胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリングインビボとインビトロアッセイ

この手順の全体的な目標は、E 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞によって産生されるT細胞の生成と数の表現型動態を分析することです。これは、最初にE 13、E 14、およびE 18マウス胚から胸腺葉を単離することによって達成されます。第2ステップでは、E 14胸腺葉に照射し、次いでフローソーティングされたE 13またはE 18細胞を吊り下げ滴中で48時間コロニー形成する。

最終ステップでは、コロニー形成された葉を成体CD3ノックアウトマウスの腎臓嚢の下に移植します。最終的に、フローサイトメトリーを使用して、キメラ動物の血液中のE 13およびE 18胸腺沈降前駆子孫の存在を評価することができます。この技術の主な利点は、既存の方法の主な利点は、ineso細胞上のin vitro T細胞培養のように、この技術は、3次元アッセイで定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟を可能にする方法と、無傷のレシピエントマウスでの胸腺臓器臓器培養の移植を可能にする方法を組み合わせることで、胸腺slic前駆細胞と子孫の分化と機能を評価できることです。

げっ歯類の外科手術の専門知識を持つ研究エンジニアとして、私は層流フードでの移植実験の2日前に、70%エタノールで妊娠中の雌マウスの腹部を正中線で皮膚に縦方向に切開し、皮膚を引き離して切開を開き、鉗子とハサミを使用して消化管に触れずに腹膜を開きます。次に、二分子宮を引き出し、ハサミを使って膣から分離します。次に、40〜50ミリリットルのDPBSを含む90 x 15ミリメートルのペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜間を横方向に切断します。

細い先端のはさみと細かい鉗子を使用して、胎盤と卵黄嚢の間を切っている子宮の筋肉膜を取り除き、各胚を取り出します。次に、胚を保持している羊水を取り除き、HBSSと1%FCSを含む新しいシャーレに胚を置きます。胸腺を分離するには、双眼拡大レンズの下で胚を一度に1つずつ仰臥位に置きます。

次に、胸骨の軟骨に沿って縦方向に1本の鉗子を挿入し、湾曲した鉗子を使用して胸部グリッドをつまんで開きます。胸壁を脇に引っ張って、気管の両側にある胸腺葉を視覚化します。次に、細い鉗子で胸腺の下をつまんで、各葉を慎重に取り除き、1ミリリットルのHBSSと1%FCSを含むペトリ皿に入れます。

次に、2つの細い鉗子を使用して、葉を傷つけずに周囲の結合組織を取り除きます。その後、3ミリリットルのHBSSと1%FCSで葉を洗浄し、赤血球を除去して胎児胸腺臓器培養を開始します。E 14胸腺葉は、ちょうど示したようにCD 45.2胚から単離されました。

ローブを約3時間休ませます。次に、選別したばかりのE 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞をスピンダウンします。ペレットを培地中に再懸濁し、培地35マイクロリットルあたり500細胞の最終濃度まで

次に、60ウェルの寺崎プレートの他のすべてのウェルに35マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下し、各滴の表面に照射ローブを1つずつプレートします。プレートを閉じて逆さまにして、細胞が重力によって液滴の頂端極に到達するようにし、逆プレートの上側を静かに打って、ローブを液滴の頂端端までスライドさせます。次に、逆プレートを加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベー

胸腺葉がコロニー形成された後、反射反応の欠如によってレシピエント動物の麻酔レベルを確認します。次に、各目に目の軟膏を一滴垂らし、マウスを層流フードの下の右側に置きます。次に、後肢の関節のすぐ上の手術領域を剃ります。

次に、滅菌手袋を着用し、70%エタノールと10%IOD DY DER溶液で手術野を滅菌します。メスを使用して皮膚組織を1.5センチメートル切開し、続いて筋肉組織を切開します。次に、切開部の両側にわずかな圧力をかけて、腎臓を腹腔から押し出し、生理食塩水で腎臓を湿らせます。

後腹膜腔の外側に綿棒で腎臓を維持し、2つの細い鉗子を使用してカプセルに2〜3ミリメートルの穴を開けます。次に、カプセルの壁を開いたまま、腎臓極の端に向かって最大6つの胸腺葉移植片を慎重にスライドさせ、腎臓を後腹膜腔に戻します。筋肉を縫合し、神経症を縫合し、続いて個々の外科医の結び目で皮膚を縫合します。

次に、創傷を10%ヨウ化物ポビドン溶液で濡らし、マウスを摂氏37度の加熱パッドに置き、動物と外科的創傷の両方が完全に回復するまで監視して、コロニー形成前駆細胞の発達のための内因性胸腺細胞を枯渇させるための最良の方法を決定します。この実験では、放射線療法または5日間のデオキシギン治療後のコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルを比較しました。培養9日目にはコロニー形成リンパ球の数に差は見られませんでしたが、照射された葉には12日目にデオキシギンで処理されたものよりも多くのT細胞が含まれていたため、照射は胸腺コロニー形成後のT細胞の発達を促進するための好ましい治療法となり、ここでE13およびE18胸腺沈降前駆細胞の発生可能性を研究しています。 E 14を照射した胸腺葉は、観察されたように同数の2種類の前駆細胞でコロニーを形成し、E 13胸腺沈降前駆細胞は、E 18胸腺沈降前駆細胞よりも少ない胸腺細胞および二重陽性T細胞を生じさせた。

しかし、成熟したCD 3陽性細胞の頻度は増加し、樹状突起上皮T細胞の産生は、E 13胸腺沈降前駆細胞の子孫でのみ検出され、E 13およびE 18胸腺沈降前駆細胞のin vivo電位を分析しました。予想通り、今示した通りです。E 13胸腺沈降前駆細胞は、E 18前駆細胞よりも早くT細胞を生じさせましたが、循環T細胞の数はE 13胸腺沈降前駆体がコロニー形成動物全体で有意に少なかった後、この技術は、発生免疫学の分野の研究者がT細胞サブセットの特性を探求する道を開きました。 そのうちのいくつかは、哺乳類モデルにおける厳密な胚起源です。

このビデオを見た後、Timexの定住する先駆者とその子孫の微分的で機能的な経路を自然環境や競争条件で追跡する方法についてよく理解しているはずです。