Name: 胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリングインビボとインビトロアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶマウス胚の胸腺前駆細胞を用いたインビボ・インビトロアッセイによるT細胞発生動態解析。この手法は定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟を可能にし、免疫学研究に貢献する。

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パスツール研究所、INSERM、アジャンス国立デRECHERCHE ANR（グラント「リンパ球」）、REVIVE今後の投資計画と「contreルがんラ·リーグ」でサポートされています。

倫理文：すべての実験は、パスツール研究所の倫理憲章に従って行わフランス農業省によって承認され、EUのガイドラインに。農業のフランスの省によって認定小齧歯類手術の訓練を受けたマニピュレータは、すべての外科的処置を行います。 注：5段階の計画手順を示す附属書表1に参照してください。 胚の1選択<ol><li> 36 C57BL / 6 CD45.2の女性、12人の女性のCD45.1、12 C57BL / 6 CD45.1の男性と12 C57BL / 6 CD45.2の男性を使用してください。いずれかの男性の遺伝子型と雌を交配すると、胚CD45.1 / 2およびCD45.1を生成する受信者の胸腺葉のソースとして使用TSPまたはCD45.2のソースとして使用。ハウス個別にすべての男性。 </li><li> E18 TSP分離のための胚を得るために、21日グラフト実験の前に、午後6時に1人の男性CD45.1とケージに2人の女性を配置します。正午前に、次の日の膣栓の存在を確認してください。 SEPA差し込ま女性を評価します。 </li><li> TSPによって植民地化されるE14胚を得るために、17日グラフト実験の前に、男性のCD45.2を使用して、（1.2）には、上記の手順を繰り返します。 </li><li> E13 TSPを単離するための胚を得るために、16日間のグラフト化実験の前に、雄C57BL / 6 CD45.1を使用して、（1.2）上記の手順を繰り返します。 </li></ol>水平層流フードの下で胚の2解剖注：グラフト実験前二日。 <ol><li>飽和密室で、少なくとも5分の間に頸部脱臼によりまたはCO 2ガスの漸進的な投与によって妊娠した雌を生け贄に捧げます。心肺運動の決定的な逮捕によって死を確認してください。 70％エタノールで腹部を濡らします。 </li><li>正中腹部の皮膚に縦切開を行い、離れて、皮膚を​​引っ張ってそれを開きます。消化管に触れることなく鉗子とハサミで腹膜を開きます。ビフィズスのuterを引き出し私たちとハサミで膣から分離。 </li><li> 40〜50ミリリットルのDPBSを含む90×15ミリメートルペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜の間に横方向に切断しました。 </li><li>先端の細いハサミや微細な鉗子で、子宮の筋肉膜を除去胎盤および卵黄嚢との間で切断して胚を取り出して、胚を保持さamniosを、削除してください。 </li><li>ペトリ皿に胚を置きHBSS + 1％ウシ胎児血清を含む90×15ミリ（FCS）。 E15よりも古い胚のために、任意のさらなる解剖前にハサミで頭部を削除します。 </li></ol>胸腺の3分離<ol><li>双眼拡大レンズの下では、湿ったガーゼ寝具に、仰臥位（腹ビュー）に横たわって、胚を配置します。 </li><li>胸部グリッドをつまんで開​​き、胸骨の軟骨に沿って長手方向に1鉗子を挿入します。湾曲鉗子で、Tを可視化するために確保胸壁を引きます気管の両側にハイミックローブ。 </li><li>慎重に微細な鉗子でつまんで下の各葉を保持し、1ミリリットルのHBSS + 1％FCSを含有するペトリ皿に置きます。ローブを分離し、カプセルに損傷を与えることなく、2 1ミリリットルのシリンジ+ 26 G⅜「針で周囲の結合組織を除去。 </li><li>血液細胞を除去するためにHBSS + 1％FCS 3mlにローブを洗います。 注：E15の前に、胸腺ローブが二肺葉臓器を構成する途中で気管以降ヒューズの両側に配置されています。 </li></ol> 4.細胞懸濁液<ol><li> HBSS + 1％FCSで1ミリリットルの注射器に取り付けられた2つの26 G針で、双眼拡大レンズの下でローブを離れていじめます。