Name: 周波数領域ベースのカメラシステムを用いたO2の発光寿命イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ周波数領域発光寿命カメラを用いた2D酸素分布イメージング法。光学センサーフォイルで水生植物根圏の酸素微環境を可視化し、高い空間・時間分解能で生態学や医学研究に応用可能。

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ソフィー・リンデガード・ヤコブセン(コペンハーゲン大学)とラース・ボレガード・ペデルセン(オーフス大学)の技術支援に感謝します。この研究のための資金は、独立研究基金デンマーク(DFF-1323-00065B;)からサペレ・オード・アドバンスド助成金から得られました。MK)、独立研究基金デンマークからのプロジェクト助成金 |自然科学 (DFF-8021-00308B;MK)および技術および生産科学(DFF-8022-00301BおよびDFF-4184-00515B;MK)、デンマーク国立研究財団(DNRF136)、ポールデュジェンセン財団(KK)。

著者のゲルハルト・ホルストは、この記事で使用するカメラシステムを製造するPCO AGの従業員です。PCO AGは、この記事の公開とオープンアクセスコストに財政的に貢献しました。

このプロトコルでは、オプトード調製からO2画像解析までのワークフロー全体がカバーされます。このプロトコルに従うことで、新規な周波数ドメインベースの発光寿命カメラを用いて化学画像を得ることができる。用途に応じて、平面オプトードは、<1μm厚いセンサ層6、40の顕微鏡カバースリップに至るまで、堅牢な50〜100μmの厚い平面オプトードから顕微鏡カバースリップまで、センサ層の様々なサイズと層厚さで製造することができます。この方法の可能性は、特定の用途で実証されたが、植物根圏12、28におけるO2イメージングに限定されるものではない。
この方法は、純粋な発光強度ベースの化学イメージング方法と比較した場合、いくつかの利点があります。発光寿命イメージングは、不均一な照明、不均一な光線の厚さ、および写真漂白25の影響を受けないか、または少なくとも少ない。また、この方法は、レシオメトリックイメージング17、37で共通の追加の基準色素の使用を回避する。一般的に使用されるゲートタイムドメインカメラ8、26などの他の生涯ベースのカメラシステムと比較して、ここで提示される新しいカメラシステムおよびプロトコルは、同等の結果を提供することができる。最近の出版物では、これら2つのシステムの分析特性を比較し、周波数ドメインベースの発光寿命カメラシステムが少なくとも廃止された時間領域ベースの前身8に匹敵することがわかった。
ポリマーマトリックス中の指標のみで構成される最も単純なO2オプトデを提示した。添加剤を使用し得る可能性のある複数のO2指標20に加えて、すなわち、TiO2またはダイヤモンド粉末2などの散乱剤を含め、光大脱体の透明性を低下させながらセンサ信号を増加させる。また、追加の染料は、エネルギー移動41を介して信号強度を増強するために使用され得る。
平面オプトデ製造の場合、記載のセンサカクテル組成物を使用する場合は、75~120μmのナイフコーティング装置の隙間を使用して、溶媒蒸発後の最終センサ層厚さ約7.5~12μm(使用ギャップの約10%)を得ることをお勧めします。これは、信号強度の間の良好な妥協点であり、より高い色素の負荷によって、またはより高い輝度の指標と基準染料を選択することによって、および応答時間。層厚の増加は、周囲の媒体を有する感知層の熱力学平衡に達するために必要な期間が12増加するにつれて、応答時間の増加をもたらす。
オプトードは、ここで説明するように、十分に強い発光信号を有しつつ、数秒17秒以内にO2濃度の変化に反応する。サブ秒応答時間を持つ超薄型センサコーティングは、スピンコーティング6で実現できます。サポートまたはナイフコーティング装置が十分に洗浄されていない場合、不均一なセンサー層が生じる可能性があります。また、カクテルが完全に均質でない場合や、塗布装置の前に広がった後にあまりにも速く塗布すると、このような望ましくない結果が観察され得る。したがって、最適なオプトードを準備するためにいくつかの練習が必要な場合があります。
この方法は、特定の海洋動物42、バイオフィルム6および土壌31のような検眼に密着して置くことができるサンプルを画像化するために使用することができる。我々は、目的を使用してスタンドアロンのセットアップを提示するが、カメラは容易に高解像度の化学イメージング43のための顕微鏡に結合することができる。
時間領域ベースの発光寿命イメージングはバックグラウンド蛍光26の抑制を可能にしたが、これは新しい周波数領域ベースのカメラシステム8を用いた場合の問題である。連続的な画像集録のために、このカメラは選択されたLEDによって励起することができるサンプルの背景蛍光を記録し、カメラの目的の発光フィルターによって定義されるように選択されたスペクトルウィンドウで放出する。これは明らかに寿命が低く、結果的に誤った読み取りになります。O2センサ励起および発光と重なり合う重要な固有蛍光を有するサンプルを扱う場合、カーボンブラック2、17を含む追加の層をコーティングすることにより、光体の上に余分な光学的分離を適用することが不可欠である。したがって、平面オプトードから放出される発光のみがカメラに到達します。背景発光をチェックするために、光大脱のない画像を撮影することができ、サンプルの固有の発光を排他的に示します。また、TiO2やダイヤモンド粉末2、44などの散乱剤をセンサカクテルに添加して、指標色素の発光強度を高めることもできる。しかし、これはまた、より速い写真漂白につながる可能性があり、TiO2は、染料41の光安定性を損なう可能性のある既知の光触媒である。考慮すべきさらなる側面は、背景光です。発光寿命をイメージングする場合、背景光はできるだけ効率的に避ける必要があります。したがって、このイメージング方法では、暗い環境に配置するセットアップが必要であり、画像の取得中に外部光源を一時的にオフにする必要があります。
要約すると、発光寿命イメージングは、多くの異なる用途に適応することができる堅牢な化学イメージング法です。このプロトコル(セクション1-5を参照)は、O2画像を生成するためのすべての重要なステップをカバーし、現在最も柔軟な周波数領域発光寿命イメージングシステムを使用し、2D O2イメージング用の廃止されたゲート時間領域カメラを平面オプトードに置き換えることができます。

