胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリングインビボとインビトロアッセイ
2015年6月9日
この記事では、胸腺沈降前駆細胞を特徴づけるためのin vivoおよびin vitroの方法論について、そのT細胞子孫の世代数、表現型、および数の動態を分析することによって説明しています。
この手順の全体的な目標は、E 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞によって産生されるT細胞の生成と数の表現型動態を分析することです。これは、最初にE 13、E 14、およびE 18マウス胚から胸腺葉を単離することによって達成されます。第2ステップでは、E 14胸腺葉に照射し、次いでフローソーティングされたE 13またはE 18細胞を吊り下げ滴中で48時間コロニー形成する。
最終ステップでは、コロニー形成された葉を成体CD3ノックアウトマウスの腎臓嚢の下に移植します。最終的に、フローサイトメトリーを使用して、キメラ動物の血液中のE 13およびE 18胸腺沈降前駆子孫の存在を評価することができます。この技術の主な利点は、既存の方法の主な利点は、ineso細胞上のin vitro T細胞培養のように、この技術は、3次元アッセイで定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟を可能にする方法と、無傷のレシピエントマウスでの胸腺臓器臓器培養の移植を可能にする方法を組み合わせることで、胸腺slic前駆細胞と子孫の分化と機能を評価できることです。
げっ歯類の外科手術の専門知識を持つ研究エンジニアとして、私は層流フードでの移植実験の2日前に、70%エタノールで妊娠中の雌マウスの腹部を正中線で皮膚に縦方向に切開し、皮膚を引き離して切開を開き、鉗子とハサミを使用して消化管に触れずに腹膜を開きます。次に、二分子宮を引き出し、ハサミを使って膣から分離します。次に、40〜50ミリリットルのDPBSを含む90 x 15ミリメートルのペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜間を横方向に切断します。
細い先端のはさみと細かい鉗子を使用して、胎盤と卵黄嚢の間を切っている子宮の筋肉膜を取り除き、各胚を取り出します。次に、胚を保持している羊水を取り除き、HBSSと1%FCSを含む新しいシャーレに胚を置きます。胸腺を分離するには、双眼拡大レンズの下で胚を一度に1つずつ仰臥位に置きます。
次に、胸骨の軟骨に沿って縦方向に1本の鉗子を挿入し、湾曲した鉗子を使用して胸部グリッドをつまんで開きます。胸壁を脇に引っ張って、気管の両側にある胸腺葉を視覚化します。次に、細い鉗子で胸腺の下をつまんで、各葉を慎重に取り除き、1ミリリットルのHBSSと1%FCSを含むペトリ皿に入れます。
次に、2つの細い鉗子を使用して、葉を傷つけずに周囲の結合組織を取り除きます。その後、3ミリリットルのHBSSと1%FCSで葉を洗浄し、赤血球を除去して胎児胸腺臓器培養を開始します。E 14胸腺葉は、ちょうど示したようにCD 45.2胚から単離されました。
ローブを約3時間休ませます。次に、選別したばかりのE 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞をスピンダウンします。ペレットを培地中に再懸濁し、培地35マイクロリットルあたり500細胞の最終濃度まで
。次に、60ウェルの寺崎プレートの他のすべてのウェルに35マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下し、各滴の表面に照射ローブを1つずつプレートします。プレートを閉じて逆さまにして、細胞が重力によって液滴の頂端極に到達するようにし、逆プレートの上側を静かに打って、ローブを液滴の頂端端までスライドさせます。次に、逆プレートを加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベー
トします。胸腺葉がコロニー形成された後、反射反応の欠如によってレシピエント動物の麻酔レベルを確認します。次に、各目に目の軟膏を一滴垂らし、マウスを層流フードの下の右側に置きます。次に、後肢の関節のすぐ上の手術領域を剃ります。
次に、滅菌手袋を着用し、70%エタノールと10%IOD DY DER溶液で手術野を滅菌します。メスを使用して皮膚組織を1.5センチメートル切開し、続いて筋肉組織を切開します。次に、切開部の両側にわずかな圧力をかけて、腎臓を腹腔から押し出し、生理食塩水で腎臓を湿らせます。
後腹膜腔の外側に綿棒で腎臓を維持し、2つの細い鉗子を使用してカプセルに2〜3ミリメートルの穴を開けます。次に、カプセルの壁を開いたまま、腎臓極の端に向かって最大6つの胸腺葉移植片を慎重にスライドさせ、腎臓を後腹膜腔に戻します。筋肉を縫合し、神経症を縫合し、続いて個々の外科医の結び目で皮膚を縫合します。
次に、創傷を10%ヨウ化物ポビドン溶液で濡らし、マウスを摂氏37度の加熱パッドに置き、動物と外科的創傷の両方が完全に回復するまで監視して、コロニー形成前駆細胞の発達のための内因性胸腺細胞を枯渇させるための最良の方法を決定します。この実験では、放射線療法または5日間のデオキシギン治療後のコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルを比較しました。培養9日目にはコロニー形成リンパ球の数に差は見られませんでしたが、照射された葉には12日目にデオキシギンで処理されたものよりも多くのT細胞が含まれていたため、照射は胸腺コロニー形成後のT細胞の発達を促進するための好ましい治療法となり、ここでE13およびE18胸腺沈降前駆細胞の発生可能性を研究しています。 E 14を照射した胸腺葉は、観察されたように同数の2種類の前駆細胞でコロニーを形成し、E 13胸腺沈降前駆細胞は、E 18胸腺沈降前駆細胞よりも少ない胸腺細胞および二重陽性T細胞を生じさせた。
しかし、成熟したCD 3陽性細胞の頻度は増加し、樹状突起上皮T細胞の産生は、E 13胸腺沈降前駆細胞の子孫でのみ検出され、E 13およびE 18胸腺沈降前駆細胞のin vivo電位を分析しました。予想通り、今示した通りです。E 13胸腺沈降前駆細胞は、E 18前駆細胞よりも早くT細胞を生じさせましたが、循環T細胞の数はE 13胸腺沈降前駆体がコロニー形成動物全体で有意に少なかった後、この技術は、発生免疫学の分野の研究者がT細胞サブセットの特性を探求する道を開きました。 そのうちのいくつかは、哺乳類モデルにおける厳密な胚起源です。
このビデオを見た後、Timexの定住する先駆者とその子孫の微分的で機能的な経路を自然環境や競争条件で追跡する方法についてよく理解しているはずです。
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概要
この記事では、生体内および生体外技術を通じて胸腺定着前駆細胞とそのT細胞子孫を分析する方法論について説明しています。この研究は、これらの前駆細胞から生成されるT細胞の生成、表現型、および数量の動態に焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 胸腺定着前駆細胞はT細胞の発生において重要な役割を果たしています。
- それらの動態と分化を理解することは免疫学研究にとって不可欠です。
- この研究は、これらの前駆細胞を探索するためにマウス胚を使用しています。
- 既存の方法は、定義された前駆細胞からT細胞を完全に成熟させる能力が不足していることがよくあります。
研究目的
- 胸腺定着前駆細胞を特徴付けること。
- それらのT細胞子孫の生成と表現型を分析すること。
- 既存の生体外T細胞培養法を改善すること。
使用した方法
- E 13、E 14、およびE 18マウス胚からの胸腺葉の分離。
- E 14胸腺葉の放射線照射と、フローソートされたE 13またはE 18細胞によるコロニー化。
- コロニー化された葉の成体CD三ノックアウトマウスの腎被膜下への移植。
- キメラ動物の血液におけるT細胞子孫の存在を評価するためのフローサイトメトリー。
主な結果
- この方法論により、定義された前駆細胞からT細胞の完全な成熟が可能になります。
- 胸腺前駆細胞の分化と機能の評価に成功しました。
- キメラマウスにおけるE 13およびE 18子孫の存在を実証しました。
- T細胞発生のダイナミクスの理解を深めました。
結論
- この技術は、T細胞の成熟を研究する新しいアプローチを提供します。
- 包括的な分析のために生体外および生体内方法論を橋渡しします。