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。 </li></ol> 5.蛍光抗体で染色し、細胞選別注：すべての抗体は、以前に集団の最適な定義を得るために滴定する（titratイオン）は、抗体のバッチで変化させることができます。 <ol><li>系統陽性細胞を染色するために、ビオチン化抗体のカクテル100μlを4℃で15〜30分間、胸腺細胞（E13またはE18）をインキュベートする（抗CD19、抗群Gr1、抗TER119、抗NK1.1 、抗CD11cの、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25）。 </li><li>離れて抗体を過剰に洗浄するために7分間280×gで4ミリリットルHBSS + 1％FCSでチューブをスピンダウンし、上清を、新鮮なHBSS + 1％FCS中に再懸濁したペレットを除去します。遠心分離を繰り返します。 </li><li> 4℃で15分間、ストレプトアビジンビーズとE18のビオチン標識された細胞をインキュベートし、HBSS、1％FCSで細胞を2回洗浄します。 2ミリリットルのHBSS + 1％FCSで細胞を再懸濁します。ほとんどのE13胸腺細胞は、系統陰性であり、従って、細胞選別の前にMACS濃縮を必要としません。 </li><li>製造業者の説明書に従って、LSカラム上で細胞を渡します。すべての細胞懸濁液が入ったとき、カラムを2mlのHBSS + 1％FCSを追加します。回復しますカラム4mlを280×gで7分間、細胞を通って流れ、遠心。 </li><li>枯渇E18またはTSP抗体ミックス（抗CD117 APC50μlの総E13の胸腺細胞、抗CD135 PE、抗CD127 PECy7、抗CD24 FITC、抗CD44 APCCy7とストレプトアビジンパシフィックブルーのいずれかのペレットを再懸濁）、暗所で4℃で20分間インキュベートします。 </li><li> 4ミリリットルHBSS + 1％FCSとで細胞を洗浄する1ミリリットルHBSS中にヨウ化プロピジウムでの+ 1％FCSに細胞を再懸濁。 </li><li>ソートのTSP林- 200μlの完全培地+ 20％FCSを含む1.5 mlチューブの上に（4レーザーで）FACSにおけるCD44 + CD117 + CD24 低 CD127 + CD135 +細胞。 FSCおよびSSCチャンネルでそれらのサイズおよび粒度に応じて第1のセルのゲート。 （ヨウ化プロピジウムで染色）死細胞、ゲートアウトダブレットを排除し、指数関数的なスケールで蛍光をスコア。 100または600の周りのTSPは、1 E13やE18 1胸腺、respectivから得ることができますエリー。 </li></ol>前駆細胞とE14胸腺ローブの6植民地：ハンギングドロップ法<ol><li> （30グレイ= 30 Gyの）CD45.2胚からE14胸腺葉、文化の前に3時間を照射します。 注：E14またはE15胸腺ローブは正常T細胞前駆細胞のレシピエントとして使用されています。以前の妊娠日目の胸腺ローブがおそらく上皮細胞の不完全な発展に、不十分ながら開発による臓器の大きいサイズに早期の壊死の後の妊娠日の結果の受信者胸腺葉を使用しました。 </li><li>遠心のTSPと再サスペンド細胞培養培地中で（10％FCSを含むOPTI-MEM完全培地、ペニシリン（50単位/ ml）、ストレプトマイシン（50μg/ ml）および2βメルカプトエタノール（50μM））をソートし、その結果35 μlの500 TSPが含まれています。 </li><li> 60ウェルテラサキプレートの他のすべてのウェルの細胞懸濁液の35μlのドロップを置きます。 注：これらは連続したウェルに入れている場合は35μlの滴が融合することができます。 </li><li>各液滴の表面に1照射ローブを配置します。テラサキプレートを閉じて、細胞が重力によって落下の頂端極に到達できるように逆さまにプレートを回します。 </li><li>ドロップの頂端縁にスライドするようにローブを強制的に穏やかに反転板の上側を押してください。 37℃+ 5％CO 2で48時間、加湿インキュベーターで反転テラサキプレートをインキュベートします。植民地化した後、培養E14 FTOC 7で胸腺、または受信者の成体マウス8の腎臓被膜下に移植片のいずれか。 </li></ol> 7.胎児胸腺器官培養<ol><li> 35ミリメートルペトリ皿の上に完全培地の3ミリリットルを置きます。媒体上に浮上isopore膜フィルターを置きます。鉗子（1膜上を超えない8ローブ）を有する膜の端に再構成されたローブを配置します。 </li><li>ウォートの2ミリリットルを含む、カバーなし、35mm皿と一緒に、90ミリメートルのペトリ皿の内側に胸腺葉を含むペトリ皿を置きます最適な湿度を確保するために、R。 