胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング

この手順の全体的な目的は、E 13またはE 18の胸腺定着前駆細胞によって産生されるT細胞の数および表現型キネティクスを解析することである。まず、E 13、E 14、およびE 18のマウス胚から胸腺葉を単離する。次に、E 14の胸腺葉に放射線を照射し、フローソートしたE 13またはE 18の細胞を播種して、ハンギングドロップ法で48時間培養する。

最終ステップとして、コロニー形成した葉を成体CD3ノックアウトマウスの腎被膜下に移植します。最終的に、フローサイトメトリーを用いて、キメラ動物の血液中にE 13およびE 18胸腺定着前駆細胞の系譜が存在するかを評価できます。本手法の、IFE細胞を用いたin vitro T細胞培養などの既存手法に対する主な利点は、定義された前駆細胞からの完全なT細胞成熟を可能にする3次元アッセイの手法と、無処置のレシピエントマウスへの胸腺オルガンカルチャーの移植手法を組み合わせている点にあり、これにより胸腺スライス前駆細胞とその系譜の分化および機能を評価することが可能になります。

げっ歯類の手術に精通した研究エンジニアとして、移植実験の2日前に層流クリーンベンチ内で行う手順を実演します。妊娠した雌マウスの腹部を70% ethanolで消毒し、正中線上の皮膚を縦方向に切開します。皮膚を広げて切開口を開き、消化管に触れないようにピンセットと鋏を用いて腹膜を開きます。次に、分枝した子宮を取り出し、鋏で膣から切り離します。その後、40～50 mLのDPBSを入れた90×15 mmのペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜の間を横方向に切断します。

先みの鋏と精密ピンセットを用い、胎盤と卵黄嚢の間を切断して子宮の筋膜を取り除き、各胚を摘出します。次に、胚を保持したまま羊膜を除去し、1% FCS添加HBSSを含む新しいペトリ皿に胚を移します。胸腺を分離するために、双眼拡大鏡の下で胚を1つずつ仰臥位に置きます。

次に、ピンセットを胸骨の軟骨に沿って縦に挿入し、弯曲ピンセットを用いて胸郭を挟み開きします。胸壁を脇に除けて、気管の両側にある胸腺葉を視認させます。その後、細いピンセットで胸腺の下側を挟み、各葉を慎重に摘出して、1% FCS添加HBSS 1 mLを入れたペトリ皿に移します。

次に、2本の精細ピンセットを使用して、葉を損傷しないように周囲の結合組織を除去します。その後、葉を3 mLのHBSS（1% FCS添加）で洗浄し、赤血球を除去して、胎児胸腺器官培養（FTOC）の照射準備を整えます。このようにして、CD 45.2胚からE 14の胸腺葉を分離します。

葉を約3時間静置します。その後、分取したばかりのE 13またはE 18胸腺沈降前駆細胞を遠心分離します。ペレットを培地で再懸濁し、培地35 µLあたり500細胞の最終濃度に調整します。

次に、60ウェルのTerasakiプレートの1つおきのウェルに、細胞懸濁液を35 µLずつ滴下し、各滴の表面に放射線照射済みの葉を1つずつ配置します。プレートに蓋をし、細胞が重力によって滴の頂点に到達するようにプレートを逆さまにします。このとき、逆さまにしたプレートの上部を軽く叩き、葉を滴の頂端端まで滑らせます。その後、この逆さまにしたプレートを、加湿インキュベーター内で37 °C、5% CO2の条件下で48時間インキュベートします。

胸腺葉への定着後、受容動物の反射反応がないことを確認し、麻酔レベルを検証します。次に、両眼に眼軟膏を1滴ずつ点眼し、マウスをラミナーフローフード内で右側臥位にします。その後、後肢の関節のすぐ上の手術部位を剃毛します。

次に、滅菌手袋を着用し、70% ethanolと10% IOD DY DER溶液を用いて手術野を滅菌します。メスを使用して皮膚組織に1.5 centimeterの切開を加え、続いて筋肉組織を切開します。切開部の両側からわずかに圧力をかけて腎臓を腹腔から押し出し、生理食塩水で腎臓を湿らせた状態に保ちます。

綿棒を用いて腎臓を後腹膜腔の外に保持し、2本の精密ピンセットで被膜に2〜3 mmの穴を開けます。次に、被膜壁を広げて保持しながら、最大6個の胸腺葉移植片を腎極の縁に向かって慎重にスライドさせて挿入し、腎臓を後腹膜腔に戻します。筋肉を縫合し、続いて皮膚を個別の外科結節（サージョンノット）で縫合します。

次に、創傷部位を10%ポビドンヨード溶液で湿らせ、マウスを37 °Cのヒートパッドの上に置き、動物と手術創の両方が完全に回復するまでモニタリングし、コロニー形成前駆細胞を育成するための内因性胸腺細胞の枯渇に最適な方法を決定します。本実験では、放射線照射または5日間のデオキシグアノシン処理後の、コロニー形成された胸腺葉におけるT細胞再構成レベルを比較しました。培養9日目ではコロニー形成リンパ球の数に差は見られませんでしたが、12日目には放射線照射した葉はデオキシグアノシン処理した葉よりも多くのT細胞を含んでいたため、放射線照射が胸腺コロニー形成後のT細胞分化を促進するための好ましい処理であることが分かりました。ここで、E 13およびE 18胸腺定着前駆細胞の開発能を調べるため、E 14放射線照射胸腺葉にこれら2種類の前駆細胞を同数ずつコロニー形成させたところ、観察の結果、E 13胸腺定着前駆細胞はE 18胸腺定着前駆細胞よりも少ない数の胸腺細胞およびダブルポジティブT細胞を産生しました。

しかしながら、成熟CD3陽性細胞の頻度は増加しており、樹状上皮T細胞の産生はE13胸腺定着前駆細胞の系譜でのみ検出されました。E13およびE18胸腺定着前駆細胞のin vivoでの能力を解析するため、それぞれの前駆細胞によってコロニー形成された胸腺葉を、CD3ノックアウト受容体の腎被膜下に移植しました。実証された通り、予想されていたように、E13胸腺定着前駆細胞はE18前駆細胞よりも迅速にT細胞分化を誘導しましたが、循環T細胞の総数はE13胸腺定着前駆細胞によってコロニー形成された個体で有意に低い結果となりました。この手法の開発により、発生免疫学分野の研究者が、哺乳類モデルにおいて一部が厳格に胚由来であるT細胞サブセットの特性を探索する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、自然環境下および競争条件下において、Timex沈降前駆細胞とその子孫の分化および機能的経路を追跡する方法について十分に理解できるはずです。