堆積物や土壌中の溶存ガスとイオンの分布とダイナミクスは、微生物呼吸1、2、または植物根3、4、5からの放射状酸素損失、および微生物の化学微小環境6、7、植物根圏5、8、9および動物の巣10などの生物地球化学的プロセスに関する重要な情報を提供する。11、12.このような拡散制限された環境における生物学的および化学的活性は、化学基質または生物地球化学的プロセスの産物の急勾配を作成することができる。特に、O2の利用可能性は、生物地球化学的プロセスに大きな影響を及ぼし、したがって、システム13の生物学および生態学である。したがって、高い空間分解能と時間分解能でO2濃度を解析することは、水生科学と陸上科学において最も重要である。まず、この重要な検光子を測定するために電気化学および光学マイクロセンサ14、15を開発した。その後、平面検体を用いたO2の2次元(2D)撮像を導入し、12、16、17、18、19、土壌及び堆積物中の異種O2分布の可視化及び定量を可能にした。
平面O2光体は、適切なポリマー21に溶解されるO2感受性指標色素20からなる。インジケータ染料は、特定の光波長で励起され、発光の形で緩和時に赤色シフト光を放出します。O2の存在下では、励起された指標色素は、衝突時にO2分子にそのエネルギーを伝達することができ、衝突ベースの発光消光22と呼ばれる。従って、発光強度ならびに発光寿命は、O2濃度23の増加に伴って減少する。理想的な場合には、強度と寿命の変化は、所定の濃度でO2の発光強度または寿命(I0;ƒ0)または存在(I,ƒ)のいずれかを使用して、スターン・ヴォルマー方程式(方程式1)に従います。シュテルン・ヴォルマー定数(Ksv)は、O2に対する光大脱の感度の尺度である。KSVは温度や圧力などの環境変数に依存します。
(1)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq1.jpg">
このような発光の変化をカメラシステムで平面センサ箔上に記録することで、O2分布の対応する変化を可視化することができます。当初、単純発光強度ベースのO2イメージングが18を用いた。しかし、このような方法論は外部干渉に非常に敏感であり、異種照明、励起源またはカメラの変動、ならびに平面オプトデ内の指標色素の不均一な分布による結果の信頼性を損なう。
これらの制限の一部は、比率イメージング17、24に平面光剤を用いることによって緩和することができ、O2-sensitive指標色素は、O2−指標とは異なるスペクトル範囲で放出される無感受性基準色素を有する平面光化のポリマー層に共固定される。2つのスペクトルウィンドウで取得した発光画像に基づいて、O2感受性発光信号を基準信号で分割し、上記の干渉5、17に当てにされにくい比率画像を生成する。この方法では、理想的には同じ励起源によって励起できるが、カメラの別のスペクトルウィンドウ(例えば、RGBカメラの別のカラーチャンネル)で異なる波長(有意なスペクトルの重なりなし)で放出される2番目の色素を使用する必要があります。
あるいは、O2イメージングは、指標濃度25における不均一な照明または不均一性の影響を受けない指標色素の発光寿命におけるO2−依存性変化を定量することに基づいていてもよい。第1の発光寿命ベースのO2イメージングシステムは、ゲート可能な帯電結合デバイス(CCD)カメラシステム26を用いた時間領域測定に基づいており、パルス励起源が使用され、発光画像が指標8、23、27の励起または発光内で定義された時間間隔にわたって撮影される。このような画像から、発光寿命を決定し、キャリブレーションにおける対応するO2濃度に相関させることができる。続いて、平面光十目的に押し付けられた所定のサンプルの発光寿命画像を、O2濃度の対応する2D分布の画像に変換することができる。このシステムは実験室およびsitu16、28の両方の多くの適用で使用されてきたが、本質的なゲート可能なCCDカメラはもはや市販されなくなった。
最近、周波数領域8で画像を取得する別の発光寿命カメラシステムがリリースされました。システムは励起のための連続的に変調された光源に依存する。これは、パルス励起の代わりに正弦波または方形波のいずれかであり、これは時間領域での画像集録に使用される。この変調は、角度によって位相シフトされるO2指標色素の変調発光をもたらし、定価色素の発光寿命に依存するφ(式2参照)。
(2)<img align="center" src="/files/ftp_upload/60191/60191eq2.jpg">
励起と発光振幅の変化(すなわち、いわゆる変調指数または深さ(一定の発光部分で割った振幅))も発光寿命に依存する。そこで、カメラ内の特殊なCMOSイメージセンサを既知の変調周波数に設定することにより、NSからμs範囲の発光寿命を測定することができる。操作原理に関する一般的なガイドは、次のリンク<a href="https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8" target="_blank">https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8</a>を使用して見つけることができます。.
以下のプロトコルでは、2D9、31における水生淡水植物リトレラユニフローラの根の周りにO2濃度の分布を画像化するための新規カメラシステムの使用を実証する。私たちは、この方法は決してこのアプリケーションに限定されるものではないことを強調したいと思います。酸素感受性オプトードまたはセンサ粒子27は、種々の画像化方法と組み合わせて、医学研究32、バイオプリンティング33、感圧塗料34、35、または光合成システム2、36、37を研究するために、単にいくつかの他の応用分野を挙げるために使用されている。

