単一懸濁細胞における薬物および代謝産物の質量分析分析のための単一プローブと結合された統合細胞操作プラットフォーム
June 21st, 2019
統合された細胞操作のプラットホームは周囲条件の下で個々の懸濁細胞のライン分析のための単一調査の質量分析の組み合わせの使用のために開発される。
この方法は、溶液から細胞を分析するので、近いネイティブ環境で細胞を研究するために使用することができます。これには、患者由来細胞サンプルの分析が含まれる。この手法は、細胞のサンプル調製をほとんどまたは全く必要としない。
したがって、周囲の条件下で個々の細胞をオンラインで分析することができ、細胞の異質性を探求することができます。この技術は、患者のサンプルから直接分離された異なるタイプの細胞を分析することができるので、様々な異なる疾患状態からの液体生検を研究するために適用することができる。単一ボアガラスチューブを鋭い先端を持つテーパープローブに変換するには、まず、単一のボアガラスチューブを垂直ピペットホルダーのクランプに配置し、加熱コイルに対してガラスを中心にして締め付けてチューブを所定の位置に固定します。
加熱コイルは、金属棒の周囲に2.5回巻かれた18ゲージニッケルクロム抵抗線で構成されています。温度プログラム19.5でガラス管をセットします。ソレノイドプランジャーを4に設定します。
ガラス管を引っ張るためにソレノイドをトリガーします。このステップは先端で融合した2つのプローブを作成します。セーターを使って各プローブの先端から約1ミリメートル離れたところに切り取り、プローブ先端に直径約10ミクロンのオリフィスを作ります。
ICMPに容易にカップリングするためのガラスプローブを曲げるために、単一のプローブSCMSをセットアップする。まず、プルドガラスプローブをマイクロフォージにセットします。上部を白金加熱ワイヤーの上に約3ミリメートル配置します。
その後、白金線の熱を最高温度の30%に変えます。プローブを元の位置から約 45 度曲げます。逆顕微鏡マイクロインジェクターを2つの細胞操作システムに置き、質量分析計と容易に結合するための電動テーブルに置きます。
ガラスセル選択装置を設置するには、長いスライドをキャピラリーホルダーに入れ、ネジを締めてプローブを所定の位置に固定することにより、マイクロインジェクターの金属ホルダーの内側にガラスセル選択プローブを挿入します。加熱プレートに平行に傾いたプローブ先端を配置します。マイクロインジェクターの金属ホルダーを細胞操作システムに固定します。
次に、プローブ先端を反転した顕微鏡光の真ん中近くに配置します。単一のプローブを含むガラススライドをセル操作システムのアームクランプに固定します。毛細管をプラスチックフェルールのスリーブに入れ、指で継ぎ手を締めることで、キャピラリーを供給する溶媒を導電性の組合に接続します。
導電性の組合の反対側を、毛細管をスリーブに入れ、フィッティングを締めることで、サンプリング溶媒を含むシリンジに接続されているキャピラリーに接続します。これらの実験では、サンプリング溶媒として0.1%ギ酸を有するアセトニトリルを使用する。シリンジを質量分析計のシリンジポンプに固定します。
ナノエレクトロスプレーイオン化またはナノESIエミッタを、拡張イオン伝達チューブのオリフィスに約1ミリメートル位置付けます。細胞操作システムを使用して、単一プローブの容量の動きを制御し、拡張イオン伝達チューブの前にナノESIエミッタを中央に配置します。細胞培養フラスコから15ミリリットルの遠心分離管に細胞をピペット。
セルを摂氏37度で400倍に回転させ、上清を捨てます。目的の処理濃度で薬物化合物を含むRPMI培地の4ミリリットルで細胞を再懸濁する。質量分析計の実験パラメータをカスタマイズします。
計測器ソフトウェアのスキャンモード見出しで、[スキャンの定義]を選択します。M over Z 400 で 60,000 の解像度を使用し、1 マイクロスキャン 100 ミリ秒最大射出時間と自動ゲイン制御をオンにします。シリンジポンプの下で、毎分150ナノリットルの流量を選択します。
NSIソースを選択し、約4.5キロボルトの電圧を印加します。トッププレートとボトムレンズの両方に選択した40倍の倍率で反転顕微鏡をオンにします。ライブビデオフィードをキャプチャするためにラップトップのUSBポートに接続します。
加熱プレートをオンにし、摂氏37度に設定します。コンピュータで、[データの取得] タブに移動し、取得した時間の下で継続的に選択します。分析のためにサンプルを調製するために、サンプルの2〜3を小さなシャーレの蓋にピペットします。
サンプルを、逆の顕微鏡から受け取った光の中央に、加熱プレートの上に置きます。分析用のガラス細胞選択プローブを準備します。細胞操作システムを使用してプローブを移動し、その上が細胞と同じ平面内の反転したマイクロクソープの下に焦点を合わせます。
セル操作システムを使用して、セル選択プローブの先端を分析対象セルに移動します。このプロセスは、反転顕微鏡を使用して監視されます。マイクロインジェクターのハンドルをそっと回して、チューブ内の鉱物油の位置を調整します。
マイクロインジェクターによって穏やかな吸引が提供され、ターゲットとなる細胞を細胞選択プローブ先端に固定します。セル操作システムを使用して、単一のプローブチップに焦点を当てたデジタル顕微鏡を使用して、セル選択プローブ先端のセルを単一のプローブチップに移動させ、このプロセスを監視します。未治療のK-562細胞は、実験方法を確立するために使用される。
一般的なSCMS実験では、細胞内容の検出中および測定終了後に細胞を移す際に、質量スペクトルの明らかな変化を観察することができます。PC 34:4、PC 36:4、PC 38:5を含む3つの一般的な細胞脂質ピークが監視され、細胞が正常に転送され、細胞内容物が検出されることを確認します。750~850の質量範囲にある多くのPCの同一性は、未処理の細胞ライセートサンプル上でMSMSを使用して確認されています。
ICMP単一プローブMSセットアップを用いて、ジェムシタビン、タキソールおよびOSW1は、K-562細胞とのインキュベーション後に検出された。これらの結果は、この方法が、近いネイティブ環境で溶液中の細胞から単一細胞レベルで細胞内脂質、薬物、代謝産物を研究するために使用できることを示唆している。吸引が適切に適用されるように、ガラス細胞選択プローブをユニバーサルピペットホルダーにしっかりと入れておいてください。
この方法は、患者由来のサンプルにも適用して、細胞代謝産物と様々な種類の細胞タイプの違いを区別し、これらの疾患状態をよりよく理解することができます。この方法を開発した後、単一細胞レベルでの薬物化合物の定量化を実装する可能性があります。細胞を扱う場合、ラボコートや手袋など、適切な個人用保護具を持つことは重要です。
ガラスを使用する場合は、追加のアイウェアを使用できます。
概要
環境条件下でシングルプローブ質量分析法を用いた個々の懸濁細胞のオンライン分析のための統合された細胞操作プラットフォームが開発されました。この方法により、ほぼ自然環境下で細胞の異質性の研究が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 質量分析
- 単細胞分析
背景
- この技術は溶液から直接細胞を分析します。
- サンプル調製は最小限です。
- 様々な疾患状態からの液体バイオプシーの研究に適用可能です。
- 患者由来の細胞サンプルの分析を可能にします。
研究目的
- 細胞の異質性を探求すること。
- 単細胞レベルでの細胞内脂質、薬物、代謝物の分析。
- 個々の細胞のリアルタイム分析のための方法を開発すること。
使用した方法
- 細胞操作のためのテーパーガラスプローブの準備。
- 質量分析器と連携した細胞操作システムの使用。
- サンプル導入のためのナノエレクトロスプレーイオン化の適用。
- 細胞移動と分析中の質量スペクトルのモニタリング。
主要な結果
- 質量分析中の細胞内容物の成功的な検出。
- 細胞移動の成功を確認する脂質ピークの同定。
- K-562細胞におけるGemcitabineやTaxolなどの薬物の検出。
- 様々な細胞種の研究にこの方法の適用可能性の証明。
結論
- この統合プラットフォームは効果的な単細胞分析を可能にします。
