Name: 蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 学ぶ蛍光光活性化局在顕微鏡（FPALM）によるナノメートル精度の複数タンパク質同時イメージング法。固定細胞と生細胞の両方で数千個の蛍光標識タンパク質を高解像度で可視化し、細胞内タンパク質の局在動態を分子レベルで研究する。

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著者は、コンピュータプログラミング、技術支援、有用な会話を提供してくださったPhilip Andresen氏、Matthew Parent氏、Sean Carter氏、および管理支援を提供してくださったPat Byard氏に感謝します。この研究は、NIH Career Award K25-AI65459、NIH R15 GM094713、NSF MRI CHE-0722759、Maine Technology Institute MTAF 1106 and 2061、およびMaine Economic Improvement Fundによって資金提供されました。

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H.とM.J.M.は、超解像顕微鏡の特許を保有しています。S.T.H.は、Vutara, Inc.の科学諮問委員会のメンバーを務めています。

ローカリゼーションベースの超解像イメージングは、生物学的イメージングに多くの強力な機能を提供します。テーブル上に配置された個々の光学部品から、生体サンプル中の複数の蛍光種を同時にイメージングできる機能的な超解像顕微鏡までのルートには、多くの課題があります。アライメントの一部の側面は、他の側面よりも重要です。以下では、ルートの最も困難な側面に対処する将来のユーザーにガイダンスを提供するよう努めます。
重要なステップ
FPALMや同様の技術によって提供される画像解像度の向上には、顕微鏡の安定化にもっと注意を払う必要があります。従来の顕微鏡画像は、~20〜50 nmのスケールでのサンプルドリフトや振動運動(振動)によって目に見えて歪むことはありませんが、超解像顕微鏡画像はそのような動きによって劣化します。たとえば、不要な動きの原因には、顕微鏡およびサンプル内の熱勾配、エアテーブルに取り付けられた機器の冷却ファン、顕微鏡ステージまたはエアテーブルへの物体の不注意な接触、および建物内の振動(空気処理装置やその他の機械によって引き起こされる可能...