<table><tbody><tr><td>エアストーンとウォーターポンプ付きエアポンプ</td><td>地元の水族館の店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>DC4 シリコーンコンパウンド</td><td>ダウ コーニング GmbH</td><td>2793695</td><td></td></tr><tr><td>ガスミキサー</td><td>V&ouml;gtlin Instruments GmbH</td><td>red-y compact meter GCM</td><td>これは、可能な機器の1つにすぎません。いくつかの企業がガス混合装置を提供しています</td></tr><tr><td>ガラスプレートと水族館</td><td>地元の水族館や金物店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td></td><td>無料で利用できるイメージングソフトウェア (imagej.nih.gov/ij/index.html)</td></tr><tr><td>ナイフコーティング装置</td> <td> BYK-GARDNER GMBH</td><td>byk.com 2021</td><td>フィルム厚のバリエーションが容易な4面フィルムアプリケーターです。他のバージョンもご用意しています。適用するフィルムの厚さは75〜120〜マイクロをお勧めします。m、これにより、溶媒蒸発前の塗布された厚さの~10%の最終的なセンサー層の厚さが得られます。</td></tr><tr><td>LEDランプ、リフレクターPAR38</td>ロック<td>マン</td><td>MM17572</td><td></td></tr><tr><td>LEDHUBオ</td><td>ミコンレーザー、ドイツ</td><td></td><td>さまざまなLEDで構成できます。提示された例では、緑色のLED(528 nm)が必須です</td></tr><tr><td>LOCTITE AA 3494</td><td>Henkel AG & Co. KGaA</td><td>NA</td><td>アクリルベースの瞬間接着剤</td></tr><tr><td>NIS Elements AR ソフトウェア</td><td>Nikon Inc</td><td></td><td>画像取得に使用されるソフトウェアパッケージ</td></tr><tr><td>pco.flim</td><td>PCO AG、ドイツ</td><td></td><td>周波数領域ベースの発光寿命カメラ</td></tr><tr><td>プラチナ(II)-5,10,15,20-テトラキス-(2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェニル)-ポルフィリン(PtTFPP)</td><td>フロンティアサイエンティフィ</td>ック <td>PtT975</td><td>O2 インジケーター</td></tr><tr><td>ポリエチレンテレフタレート(PET)箔</td><td>Goodfellow</td><td>320-992-72</td><td>このような箔は、他のプロバイダーからも見つけることができ、固体サポートとして機能する可能性があります</td></tr><tr><td>ポリスチレン(PS)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>9003-53-6</td><td>ポリマーマトリックス</td></tr><tr><td>ショットRG610フィルター</td><td>www.uviroptics.com</td><td></td><td>ここでは52mmのネジオンフィルターが得られます。他のソースは、対物レンズ</td></tr><tr><td>のビニール電気テープ</td><td>スコッチ、スーパー33 +</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ツァイスMakro Planar 2/100とニコンアダプターのハマCと</td><td>カメラ</td><td></td>と一緒に配信されたショットガラスから正方形のガラスフィルターを提供しています <td>ここでは、他の任意の対物レンズも、対物レンズがCマウントを持っていない場合、アダプターと組み合わせて使用</td></tr></tbody></table>することができます