37℃+ 5％CO 2で12日間インキュベートします。 </li></ol>無菌条件下での腎臓被膜下移植片8 注：腎実質はカプセルを形成する結合組織に囲まれています。サブ莢領域は、血液、それによって移植片の開発に適した環境（ 例えば胸腺葉、膵島または新生児の心）を提供するリンパ管において特に豊富です。それは右腎よりもアクセス可能であるため、移植片は、通常、左の腎臓で行われています。 CD3 - / -雄マウスはE15の前にセックス決意を容易に行われないため、受信者は、このように起因するY染色体にリンクされているマイナー組織適合性抗原に対する宿主反応、移植片対を回避として使用しました。 <ol><li>楽器を殺菌し、手術に沿って滅菌手袋を着用してください。ケタミン10 mg / mlのキシラジン+ 1ミリグラム/溶液の腹腔内注射によりマウスを麻酔mlをPBS中に希釈した（体重10gあたり50〜100μl）を、1mlシリンジを使用して。すだれ状反射の欠如をチェックすることによって麻酔を確認してください。麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目にハイドロOptimuneゲルのドロップを置きます。 注：ソリューションは、即座に調製し、注射前に室温で温めする必要があります。麻酔は、少なくとも20分間持続します。麻酔の程度は、すべての手術に沿って制御されるべきです。麻酔は、20分毎に半分の用量の腹腔内注射することにより延長することができます。 </li><li>水平ラミナフローフード下で、その右側にマウスを置きます。 70％エタノールおよび10％ヨウ化真皮溶液で手術領域を滅菌します。鉗子部とだけ後肢の関節上記2cmの長さに沿ってマウスの毛。手術領域を剃ります。 </li><li>メスで、最初の切開1.5センチメートル長を行い、皮膚組織は、その後はさみで筋肉組織を切断します。切開の両側にわずかな圧力を適用します、腹腔から腎臓を強制れます。 </li><li>湿った腎臓を維持するために綿芽で生理食塩水を適用します。あなたは臓器を露出させることは困難である場合は、腎臓が接続されている周囲の脂肪細胞組織を引き出すために平らなピンセットを使用しています。臓器の下に配置された綿棒により後腹膜腔から腎臓を維持します。 </li><li> 2細かい鉗子で、カプセル2-3ミリの穴を作る（出血を防ぐために実質を触れないように注意してください）​​。全体の外科的処置の間に連続的に湿らせた露出された腎臓カプセルを保持します。 </li><li>開かれたカプセルの壁を維持することによって、腎臓被膜下に慎重ローブを挿入し、エッジの極に向かって被膜下移植片をスライドさせます。腎臓あたり6ローブまで置きます。 </li><li>レトロ腹腔内に腎臓を交換してください。筋腱膜、個々の外科医の結び目と、その後皮膚を縫合。 10％ヨウ化ポビドン溶液で傷を濡らします。加熱されたPAの上にマウスを置きます37℃でD。 </li><li>心臓、呼吸器およびウィスカの動きの制御により、麻酔から完全に回復するまで、移植マウスを調査、自己から見た完全に回復するまでの粘膜の色が動きを含んでいました。 注：私達はちょうど手術後の痛みを防止するために、手術後の手術と2日後に鎮痛剤溶液（Buprenorphin、0.1ミリグラム/ kg）を筋肉内注射することをお勧めします。 </li><li>完全に回復するまで、単独で動作する動物を保管してください。確認し、感染を防止するために、一日おきに、創傷のステッチを点検します。この手順に従って、創傷感染を観察することはありません。 注：CD3から末梢血細胞の週刊分析- / -グラフトされたマウスは、私たちが由来集団はCD45アロタイプマーカーおよびT細胞系列特異的抗体（ 図3）を使用して、E13やE18前駆細胞のいずれか由来の胸腺を検出することを可能にします。 </li></ol>フローサイトメトリーによるTSPの子孫の9分析<ol><lI&gt;（プロトコルセクション4を参照）単一細胞懸濁液を得るために、個別にFTOCsをいじめます。 </li><li> CD45.1 PECy7、CD45.2 AmCyan、CD4 APCCy7、CD8 APC、CD3パシフィックブルー、Vγ5FITC、Vδ1PEとセクション5で説明したようにインキュベートを認識する抗体を含む抗体混合物と個々のローブからステイン細胞懸濁液。 </li><li>再懸 ​​濁（ 図2の結果を参照してください）HBSS + 1％FCS +ヨウ化プロピジウムで細胞を、フローサイトメーターで分析します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