細胞構造は広範囲の空間スケールで存在しますが、回折限界の物理的制約により、~250 nm未満の長さスケールでの細胞組織の蛍光イメージングは従来の顕微鏡では制限されています。この限界は、蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM1)や類似の技術2,3の出現により克服され、多数の個々の分子を~10 nmの精度で局在化し、数十ナノメートルの分解能で画像を生成できます。FPALMは、光学制御を使用して分子のサブセットを活性化および不活性化することに基づいています(FPALMの詳細な説明、およびこのイメージングシステムの実装方法については、Gould et al.4)この技術により、単一分子の全集団の空間分布をマッピングすることができ、数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さスケールで生体構造を解明することができます。ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡法(以下、ローカリゼーション顕微鏡法と呼ぶ)は、現在、さまざまな生物学的問題に対処するために適応されており、技術開発により、例えば、偏光FPALMによる個々の分子配向のイメージング、またはP-FPALM5、複葉剤FPALM6または他の技術7-9による3次元の単一分子の蛍光イメージングが可能になったローカリゼーション顕微鏡は、生細胞10-12における単一分子の超解像蛍光イメージングにも適用されています。ローカリゼーション顕微鏡は、固定細胞13-16の複数の種のイメージングにも適用されています。最近、3つのタンパク質種が固定細胞と生細胞の両方でFPALMで同時にイメージングされました17。ローカリゼーション顕微鏡は、さまざまな方法で標識されたサンプルをイメージングできます。 例としては、PAFPまたはPSFP融合タグで発現したタンパク質、ケージ入り有機色素で標識した抗体または分子、または従来の有機色素が含まれます。従来の蛍光色素の使用は、融合タンパク質タグの不在下でのタンパク質の標識を可能にする一方で、超解像イメージングにおける非ケージ有機色素の使用に一般的に必要とされる条件では、サンプルを還元バッファーに浸漬する必要があります2. さらに、抗体色素複合体の細胞内送達では、通常、細胞を固定し、その膜を透過処理する必要があります。 または、生細胞がエレクトロポレーションまたはその他の手段によって透過性にする必要があります。バッファー条件と膜透過化を減らすための要件により、有機色素の生細胞イメージングへの適合性は制限されますが、最近の開発により、HaloTagとFPALMを膜構造のイメージングに効果的に使用できるようになりました18。
FPALMは、生細胞に適用された最初の局在化顕微鏡技術でした10。生細胞では、標識された分子の位置の時間依存的な空間マップを提供するだけでなく、FPALMは複数のフレームにわたって単一分子を追跡し、ミリ秒の時間スケールで決定された分子の軌跡を追跡することができます19。したがって、FPALMは、かなり短い時間スケールとナノスケールの分解能へのアクセスを提供します。
Multicolor FPALMは、光活性化可能なタンパク質や有機ケージまたはノンケージ色素など、さまざまなプローブに使用できます。ここでは、2つの蛍光タンパク質種、Dendra2およびPAmCherryの同時イメージングのためのプロトコールとセットアップについて詳しく説明します。NIH-3T3線維芽細胞において、βアクチンに結合したPAmCherry(PAmCherry-actin)とインフルエンザ赤血球凝集素に結合したDendra2(Dendra2-HA)をイメージングした結果を報告する。セットアップで説明されているコンポーネントは、他のプローブのイメージングにより適した他のハードウェアと交換できます。この場合、テキストで明示的にするように努めました。
Multicolor FPALMは、生細胞または固定細胞内の複数のタンパク質種の空間分布を報告するのに理想的です。この手法は、ナノメートルの長さの空間スケールでの空間的および/または動的な関係の調査に特に適していますが、画像は数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さのスケールで局在を報告します。マルチカラーFPALMの主な利点の1つは、セットアップが比較的安価に構築でき、さまざまなプローブの組み合わせに非常に柔軟に使用できることです。コンポーネントからシステムを構築し、キャリブレーションするプロセスでは、データの品質と解釈可能性、ひいては研究成果を損なう可能性のある要因についても、かなりの理解を得ることができます。ここでは、FPALMを使用して、PSFPおよびPAFP融合コンストラクトを使用して、複数のタンパク質種の光学セットアップ、サンプル調製、およびデータ取得の方法について詳しく説明します。このプロトコルは固定細胞の分析を説明していますが、これらの手順は生細胞のイメージングに容易に適用できます。
ここで説明する光学セットアップは、PSFP Dendra2 と PAFP PAmCherry の同時イメージングに最適です。他の多くのプローブをマルチカラーイメージングに使用できます。ただし、必要な正確なコンポーネントは、選択したプローブの励起スペクトルと発光スペクトルによって異なる場合があります。ダイクロイックミラー、フィルター、レーザー波長の選択は、これらの考慮事項に基づいて行う必要があります。

<table><tbody><tr><td>LabTek IIチャンバー</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>キャリブレーション用ビーズ</td></tr><tr><td>テトラスペックビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>キャリブレーション用4色ビーズ</td></tr><tr><td>対物レンズ 浸漬油</td><td>ツァイス</td><td>518F</td><td>高NA対物レンズ用浸漬オイル(対物レンズの選択による)</td></tr><tr><td>HPLCウォーター</td><td>フィッシャー科学</td>的な<td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>媒体</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>またはCellgro 10-090</td></tr><tr><td>抗生物質</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>リポフェクタミン</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>1689149<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AA433689M</td><td>注意:有毒</td></tr></tbody></table>