周波数領域ベースのカメラシステムを用いたo2の発光寿命イメージング

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

高空間(<50~100μm)および時間(<10s)分解能で2Dで溶存酸素(O2)を画像化する方法について説明します。この方法は、周波数領域の発光寿命をイメージングするための特殊なカメラシステムと組み合わせてO2感受性発光センサ箔(平面オプトード)を採用しています。平面オプトードは、O2感受性指標色素をポリマーに溶解し、ナイフコーティングを介して定義された厚さで固体支持体上に混合物を広げることによって調製される。溶媒の蒸発後、平面光体は、目的の試料と密接に接触して配置される- ここでは、水生植物リトレラウニフローラの根で実証した。平面光十動内の指標色素の発光寿命におけるO2濃度依存性変化は、特殊カメラを用いて透明キャリア箔と水族館壁の裏側を介して画像化される。このカメラは、変調励起信号と発光信号の間の位相角のシフトを介して発光寿命(μs)を測定します。この方法は、信号が励起源の色素濃度または強度に依存せず、本質的に参照されるパラメータである発光減衰時間にのみ依存するので、発光強度イメージング方法よりも優れています。したがって、追加の参照染料やその他の参照手段は必要ありません。植物根圏のマクロ的O2イメージングにシステムを使用する方法を実証していますが、カメラシステムを顕微鏡に簡単に結合することもできます。