二つの主なアッセイは、ex vivoでのT細胞分化を分析するために使用することができます。最も最近報告Noth1、1または4〜12のようなデルタのリガンドを発現し、OP9 BMストローマ細胞と造血前駆細胞の共培養である。この2-Dアッセイは、実施が容易で、非常に効率的で敏感であり、可能分析で単一細胞レベル。しかし、いずれも、胸腺上皮との直接的な相互作用を必要とし、どちらもDPの段階でもγδDETC 13の世代を越えT細胞の開発をサポートしています。 FTOCs長いT細胞の発達3を分析するために使用されてきました。このアッセイの主な強みは、すべての生成がT細胞コンパートメント、胸腺上皮で胸腺細胞の効率的な3次元相互作用によって付与されたプロパティを成熟させること。そこで我々は、外因性前駆細胞による効率的な定着を可能にする、ここで、現在、内因性の胸腺細胞を枯渇させるために使用される2つのメソッドをテストしました。電離放射線照射とデオキシグアノシン治療の両方を効率的に胸腺細胞の開発を枯渇しました。しかし...

Tリンパ球は、αβまたはγδT細胞受容体（TCR）を有する、特殊な器官における胸腺を区別する。十分に発達した胸腺は、2つの異なる領域で構成されています。生産性のTCRβおよびα鎖遺伝子を再配置胸腺細胞がプログラム死（正の選択として知られるプロセス）から救出された胸腺前駆細胞の開発皮質、および;自己リガンドに強すぎる反応性を有する胸腺細胞を選択した髄質は、（負の選択）1,2削除されます。胸腺は、後に間葉細胞3に囲まれている第三の咽頭嚢の内胚葉層に由来します。これは、胎生E12から始まる造血前駆細胞が定着され、その後、連続的な動員は、通常のT細胞の発生4に必要とされます。胸腺の移民が開始され、厳密に調節されたプログラムによって編成、連続した発達段階を経て進化し、舞そのリガンドとの相互作用時に胸腺細胞のNotchシグナル伝達経路の活性化によってntained、4のようなデルタ、胸腺上皮細胞（のTEC）上に発現5。 胸腺細胞の開発は、いわゆるCD4で始まる- CD8 -ダ ​​ブルネガティブ（DN）の段階。 、DN2（CD25 + CD44 +）、DN3（CD25 + CD44 - ）とDN4（CD25 - CD44 - ） - DN胸腺細胞は、さらにDN1（CD44 + CD25）へのCD25およびCD44の発現に応じて分割することができます。 CD24（HSA）およびCD117（c-キット）をさらにDN1aとbが早期胸腺前駆細胞（ETP）に対応する5サブセットにDN1区画を細分化。胸腺細胞は、DN段階でのTcRδ、βおよびα鎖の配置を変更し、前のTCR選択（DN3-DN4ステージを）受けます。のTCRα鎖は、正と負のSELEの前に並べ替えて、CD4 + CD8 +ダブルポジティブ（DP）区画への彼らは、さらにトランジットction。この段階では、ほとんどの胸腺細胞は排除され、わずかな割合（3〜5％）は、CD4 +またはCD8 + T細胞コンパートメント成熟到達します。 リンパ分化経路は、多能前駆細胞（MPP）と赤血球と巨核球6の可能性を失ったリンパプライミング多能性前駆細胞（LMPP）を生成するHSCの段階を経て進行します。 （C-キット（CD117）の発現、SCA-1とのFlt3 / Flk2は（CD135）およびインターロイキンの検出可能なレベルの不在- LMPPは、表現型（林は、系統が負）分化した血液細胞マーカーの不在によって定義されていますIL）-7受容体α鎖（IL-7RαまたはCD127）。 LMPPsはさらにその段階によって、骨髄細胞を生成する能力を失っていることを共通のリンパ系前駆細胞（CLP）7へと分化します。 CLPは、リンパ球（B細胞およびT細胞）、NK細胞、DCおよび先天性リンパ系細胞（ILC）の可能性を保持し、CD1の発現によりLMPP異なります27とSCA-1の高レベルの不在。 前駆細胞を沈降胸腺（TSP）の性質は広範囲に8を議論されてきたが、それは開発9を通じて、TSP変更表現型、分化能および機能ことが最近明らかになりました。我々は、E13（第一波）またはE18（第2波）のいずれかからFACS選別細胞による孤立し、TSPを特徴づけるために、in vitroおよびin vivoアッセイを行いました。異なるアロタイプマーカーを有するE13とE18前駆細胞の同数の植民地照射胸腺葉を持つ胎児胸腺器官培養（FTOC）は、同様の発達の環境でそれらの子孫以下の許可および前駆細胞の両方のタイプの間で異なる細胞固有の特性を明らかにしました。 E13やE18 TSPのいずれかによって植民地化胸腺ローブが原因で両方の前駆体との間の競合に選択せずに開発を可能にした。コロニー形成胸腺葉のインビボ移植、さらにまた、Tことが示されました彼は、 インビボで異なる生物学的特性を有するE13とE18 TSPの子孫を成熟します。最初の波からのTSPは、急速にT細胞を生成するが、αβおよびγδT細胞の数が少ないを生じさせます。後者の中、私たちは不変TCRは、それらは創傷治癒における機能を発揮し、唯一の胚発生の10の間に生成され、表皮に移行していVγ5Vδ1樹状上皮T細胞（DETC）を検出しました。対照的に、第二波のTSPは、TCR + T細胞の高い数を生成するために時間がかかり、DETCを生成することができません。