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を適用すると、サンプル内の個々の蛍光標識単分子の分布の空間マップ(画像)を数十ナノメートルの空間分解能で取得できます。蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)は、目的のタンパク質に融合した光活性化可能(PAFP)または光切り替え可能(PSFP)の蛍光タンパク質、または抗体やその他の目的分子に結合した有機色素を使用して、単一細胞内の複数種の分子を同時にイメージングできます。以下のアプローチを用いることで、多数の(数千から数十万)の個々の分子の集団を単一細胞でイメージングし、10~30nmの精度で局在化します。得られたデータは、細胞内の複数のタンパク質タイプのナノスケールの空間分布を理解するために適用できます。この技術の主な利点の1つは、空間分解能の劇的な向上です:従来の光学顕微鏡では回折によって分解能が200~250nmに制限されますが、FPALMは長さのスケールを一桁以上小さくすることができます。多くの生物学的仮説は異なる生体分子間の空間的関係に関係しているため、FPALMの分解能の向上は、従来の蛍光顕微鏡ではアクセスできなかった細胞組織の問題に対する洞察を提供することができます。ここでは、サンプル調製とデータ取得の方法について詳しく説明するだけでなく、FPALMの光学セットアップについても説明します。超解像顕微鏡法を希望する研究者にとってのもう1つの考慮事項はコストです:社内のセットアップは、ほとんどの市販のイメージングマシンよりも大幅に安価です。この手法の限界には、細胞サンプル内の目的分子の標識を最適化する必要性や、結果を視覚化するための後処理ソフトウェアの必要性などがあります。ここでは、PAFPおよびPSFP発現を使用して、固定細胞内の2つのタンパク質種をイメージングする方法について説明します。また、この技術の生細胞への拡張についても説明する。

インフルエンザ血凝集素（HA）は、数十ナノメートルからマイクロメートルオーダーのクラスターを形成し、これらのクラスターはアクチンと様々な度合いで共局在します（図5）。これらの空間分布は、これら2つのタンパク質に関するより粗いスケールのイメージング結果28、およびHAの空間分布のアクチンへの依存性19を裏付けるものです。多色FPALM画像を用いることで、これらのクラスターの密度、面積、周囲の長さ、およびナノスケールとマイクロスケールの両方における2つの分子種間の共局在度をさらに記述することが可能です。得られた画像の解像度は数十ナノメートルオーダーです1,17。ここに提示したレンダリング画像では、画像上の個々の点は、単一の標識タンパク質分子の局在を20 nmの精度で表しています。透過光光源を用いて全視野（FOV）の画像を追加で取得することで（図6）、FPALM画像を細胞全体およびその周辺環境との関係において観察することができます。
上述の2色セットアップ...

