単一懸濁細胞における薬物および代謝産物の質量分析分析のための単一プローブと結合された統合細胞操作プラットフォーム

統合された細胞操作のプラットホームは周囲条件の下で個々の懸濁細胞のライン分析のための単一調査の質量分析の組み合わせの使用のために開発される。

この方法は、溶液から細胞を分析するので、近いネイティブ環境で細胞を研究するために使用することができます。これには、患者由来細胞サンプルの分析が含まれる。この手法は、細胞のサンプル調製をほとんどまたは全く必要としない。

したがって、周囲の条件下で個々の細胞をオンラインで分析することができ、細胞の異質性を探求することができます。この技術は、患者のサンプルから直接分離された異なるタイプの細胞を分析することができるので、様々な異なる疾患状態からの液体生検を研究するために適用することができる。単一ボアガラスチューブを鋭い先端を持つテーパープローブに変換するには、まず、単一のボアガラスチューブを垂直ピペットホルダーのクランプに配置し、加熱コイルに対してガラスを中心にして締め付けてチューブを所定の位置に固定します。

加熱コイルは、金属棒の周囲に2.5回巻かれた18ゲージニッケルクロム抵抗線で構成されています。温度プログラム19.5でガラス管をセットします。ソレノイドプランジャーを4に設定します。

ガラス管を引っ張るためにソレノイドをトリガーします。このステップは先端で融合した2つのプローブを作成します。セーターを使って各プローブの先端から約1ミリメートル離れたところに切り取り、プローブ先端に直径約10ミクロンのオリフィスを作ります。

ICMPに容易にカップリングするためのガラスプローブを曲げるために、単一のプローブSCMSをセットアップする。まず、プルドガラスプローブをマイクロフォージにセットします。上部を白金加熱ワイヤーの上に約3ミリメートル配置します。

その後、白金線の熱を最高温度の30%に変えます。プローブを元の位置から約 45 度曲げます。逆顕微鏡マイクロインジェクターを2つの細胞操作システムに置き、質量分析計と容易に結合するための電動テーブルに置きます。

ガラスセル選択装置を設置するには、長いスライドをキャピラリーホルダーに入れ、ネジを締めてプローブを所定の位置に固定することにより、マイクロインジェクターの金属ホルダーの内側にガラスセル選択プローブを挿入します。加熱プレートに平行に傾いたプローブ先端を配置します。マイクロインジェクターの金属ホルダーを細胞操作システムに固定します。

次に、プローブ先端を反転した顕微鏡光の真ん中近くに配置します。単一のプローブを含むガラススライドをセル操作システムのアームクランプに固定します。毛細管をプラスチックフェルールのスリーブに入れ、指で継ぎ手を締めることで、キャピラリーを供給する溶媒を導電性の組合に接続します。

導電性の組合の反対側を、毛細管をスリーブに入れ、フィッティングを締めることで、サンプリング溶媒を含むシリンジに接続されているキャピラリーに接続します。これらの実験では、サンプリング溶媒として0.1%ギ酸を有するアセトニトリルを使用する。シリンジを質量分析計のシリンジポンプに固定します。

ナノエレクトロスプレーイオン化またはナノESIエミッタを、拡張イオン伝達チューブのオリフィスに約1ミリメートル位置付けます。細胞操作システムを使用して、単一プローブの容量の動きを制御し、拡張イオン伝達チューブの前にナノESIエミッタを中央に配置します。細胞培養フラスコから15ミリリットルの遠心分離管に細胞をピペット。

セルを摂氏37度で400倍に回転させ、上清を捨てます。目的の処理濃度で薬物化合物を含むRPMI培地の4ミリリットルで細胞を再懸濁する。質量分析計の実験パラメータをカスタマイズします。

計測器ソフトウェアのスキャンモード見出しで、[スキャンの定義]を選択します。M over Z 400 で 60,000 の解像度を使用し、1 マイクロスキャン 100 ミリ秒最大射出時間と自動ゲイン制御をオンにします。シリンジポンプの下で、毎分150ナノリットルの流量を選択します。

NSIソースを選択し、約4.5キロボルトの電圧を印加します。トッププレートとボトムレンズの両方に選択した40倍の倍率で反転顕微鏡をオンにします。ライブビデオフィードをキャプチャするためにラップトップのUSBポートに接続します。

加熱プレートをオンにし、摂氏37度に設定します。コンピュータで、[データの取得] タブに移動し、取得した時間の下で継続的に選択します。分析のためにサンプルを調製するために、サンプルの2〜3を小さなシャーレの蓋にピペットします。

サンプルを、逆の顕微鏡から受け取った光の中央に、加熱プレートの上に置きます。分析用のガラス細胞選択プローブを準備します。細胞操作システムを使用してプローブを移動し、その上が細胞と同じ平面内の反転したマイクロクソープの下に焦点を合わせます。

セル操作システムを使用して、セル選択プローブの先端を分析対象セルに移動します。このプロセスは、反転顕微鏡を使用して監視されます。マイクロインジェクターのハンドルをそっと回して、チューブ内の鉱物油の位置を調整します。

マイクロインジェクターによって穏やかな吸引が提供され、ターゲットとなる細胞を細胞選択プローブ先端に固定します。セル操作システムを使用して、単一のプローブチップに焦点を当てたデジタル顕微鏡を使用して、セル選択プローブ先端のセルを単一のプローブチップに移動させ、このプロセスを監視します。未治療のK-562細胞は、実験方法を確立するために使用される。

一般的なSCMS実験では、細胞内容の検出中および測定終了後に細胞を移す際に、質量スペクトルの明らかな変化を観察することができます。PC 34:4、PC 36:4、PC 38:5を含む3つの一般的な細胞脂質ピークが監視され、細胞が正常に転送され、細胞内容物が検出されることを確認します。750~850の質量範囲にある多くのPCの同一性は、未処理の細胞ライセートサンプル上でMSMSを使用して確認されています。

ICMP単一プローブMSセットアップを用いて、ジェムシタビン、タキソールおよびOSW1は、K-562細胞とのインキュベーション後に検出された。これらの結果は、この方法が、近いネイティブ環境で溶液中の細胞から単一細胞レベルで細胞内脂質、薬物、代謝産物を研究するために使用できることを示唆している。吸引が適切に適用されるように、ガラス細胞選択プローブをユニバーサルピペットホルダーにしっかりと入れておいてください。

この方法は、患者由来のサンプルにも適用して、細胞代謝産物と様々な種類の細胞タイプの違いを区別し、これらの疾患状態をよりよく理解することができます。この方法を開発した後、単一細胞レベルでの薬物化合物の定量化を実装する可能性があります。細胞を扱う場合、ラボコートや手袋など、適切な個人用保護具を持つことは重要です。

ガラスを使用する場合は、追加のアイウェアを使用できます。