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mmおよび35 x 15 mmのプラスチック組織培養ペトリ皿。</td><td>TPP</td><td>T93100 / T9340</td><td>サンプリング</td></tr><tr><td>26 G&frac38;「針付き0.45 x 10 mmシリンジ</td>BD <td>Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell懸濁液</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュボルト締め布50/50mmピースを滅菌しました。</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td>細胞<td>のろ過</td></tr><tr><td>エタノール70%。</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>無菌作用</td></tr><tr><td>ヨウ化物 ポビドン 10% (ベタジン)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>無菌作用</td></tr><tr><td>ケタミン 100 mg/ml (原液)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>キシラジン 100 mg/ml PBS 中 (原液)</td>シ<td>グマ</td><td>X1251-1G</td><td>麻酔薬および筋弛緩剤</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン 0.3 mg/ml 原液</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>モルヒニック鎮痛薬</td></tr><tr><td>Ophtalmicゲル(0.2%のcyclosporin)</td><td>Schering-Ploughの動物の健康</td><td></td><td>目の保護</td></tr><tr><td>DPBS(+ CaCl2、MgCl2)</td><td>GIBCOの生命技術</td><td>14040-174</td><td>胚を分離</td></tr>するため <tr><td>HBSSの平衡塩の解決(+CaCl2、MgCl2)</td><td>GIBCOの生命技術</td><td>24020-091</td>血を<td>洗い流すために胚の解剖</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>培養用培地</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>培養用添加物</td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>GIBCO ライフサイエンス</td><td>15640-055</td><td>培養用抗生物質</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>GIBCO ライフサイエンス</td><td>31350010</td><td>培養用添加剤</td></tr><tr><td>ライカMZ6 解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ6 10445111</td><td>オキュラー W-PL10x/23</td></tr><tr><td>コールドランプソース</td><td>ショット VWR</td><td>KL1500 コンパクト</td><td>2つのグースネックファイバー適合</td></tr><tr><td>シリコーンエラストマー</td><td>ワールド精密機器</td><td>SYLG184</td><td>解剖パッド</td></tr><tr><td>スプーン、丸くて穴あきファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>10370-18</td><td>解剖ツール</td></tr><tr><td>ファインアイリスはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-09</td>解<td>剖ツール</td></tr><tr><td>ヴァンナススプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15018-10</td>解<td>剖ツール</td></tr><tr><td>鉗子:デュモン#5/45イノックス11cmFST</td><td></td><td>11253-25</td><td>解剖ツール</td></tr>2<tr><td>組の細かいまっすぐな時計職人の鉗子デュモン#5 11センチメートルの細かい先端。</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-20</td><td>解剖ツール</td></tr><tr><td>針付きポリアミド糸 6-0 C-3 3/8c</td><td>縫合糸用</td><td>エチコン</td><td>F2403</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>モリア/F.S.T.</td><td>縫合糸用</td><td>12060-02</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>麻酔中にマウスの温度を維持するため</td></tr><tr><td>膜 イソポア RTTPO2500</td><td>ダッチャー</td><td>44210</td><td>FTOC</td></tr><tr><td>テラサキ用60ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td>1x270 10318801</td><td>吊り下げ式ドロップ技術用</td></tr><tr><td>ガーゼ綿棒滅菌 7.5×7.5cm</td><td>ハイドレックス</td><td>11522</td><td>消毒液を塗布するため</td></tr><tr><td>蛍光標識抗体またはビオチン標識抗体</td><td>BD Biosciences、Biolegend、またはe-Biocsiences&nbsp;</td><td>クローン番号 以下の表を参照</td><td>染色細胞</td></tr><tr><td>MACS カラム/ストレプトアビジン マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>細胞枯渇</td></tr><tr><td>マウス</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&nbsp;(CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td><td>細胞および胸腺葉の供給源</td></tr><tr><td>マウス</td><td>CDTA Orl&eacute;ans, France</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>接木実験</td></tr></tbody></table>