新しいイメージングシステムの応用例として、複雑な生体試料(すなわち、水生植物リトレラユニフローラの根圏)の2DO2イメージングを示す。
まず、平面センサフィルム、いわゆる平面検眼体の製造方法を記載する。図1に見られるように、このような光体は、透明な支持体に広がるポリマーマトリックス中の光学指標の薄層からなる。記載されたプロトコルに従うことによって、均一な厚さの均質なセンサフィルムが、ナイフコーティング装置の隙間によって定義される、得られる。生成されたオプトードにパッチ状のセンサー材料分布(例えば、コーティングの穴、ストライプ、または色素凝集体を示す)がある場合は、プロトコルを繰り返し、すべての材料をアセトンを使用して完全に洗浄する必要があります。
平面オプトードが調製されると、サンプルは平面オプトデの感知層と密接に接触し、ここに示すように、根茎サンドイッチチャンバーに統合された平面オプトデと、周囲の堆積物マトリックス内の植物の根を平面オプトデに密接して配置することができる(図2)。正しく準備された場合、根茎サンドイッチチャンバーは、1つの水族館(インキュベーション)から他の水族館(測定)に容易に移動可能でなければなりません。正しく構築されていない場合、根茎サンドイッチチャンバーは不安定である、堆積物を失うか、気泡を含む可能性があります。このように組み立て直後の根茎サンドイッチチャンバーの目視検査をお勧めします。
与えられたプロトコルは、周波数ドメインベースの発光寿命カメラを使用して、平面光十種と接触するサンプルの周波数ドメインベースの発光寿命イメージングを可能にします。画像取得のモードや科学的相補型金属酸化物半導体(SCMOS)カメラ特性などのこのカメラシステムの詳細は、最近の出版物8、29に記載されている。
セットアップ自体はかなり単純で、光源(この場合は LED 励起ソース)を制御するカメラと、オプトデを持つサンプル(図3)のみが含まれます。すべての部品が正しく接続されていること、およびサンプルが均一に照らされていることを確認します。測定を事前に形成する間、背景光は避ける必要があります。
サンプルをイメージングする前に、オプトードを校正する必要があります。図4Aに見られるように、測定された発光寿命は、準指数減衰後のO2濃度の増加に伴って減少する。この関係は、簡略化された2サイトモデル(図4Bおよび方程式3)を用いて記述することもできる。所定の例では、O2濃度を計算するために必要なパラメータは以下の手順に従いました。ƒ0 = 56.26 μs、Ksv = 0.032 hPa-1および f = 0.86。
キャリブレーションを実行することは、システムが正常に動作していることをテストする理想的な方法でもあります。ここで説明したように (または製造元のガイドライン内で) すべてのコンポーネントがインストールされている場合、測定された有効期間は図 4に示すように同じ O2依存性を示す必要があります。さらに、O2センシング材料(ポリマーと染料)の同じ組み合わせの場合、測定されたƒ0はここで測定したのと同じ範囲(±数μs)でなければなりません(主に実験温度の影響を受ける)。同様のキャリブレーション曲線を取得できない場合は、すべてのステップが正しく実行されていることを確認します。オプトードが誤ってサンプルではなくガラス壁に面した敏感な側面で固定されたり、取得した画像が露出過多または露出不足になることがあります。
キャリブレーションパラメータを用いることで、発光寿命(ƒ)を撮像することによりO2濃度を決定することができる。これは図5A,Bで示され、リトレーラ・ウニフローラの根圏におけるO2濃度の分布を暗闇の中で画像化し、12時間500μmol光子m-2 s-1に光を浴びてから撮影した。植物の光合成活性のために、リゾスフィア中のO2濃度は光暴露後に増加した。生涯画像に加えて、画像ジオメトリを固定したまま、外部照明下で「構造」画像を取得することもできます。このようにして、O2画像は、構造画像(図5C)、断面または目的の領域と正確に相関させることができる。一例として、単一の根を横切るO2濃度プロファイルを、それぞれ暗闇と光で取得した画像から抽出した(図5D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig1a.jpg"> 図1:平面O2光大脱の製造(A) PET箔をガラス板に固定し、ナイフコーティング装置をホイル上に置く。(B)調製したセンサーカクテルは、ナイフコーティング装置の前の細い線としてPET箔に広がる。(C)ナイフコーティング装置は、センサーカクテルをPET箔上の薄膜として広げるために下方に移動し、溶媒蒸発後に平面光を使用する準備が整いました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig2a.jpg"> 図2:平面O2検眼の統合を有する根蔵サンドイッチチャンバーアセンブリ。(A) 光大脱は、水膜を用いてガラス板の1つに固定される。(B) 光大脱を電気テープでプレートに接着する。(C)堆積物は、付属のスペーサー(すなわち、顕微鏡スライド)で反対側のプレートに充填される。(D) 植物の根は均等に広がった堆積物の上に置かれる。(E) 根茎サンドイッチ室は閉じられ、クランプで一時的に固定されています。(F)完全に閉じ、組み立てられた根茎サンドイッチ室。(G)インキュベーションランプによる光暴露から光を保護し、藻類の成長を避けるために、組み立てられた根茎サンドイッチ室の上にプラスチックカバーが置かれる。(H) ライゾサンドイッチ室を水族館でインキュベートした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig3a.jpg"> 図3:透明な水族館と根茎サンドイッチ室壁を介して後ろからオプトードを持つサンプルに焦点を当てた目的で、周波数ドメインベースの発光寿命カメラを含むイメージングセットアップ。LED励起源の導光ガイドは、サンプルを均等に照らすために配置されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig4a.jpg"> 図4:平面O2光大解のキャリブレーション曲線(A)水で満たされたキャリブレーション室内のそれぞれのO2濃度で測定された異なるリン光寿命。(B)動的衝突焼入れ用の簡略化された2サイトモデルを用いて適合した較正データのスターン・ヴォルマープロット(式3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig4alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60191/60191fig5a.jpg"> 図5:水生植物リトレラユニフローラの根圏におけるO2分布の生涯イメージング(A)O2は、約500μmol光子m-2 s-1で植物を12時間光の下に保った後の分布である。(B)O2は、平面検眼を通して見た植物根の構造像を1時間(C)暗闇の中に保った後の分布である。(D)断面O2濃度プロファイル(位置は、光(赤)で12時間後、暗闇(黒)で1時間後にパネルAとBの黄色い線で示されます。(コレン、K.、モスハンマー、M.、ショルツ、V.V.、ボリソフ、S.M.、ホルスト、G.、キュール、M.ルミネッセンス化学センサーの生涯イメージング - 時間領域と周波数領域ベースのカメラシステムの比較から適応。分析化学.91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs.analchem.8b05869 (2019)。著作権 (2019) アメリカ化学会.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60191/60191fig5alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