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

本手順の全体的な目的は、固定細胞または生細胞において、複数のタンパク質種をナノメートル精度で同時にイメージングすることです。まず、顕微鏡からのフォーカスされた画像がカメラチップ上に投影されるまで、カメラと光学系の位置を調整します。次に、レーザービームが顕微鏡ステージ上の試料に直接整列するように配置します。次に、準備した細胞サンプルに光を照射し、目的のタンパク質を発現している細胞を選択します。最終ステップとして、サンプルにレーザーを照射し、細胞の蛍光をカメラチップに導いてデータセットを取得することで、蛍光光活性化局在化顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。最終的に、蛍光光活性化局在化顕微鏡を用いることで、固定細胞または生細胞において、ワイドフィールドまたは全反射照明蛍光を用いてサンプルの薄い領域を分離した状態で、ナノメートル空間スケールでの複数種のタンパク質の局在を示すことができます。共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、固定細胞または生存細胞において、複数のタンパク質をナノメートル分解能で同時にイメージングできることです。以下の手順では、付属のテキストプロトコルの図1に示されている多色F Omセットアップの概略図に基づく番号体系を参照します。顕微鏡の調整を開始するには、10x対物レンズを装着し、ランプを透過光に設定した状態で、校正スケールまたは定規を顕微鏡ステージの上に配置してください。垂直線を視野の中心に合わせます。次に、フィールド絞りを閉じ、接眼レンズを通して垂直方向を確認し、顕微鏡の照明を調整します。フィールド絞りの縁にピントが合っていない場合は、フィールド絞りとレッドル（redle）の両方にピントが合うまでコンデンサーの高さを調整します。次に、フィールド絞りが視野の中心に位置するように水平方向の位置を調整し、レッドルの中心グリッドのみが照らされるまでフィールド絞りを閉じます。これらのコンポーネントを初めて組み立てる際は、各チャネルの光路長が等しくなるように調整してください。これを実現するには、カメラチップ上の赤色を調整し、ミラー7とミラー9を調整して検出アパーチャを閉じ、2つのチャネル間の空間的な重なりを防ぎます。その後、反射光チャネルでラジカルの像にピントを合わせ、透過光チャネルでも同様にピントが合っているかを確認してください。透過光チャネルの画像にピントが合っていない場合は、ラジカル画像が両方のチャネルで同時にピントが合うまでミラー9を移動させます。レーザーの調整を開始するには、レーザー光路からレンズ1を取り外し、活性化ビームおよび読み出しビームを遮断します。次に、ミラー4にホワイトカードを密着させ、顕微鏡のシャッターを開き、ミラー4の前にあるカード上にラジカル画像が投影されるまでピントを合わせます。次に、読み出しビームの遮蔽を解除し、ミラー1を調整して、ミラー4にあるラジカル画像の十字線上に読み出しレーザーを合わせます。中心に合わせた後、ラジカル画像をミラー5に投影し、ビームがミラー5の画像の十字線の中央に位置するようにミラー4を調整します。これで、読み出しビームがM4とM5の両方で中心に配置されたことになります。次に、シャッター1を閉じて読み出しビームを遮断します。続いて、ラジカル画像をミラー3に投影します。レーザー光路からビームエキスパンダーを取り除き、活性化レーザーの遮断を解除します。次に、ミラー2を調整し、活性化ビームをミラー3上のラジカル像の十字線に中心合わせします。中心が合ったら、ミラー2と3の間にビームエキスパンダーを再度設置し、ビームがラジカル像の十字線の中央に来るまでビームエキスパンダーの位置を調整します。ミラー3でラジカル像をミラー5に投影し、焦点を合わせます。顕微鏡のフォーカスノブを使用して、活性化ビームが赤色イメージの中心に位置するまで、ダイクロイックミラー1の角度を調整します。次に、対物レンズを装着せず、顕微鏡シャッターを開いた状態で、シャッター2を閉じて活性化レーザーを遮断します。読み出し用シャッターであるシャッター1を開き、レーザーを顕微鏡の後方開口部から投影させます。ミラー5を調整し、ビームが顕微鏡から出るようにします。これにより、レンズ1と対物レンズを元の位置に戻した状態で、ビームが顕微鏡から垂直に射出されるようになります。活性化レーザーを遮断した状態で、100 µMのブロミンBを含むサンプルをステージ上に配置します。読み出し用レーザーを60倍の対物レンズを通して色素に照射します。電子増倍ゲインを無効にした状態で、この画像をカメラに送信します。次に、対物レンズをサンプルに合わせ、フォーカスを調整します。ビームプロファイル全体をイメージングできるよう、アパーチャを十分に開きます。次に、ビームプロファイルの中心とアパーチャが同心円状になるように、アパーチャを横方向に移動させます。カメラソフトウェアを使用して、両方のチャンネルを包含する最小のカメラ読み出し領域となる関心領域（ROI）を選択し、これらの座標を記録してください。この時点で、読み出しビームプロファイルを代表するスナップショットを1枚記録します。次に、シャッター1を閉じて読み出しレーザーを遮断し、シャッター2を開きます。