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

胸腺沈降前駆細胞を特徴づけることはリンパ球減少患者におけるT細胞の交換のための戦略を考案することが不可欠、T細胞の発達の前胸腺の段階を理解することが重要です。我々は、in vitroおよびin vivo技術 、「ハンギングドロップ」法に基づいて、両方の中の相補的な2によってマウス胚13日目と18胸腺から前駆細胞を沈降胸腺を検討しました。この方法は、その子孫以下こうしてCD45アロタイプマーカーとで区別E13および/またはE18胸腺前駆細胞を照射した胎児胸腺葉に定着させました。混合集団との植民地は、人口のいずれかでのコロニー形成が可能で競争力のある選択圧を除去しながら、前駆細胞の生物学的性質の細胞自律的な差異を分析することができます。植民地化胸腺葉はまた、Tの人口動態などのin vivoでの成熟T細胞子孫の分析可能にする免疫不全の雄レシピエントマウスに移植することができます彼異なる組織や器官の末梢免疫系と植民地化。胎児胸腺器官培養物を、E13前駆細胞はすべてに急速に発展し、CD3 +細胞に成熟することを明らかにした樹状上皮T細胞として知られている標準的なγδのT細胞サブセット、を生じました。対照的に、E18の前駆細胞は分化遅延を有し、樹状上皮T細胞を生成することができませんでした。 / - -胸腺移植されたCD3の末梢血のモニタリングマウスはさらにE18の胸腺沈降前駆細胞は、時間の経過とともに、短期的胎児胸腺に理解することができなかった機能をそのE13の対応よりも成熟T細胞のより大きな数を生成することを示しました器官培養。

コロニー形成前駆細胞の最良の開発を可能にする内因性胸腺細胞の胸腺葉を枯渇させる方法を選択するために、我々は、照射後にコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルまたは5日間のデオキシグアノシン（D-Guaの）治療を比較しました。結果は、照射後のT細胞の発生を得るために、D-Guaの治療よりも適切であり、培養の9日目に差がないが、照射されたローブがこのように12日目に、D-Guaので処置したものよりも多くのT細胞を含有することを示し胸腺植民地化（ 図1）。 E13とE18 TSPの発生可能性を研究するために、我々は、E14は、前駆細胞の2つのタイプの同数の混合物で胸腺ローブを照射植民地化。結果は、E13のTSPは対照的に、E13 TSPがDETCを生成し、CD3の高い周波数+細胞 （ 図2）成熟し、より少ない胸腺細胞およびE18 TSP未満のDPを生じさせるが、ことを示しています。 in vivoで鍋を分析するために、- / -レシピエントE13とE18 TSPのentialは、前駆細胞の各タイプを保菌胸腺ロ...