2DO2分布を光学センサ箔でマッピングするための新規な周波数領域発光寿命カメラの使用について説明します。カメラシステムと画像解析手順は、水生植物の根圏におけるO2微小環境を可視化するためのセンサ箔の調製、キャリブレーション、および適用と共に説明されています。

周波数領域ベースのカメラシステムを用いたO2の発光寿命イメージング

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

最高の電子アクセクターとして、酸素は生物学的システムにおいて重要な役割を果たします。このプロトコルを使用すると、オプトデを使用して2Dで酸素分布をイメージすることができます。高い空間分解能と時間分解能に加えて、この方法は追加の参照色素を必要とせず、非常に堅牢であり、構造画像の取得を可能にする。この方法は、酸素が生態学、医学研究、バイオプリンティング、感圧印刷などの重要な役割を果たす研究分野に適用できます。サポートホイルとナイフコーティング装置のドラッグ速度に追加されるカクテルの量は、最適化と実践を必要とすることができるので、光度の製造は困難な場合があります。このビデオの投稿により、この強力な技術を他の研究分野の研究者が利用できるようにしたいと考えています。平らな酸素オプトデを準備するには、まず水または70%エタノールのフィルムを使用して、きれいなガラス板にきれいなほこりのないPETホイルを固定します。ホイルに清潔な120マイクロメートルのナイフコーティング装置を置き、ガラスピペットを使用してデバイスの前面にセンサーカクテルのラインを適用します。次に、PETホイルの上にゆっくりと均一にナイフコーティング装置をドラッグして、カクテルを均等に広げます。その後、完成した平面酸素感受性光物を周囲の空気中で1時間乾燥させてから、加熱されたキャビネットで摂氏50~60度で一晩乾燥させます。翌朝までに、約12マイクロメートルの厚層が得られる。光から保護された光を、さらに使用するまで保管してください。根茎サンドイッチチャンバーを準備するには、軽い硬化性アクリルベースのインスタント接着剤を使用して、1つの長いエッジを開いたままにしてガラス板の端に沿って顕微鏡スライドを接着します。接着された顕微鏡スライド間のスペースに収まるように、必要な形状とサイズに平面のオプトデをカットし、上向きにコーティングされた側面とフロントガラスプレートの内側にオプトデを配置します。ガラス板にオプトデ箔の1つの端をテープし、ガラス板とオプトデ箔の間に水道水を加えます。ゆっくりと水滴にホイルを下げ、検眼機がガラス表面にまっすぐにし、柔らかい組織を使用して、オプトデとプレートの間に閉じ込められた気泡を慎重に取り除きます。その後、ガラス板を乾かして拭き取り、残りのホイルの端をプレートにテープで貼ります。次に、平らなガラス板を使用して、0.5ミリメートルのふるいの堆積物を顕微鏡スライドスペーサーと同じ厚さにプレート全体に均等に分配します。慎重に顕微鏡スライドの上面を洗浄し、第2のガラス板がチャンバーを適切に密封し、シリコングリースを顕微鏡スライド表面に塗布するようにします。その後、慎重に気泡の形成を避けながら、水の薄膜で堆積物をカバーしています。サンプルを堆積物の上に置く前に、リトレーラ・アンイフローラの1回の撮影を慎重に洗い、上の開いた側から葉が突き出た土砂に撮影を置きます。サンプルが所定の位置にある場合は、オプトデ付きのガラス板を堆積物の上に置き、穏やかな圧力をかけ、植物の根と周囲の堆積物と密接に接触するようにします。クランプを使用してプレートを一緒に固定し、ティッシュペーパーで外側の端を乾燥させます。根茎サンドイッチの組み立て全体に植物を水分補給し、ビニール電気テープを使用して根茎サンドイッチチャンバーを締めるために葉に水を数滴繰り返し加えます。次に、モデリング粘土と追加の電気テープでエッジを密封します。