- この研究成果は、胸腺前駆細胞生物学の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding thymic progenitor kinetics enables predictive modeling of T-cell reconstitution in lymphopenic settings, informing cell therapy design. The method bridges in vitro progenitor assessment with in vivo functional validation, reducing mechanistic ambiguity in early immunotherapeutic target validation. This supports de-risking of hematopoietic stem cell and progenitor-based strategies by clarifying developmental timelines and subset-specific output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of progenitor-intrinsic differentiation potential by isolating E13 and E18 thymic settling progenitors to assess autonomous T-cell lineage commitment.
- Operational Value: Uses CD45 allotypic markers to distinguish progenitor inputs without genetic manipulation, preserving native phenotype for accurate functional comparison.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The hanging drop colonization assay provides a standardized, reproducible 3D microenvironment to quantify progenitor engraftment and early thymic seeding efficiency.
- Operational Value: Allows side-by-side comparison of progenitor batches under identical stromal conditions, minimizing niche variability and improving assay consistency across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of mature T-cell output in vivo via grafting into immunodeficient hosts, revealing delayed but expanded E18-derived peripheral T-cell reconstitution not seen in short-term cultures.
- Operational Value: Supports assessment of durable immune reconstitution, a key predictor for long-term efficacy in T-cell replacement therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This method situates progenitor characterization between early discovery (phenotypic screening) and preclinical validation, linking in vitro colony-forming potential to in vivo immune reconstitution metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing progenitor subsets for intrinsic differentiation kinetics and subset bias, such as dendritic epithelial T-cell generation.
- Screening: Delivers quantitative engraftment and early colonization metrics under controlled stromal conditions, enabling progenitor batch comparability.
- Analytics: Employs flow cytometry to measure progeny phenotype, frequency, and temporal dynamics in blood and grafts, providing multiparametric readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Connects progenitor input to functional T-cell output in vivo, enabling prediction of peripheral immune reconstitution kinetics and tissue colonization potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating hematopoietic or lymphoid progenitors across disease models, provided thymic stromal support and immunocompromised recipients are available.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking progenitor phenotype to defined T-cell outputs, including subset-specific maturation like dendritic epithelial T cells.
- Operational Value: Standardizes progenitor assessment via irradiation-conditioned thymic lobes and hanging drop colonization, improving inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in progenitor-based therapies by predicting both speed and magnitude of T-cell reconstitution.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of progenitor sources based on developmental tempo and long-term output potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection, thymic lobe isolation, and sterile surgical grafting under kidney capsule.
- Dependent on access to irradiated fetal thymic lobes, flow cytometry for progenitor sorting, and immunocompromised recipient strains (e.g., CD3−/−).
- Necessitates standardized hanging drop incubation conditions (37°C, 5% CO2, 48h) to ensure consistent progenitor-thymic lobe interaction.
- Requires validation of graft survival and lymphocyte egress to accurately assess peripheral T-cell reconstitution over time.
- Limited to murine systems; extrapolation to human progenitors requires cross-species thymic stromal compatibility testing.