この記事では、胸腺沈降前駆細胞を特徴づけるためのin vivoおよびin vitroの方法論について、そのT細胞子孫の世代数、表現型、および数の動態を分析することによって説明しています。

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

この手順の全体的な目的は、E 13またはE 18の胸腺定着前駆細胞によって産生されるT細胞の数および表現型キネティクスを解析することである。まず、E 13、E 14、およびE 18のマウス胚から胸腺葉を単離する。次に、E 14の胸腺葉に放射線を照射し、フローソートしたE 13またはE 18の細胞を播種して、ハンギングドロップ法で48時間培養する。最終ステップとして、コロニー形成した葉を成体CD3ノックアウトマウスの腎被膜下に移植します。最終的に、フローサイトメトリーを用いて、キメラ動物の血液中にE 13およびE 18胸腺定着前駆細胞の系譜が存在するかを評価できます。本手法の、IFE細胞を用いたin vitro T細胞培養などの既存手法に対する主な利点は、定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟を可能にする3次元アッセイの手法と、無処置のレシピエントマウスへの胸腺オルガンカルチャーの移植手法を組み合わせている点にあり、これにより胸腺スライス前駆細胞とその系譜の分化および機能を評価することが可能になります。げっ歯類の手術に精通した研究エンジニアとして、移植実験の2日前に層流クリーンベンチ内で行う手順を実演します。妊娠した雌マウスの腹部を70% ethanolで消毒し、正中線上の皮膚を縦方向に切開します。皮膚を広げて切開口を開き、消化管に触れないようにピンセットと鋏を用いて腹膜を開きます。次に、分枝した子宮を取り出し、鋏で膣から切り離します。その後、40～50 mLのDPBSを入れた90×15 mmのペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜の間を横方向に切断します。先みの鋏と精密ピンセットを用い、胎盤と卵黄嚢の間を切断して子宮の筋膜を取り除き、各胚を摘出します。次に、胚を保持したまま羊膜を除去し、1% FCS添加HBSSを含む新しいペトリ皿に胚を移します。胸腺を分離するために、双眼拡大鏡の下で胚を1つずつ仰臥位に置きます。次に、ピンセットを胸骨の軟骨に沿って縦に挿入し、弯曲ピンセットを用いて胸郭を挟み開きします。胸壁を脇に除けて、気管の両側にある胸腺葉を視認させます。その後、細いピンセットで胸腺の下側を挟み、各葉を慎重に摘出して、1% FCS添加HBSS 1 mLを入れたペトリ皿に移します。次に、2本の精細ピンセットを使用して、葉を損傷しないように周囲の結合組織を除去します。その後、葉を3 mLのHBSS（1% FCS添加）で洗浄し、赤血球を除去して、胎児胸腺器官培養（FTOC）の照射準備を整えます。このようにして、CD 45.2胚からE 14の胸腺葉を分離します。葉を約3時間静置します。その後、分取したばかりのE 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞を遠心分離します。ペレットを培地で再懸濁し、培地35 µLあたり500細胞の最終濃度に調整します。次に、60ウェルのTerasakiプレートの1つおきのウェルに、細胞懸濁液を35 µLずつ滴下し、各滴の表面に放射線照射済みの葉を1つずつ配置します。プレートに蓋をし、細胞が重力によって滴の頂点に到達するようにプレートを逆さまにします。このとき、逆さまにしたプレートの上部を軽く叩き、葉を滴の頂端端まで滑らせます。その後、この逆さまにしたプレートを、加湿インキュベーター内で37 °C、5% CO2の条件下で48時間インキュベートします。胸腺葉への定着後、受容動物の反射反応がないことを確認し、麻酔レベルを検証します。次に、両眼に眼軟膏を1滴ずつ点眼し、マウスをラミナーフローフード内で右側臥位にします。その後、後肢の関節のすぐ上の手術部位を剃毛します。次に、滅菌手袋を着用し、70% ethanolと10% IOD DY DER溶液を用いて手術野を滅菌します。メスを使用して皮膚組織に1.5 centimeterの切開を加え、続いて筋肉組織を切開します。切開部の両側からわずかに圧力をかけて腎臓を腹腔から押し出し、生理食塩水で腎臓を湿らせた状態に保ちます。綿棒を用いて腎臓を後腹膜腔の外に保持し、2本の精密ピンセットで被膜に2〜3 mmの穴を開けます。次に、被膜壁を広げて保持しながら、最大6個の胸腺葉移植片を腎極の縁に向かって慎重にスライドさせて挿入し、腎臓を後腹膜腔に戻します。筋肉を縫合し、続いて皮膚を個別の外科結節（サージョンノット）で縫合します。次に、創傷部位を10%ポビドンヨード溶液で湿らせ、マウスを37 °Cのヒートパッドの上に置き、動物と手術創の両方が完全に回復するまでモニタリングし、コロニー形成前駆細胞を育成するための内因性胸腺細胞の枯渇に最適な方法を決定します。本実験では、放射線照射または5日間のデオキシグアノシン処理後の、コロニー形成された胸腺葉におけるT細胞再構成レベルを比較しました。培養9日目ではコロニー形成リンパ球の数に差は見られませんでしたが、12日目には放射線照射した葉はデオキシグアノシン処理した葉よりも多くのT細胞を含んでいたため、放射線照射が胸腺コロニー形成後のT細胞分化を促進するための好ましい処理であることが分かりました。ここで、E 13およびE 18胸腺定着前駆細胞の開発能を調べるため、E 14放射線照射胸腺葉にこれら2種類の前駆細胞を同数ずつコロニー形成させたところ、観察の結果、E 13胸腺定着前駆細胞はE 18胸腺定着前駆細胞よりも少ない数の胸腺細胞およびダブルポジティブT細胞を産生しました。しかしながら、成熟CD3陽性細胞の頻度は増加しており、樹状上皮T細胞の産生はE13胸腺定着前駆細胞の系譜でのみ検出されました。E13およびE18胸腺定着前駆細胞のin vivoでの能力を解析するため、それぞれの前駆細胞によってコロニー形成された胸腺葉を、CD3ノックアウト受容体の腎被膜下に移植しました。実証された通り、予想されていたように、E13胸腺定着前駆細胞はE18前駆細胞よりも迅速にT細胞分化を誘導しましたが、循環T細胞の総数はE13胸腺定着前駆細胞によってコロニー形成された個体で有意に低い結果となりました。この手法の開発により、発生免疫学分野の研究者が、哺乳類モデルにおいて一部が厳格に胚由来であるT細胞サブセットの特性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、自然環境下および競争条件下において、Timex沈降前駆細胞とその子孫の分化および機能的経路を追跡する方法について十分に理解できるはずです。