活性化ビームプロファイルの測定を開始するために、活性化レーザーをサンプルに照射します。必要に応じて、電子増倍ゲインを100未満に設定し、ビームが各視野の中心にくるまで第1ダイクロイックミラーを調整してください。次に、多色F-palm画像の取得を開始するために、活性化ビームプロファイルのスナップショットを記録します。室内の照明をすべて消灯します。その後、フリップマウントを介して水銀ランプの光を形質導入細胞に照射し、フィルターキューブを、プレフォトスイッチ状態の適切な励起波長を含むものに変更します。細胞を選択したら、フリップマウントを下げてレーザーが顕微鏡内に通過できるようにし、付属のテキストプロトコルに従って、イメージングに適したダイクロイックミラーを含むフィルターターレットに切り替えます。次に、この画像をカメラに投影し、背景蛍光からトランスフェクトされた細胞を区別し、分子が光活性化可能であることを確認します。その後、活性化レーザーを用いて、10 micro watts未満の低出力でサンプルを短時間照射します。次に、電子増倍ゲインを200に、フレーム数を5から10,000の間に設定し、キネティックシリーズ取得に向けてカメラソフトウェアを準備します。また、露光時間を10から30ミリ秒の間に設定します。その後、活性化ビームを遮断し、読み出しビームの遮断を解除して、照明された細胞の画像をカメラに投影します。個々の分子が見えなくなるまでフォーカスを下げ、細胞膜の底部付近の焦点面を選択します。その後、分子が再び見え始めるまで、徐々にフォーカスを上げていきます。次に、活性化ビームの遮蔽を解除し、1 W/cm²未満の強度でサンプルを照射します。活性化レーザーの前にある中性密度フィルターを動的に調整し、1平方ミクロンあたり0.1から1個の可視光光分解性分子の密度を維持しながら、カメラソフトウェアを通じてこれらのデータの収集を開始します。全反射蛍光イメージングを行う場合は、ミラー5とレンズ1を単一の移動ステージに取り付け、顕微鏡の入口のすぐ後ろで横方向に移動できるようにします。ミラー5とレンズ1を移動させると、対物レンズからサンプルを通過して上方に射出されるレーザーが徐々に片側に傾きます。レーザーの角度が垂直から90度になるまで、ステージの移動を続けてください。この時点で、出射レーザー自体は消失し、入射レーザーは入射ビームと逆平行に、かつ側方にずれた状態で開口部へと後方反射されます。画像取得が完了し、サンプルが全反射蛍光状態に入ると、背景光の減少が確認できるはずです。すぐに顕微鏡のシャッターを閉じ、両方のビームを遮断してください。電子増倍ゲインを無効にします。カメラを1フレーム記録に設定し、カメラの読み出し領域を最大サイズに設定します。最後に、顕微鏡ランプに装着したロングパスフィルターを用いて、F3またはF4の上にカードを置いて1つのチャンネルを遮断します。サンプルを照明し、この画像をカメラに投影します。透過光下で細胞全体を代表するスナップショットを記録します。ここでは、DENDRA 2 HemagglutininとPAM Cherry actinの両方を発現しているNIH 3T3細胞の2色F-PALM取得例を示します。左側の透過光チャンネルは、右側の反射光チャンネルよりも長い波長を含んでいます。ここでは、背景減算および左右チャネルのオーバーレイ変換後の、同一の2色F OM取得画像のスナップショットを示します。個々の分子を識別し、局在化させることができます。透過チャネルでより明るく見える分子もあれば、2つのチャネル間で放出がより均等に分布している分子もあります。これはPAM cherryとDENDRA twoのそれぞれにおける放出スペクトルの違いを示しており、解析においてこれら2つの種を識別するために用いられます。ここに示すヒストグラムは、許容範囲を適用した後のすべての局在化分子について、赤色透過チャネル強度を全強度で除した比率を示しています。ピクセルは、左下の画像では白く見え、右下の最終合成画像では赤く見えます。一方、緑色領域のピクセルは、右上の画像では白く見え、右下の最終合成画像では緑色に見えます。レンダリング時に選択するしきい値レベルは、ノイズの程度や共局在の見た目に大きく影響します。ここでは、ブリードスルーの程度が異なる3つの異なるレンダリングオプションを示しており、下2つに最も保守的なしきい値レベルを示しています。Color F palm alpha ヒストグラムは、画像内に2つの識別可能なピークがある場合に最も解釈しやすくなります。左側のヒストグラムはさらなる解析の候補として適していますが、他の2つのヒストグラムから得られる画像は、この手順に従うと解釈が非常に困難になります。タンパク質が生存細胞膜のナノスケールでどのように構成されているかといった追加の疑問に答えるためには、全内部反射顕微鏡法やライブセルイメージングなどの手法を用いることができます。このビデオを視聴することで、独自のFAR顕微鏡をセットアップし、データ acquiring に使用する方法を十分に理解できるはずです。レーザーの使用は極めて危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する前に必ず安全トレーニングを完了させてください。

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