イメージングの準備として、インキュベーション後に光板領域からカバーホイルを取り出し、光板を水槽の壁に直立したガラス壁に根茎サンドイッチチャンバーを配置します。壁に対して根茎サンドイッチチャンバーを押すためにスペーサーを使用してください。水族館と対象領域の前に目的を装備した周波数ドメインベースの発光寿命カメラを配置します。インジケータの色素をカメラの目的にイメージングするための適切なエミッションフィルタを取り付け、LED励起源の導光部を固定します。次に、ガイドを配置して、対象領域を覆う平面光化箔を均等に照らします。イメージングソフトウェアでカメラを選択し、LED制御ソフトウェアでLEDを選択します。必要に応じて LED の強度を設定し、アナログと同期を刻んで、外部トランジスタ/トランジスタ ロジックによって LED がトリガーされることを確認します。カメラを手動でフォーカスし、目的の絞りを調整し、内部変調源、出力波形の正音波、追加の位相サンプリング、8相サンプル、逆の位相、A B読み出し、5キロヘルツ変調周波数を設定します。正規化された発光強度画像の対象領域統計読み出しが 0.68 ~ 0.72 の範囲になるまでの露光時間を調整します。次に、[参照をキャプチャ] をクリックして、参照測定シリーズの取得を開始します。光を較正するには、ガス混合装置を使用して、酸素センサーを用いて外部プローブで酸素濃度を監視する既知の酸素濃度を持つ周囲空気窒素ガス混合物を用いて、校正水槽内の水を洗い流します。次に、キャリブレーションチャンバー内の異なる酸素濃度で一連の画像を取得し、取得したキャリブレーションデータに適切なカーブフィットを得ます。システムが較正されたら、植物および他のすべての光源に照射するライトを消し、画像の強度に基づいて取得時間を調整し、信号が過飽和でも弱すぎもないようにして、寿命決定において良好な信号対雑音比を確保します。すべての酸素寿命画像が取得されたら、ライトを再びオンにして構造画像を取得し、視野の定規を持つ画像を取得して、取得した画像の後続のスケーリングを可能にします。サンプルをイメージングする前に、光は較正する必要があります。準指数関数的な崩壊の後、測定された発光寿命は酸素濃度が増加するにつれて減少する。この関係は、簡略化された 2 つのサイト モデルを使用して記述することもできます。光量が較正されると、リトレージャ・アンイフローラの根層圏における酸素濃度の分布が12時間及び12時間後に毎秒500マイクロモル光子に光を浴びた後に画像化されたこれらの画像で観察された発光寿命を画像化することによって酸素濃度を決定することができる。寿命画像に加えて、イメージングジオメトリを固定したまま、外部照明下で構造画像を取得して、酸素イメージングを構造画像と正確に相関させることができます。例えば、単一の根を横切る酸素濃度プロファイルは、暗闇と光の中で取得した画像から抽出することができます。不要なアーティファクトを避けるために、サンプル行列と検眼との間に良好な接触を持つことは重要です。疑問がある場合は、サンドイッチを作り直してください。非破壊的な方法で画像を瞬時に取得することで、酸素環境のモニタリングが可能になります。この方法は、pHまたは他の検体の他の検眼と組み合わせられるかもしれません。センサーカクテルにはクロロホルムが含まれているため、フュームフードで光物加工を行ってください。平面オプトデは、堆積物中の微生物群集を同定するために使用することができる。そして、イメージングの後、サンドイッチは微生物群集分析のためにこれらのホットスポットをサンプリングするために開くことができる。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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周波数領域ベースのカメラシステムを用いた_O2の発光寿命イメージング

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