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、新生児キメラの世代だけでなく、2光子顕微鏡によるex...

2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で"ニッチ"の同定に役立つはずです。...

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

このビデオでは、iPS細胞由来の未熟T細胞から、三次元胸腺培養システムを用いて機能的な抗原特異的T細胞を作製するプロトコールを実演しています。iPS細胞由来の未成熟T細胞を内因性リンパ球枯渇マウスの胎児胸腺葉と共培養した結果、T細胞の成熟に成功し、CD8αβ+ MHCクラスI+...

iPS細胞由来胸腺移民を作出する3次元胸腺培養システム

マウス胚性幹細胞は、OP9-DL1共培養システムを使用してin...

T細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの

現在の2D培養システムはin vivoのシナリオを模倣していないため、in...

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。...

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

本稿では elisa 法を用いたマウスの T に依存し、T 独立免疫グロブリン (Ig) アイソタイプを特徴付けるためのプロトコルについて述べる.このメソッドは、単独で使用またはフローと組み合わせてフローサイトメトリーは T に依存し、T 独立した抗原免疫したマウスの B 細胞の Ig...

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

プロトコルの目的は、レーザー マウス眼房内で胸腺のインプラントで顕微鏡による胸腺細胞の縦の生体リアルタイム追跡を示すことです。角膜の透明性と血管新生血管前駆細胞の動員と成熟した T...

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離

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胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング

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