- 薬物治療に対する細胞反応への洞察を提供します。
- この方法は細胞生物学のさらなる研究に利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The integration of single-probe mass spectrometry with a cell manipulation platform enables direct, quantitative analysis of drugs and metabolites in individual suspension cells from patient-derived samples. This approach addresses the challenge of studying cellular heterogeneity and drug response in a near-native environment, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The platform's minimal sample preparation and compatibility with liquid biopsies position it as a valuable asset for risk-adjusted portfolio decisions in disease biology and personalized medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying intracellular drug and metabolite levels in single cells.
- Supports biological de-risking by revealing cellular heterogeneity and functional target engagement in patient-derived samples.
- Facilitates predictive confidence and triage of targets based on direct molecular readouts from disease-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers reproducible, quantitative mass spectrometry outputs for assay standardization and benchmarking.
- Enables scalable, high-content analysis of drug uptake and metabolism at the single-cell level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling analysis of patient-isolated cells from body fluids.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting liquid biopsy and disease-state profiling.
- De-risks advancement decisions by offering direct evidence of drug action in clinically relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This platform bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling direct, quantitative analysis of single suspension cells from clinical samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through single-cell drug and metabolite profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects in heterogeneous cell populations.
- Analytics: Delivers high-resolution, quantitative mass spectrometry data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery outputs to preclinical and clinical biomarker strategies using patient-derived cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical capability for diverse disease models and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by resolving cellular heterogeneity at the molecular level.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal sample preparation and robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing actionable data from clinically relevant samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of programs based on direct evidence from patient-derived cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell manipulation, mass spectrometry, and data interpretation.
- Demands specialized instrumentation, including microinjectors, inverted microscopes, and high-resolution mass spectrometers.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and analytical protocols.
- Adaptable to various cell types and body fluids, but may require optimization for specific disease models.
- Practical limitations include throughput and the need for precise cell selection and transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Glass Cell-Selection Probe Fabrication and Integrated Cell Manipulation Platform Assembly
2:32
Couple the ICMP with a Single-Probe Setup and Suspended Cell Sample Preparation
3:58
Perform SCMS Measurements Using the ICMP/Single-probe Setup
5:57
Results: Integrated Cell Manipulation Platform Testing of Single Suspension Cells
7:07
Conclusion
