベーション後にその細胞の品質が低下する可能性があるため、細胞外マトリックスポケットに高密度の細胞を注入することが重要です。この方法パターンは、多方向イメージングによる定量的測定による3D細胞パターンの再現性形成を行い、皿の発達のメカニズムを研究する。

initial-3d-cell-cluster-control-hybrid-gel-cube-device-for-repeatable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。...

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

組織工学用セルの配置を調整する同心円状細胞を含んだハイドロゲルの非連続的なグラデーション静的系統を提供する単純なアプローチを紹介します。...

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

私たちは、三次元細胞培養アプリケーションのための合成ハイドロゲルマトリックスの光媒介形成とその後の生化学的パターニングの連続的なプロセスについて説明します。細胞適合性フォトクリックケミストリーによるハイドロゲルの構築と修飾が実証されています。さらに、これらのハイドロゲル内のパターンを定量化および観察し、細胞生存率を決定するための容易な技術が紹介されています。...

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。...

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

ここでは、DNAプログラム付着を用いた単細胞分解能でマイクロパターン細胞に対するプロトコルを提示する。このプロトコルは、ベンチトップフォトリソグラフィプラットフォームを使用して、ガラススライド上にDNAオリゴヌクレオチドのパターンを作成し、市販の相補オリゴヌクレオチドを有する細胞膜にラベルを付けます。オリゴのハイブリダイゼーションは、プログラムされた細胞接着をもたらす。...

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。...

ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能

三次元細胞培養基材のUVフォトパターニングによるマルチキュー細胞微小環境の生成

細胞スフェロイドは、生物学的応用の分野における1つの潜在的なモデルと見なされてきました。本稿では、均一な細胞スフェロイドを頑健かつ迅速に作製するための効率的な方法を提供する3D音響アセンブリデバイスを使用して細胞スフェロイドをスケーラブルに生成するためのプロトコルについて説明します。...

細胞スフェロイドの量産のための3次元音響組立装置

ここでは、粒状ハイドロゲルの界面内および界面への3D細胞遊走を定量的に評価するためのプロトコールを紹介します。...

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

学ぶ 3D細胞培養の初期形状制御法。ハイブリッドゲルキューブデバイスを用いて反復可能なパターン形成を実現し、多方向イメージングで組織発生を観察します。特殊装置不要で実験の再現性を向上させます。

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