Name: 蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 学ぶ蛍光光活性化局在顕微鏡（FPALM）によるナノメートル精度の複数タンパク質同時イメージング法。固定細胞と生細胞の両方で数千個の蛍光標識タンパク質を高解像度で可視化し、細胞内タンパク質の局在動態を分子レベルで研究する。

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著者は、コンピュータプログラミング、技術支援、有用な会話を提供してくださったPhilip Andresen氏、Matthew Parent氏、Sean Carter氏、および管理支援を提供してくださったPat Byard氏に感謝します。この研究は、NIH Career Award K25-AI65459、NIH R15 GM094713、NSF MRI CHE-0722759、Maine Technology Institute MTAF 1106 and 2061、およびMaine Economic Improvement Fundによって資金提供されました。

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H.とM.J.M.は、超解像顕微鏡の特許を保有しています。S.T.H.は、Vutara, Inc.の科学諮問委員会のメンバーを務めています。

ローカリゼーションベースの超解像イメージングは、生物学的イメージングに多くの強力な機能を提供します。テーブル上に配置された個々の光学部品から、生体サンプル中の複数の蛍光種を同時にイメージングできる機能的な超解像顕微鏡までのルートには、多くの課題があります。アライメントの一部の側面は、他の側面よりも重要です。以下では、ルートの最も困難な側面に対処する将来のユーザーにガイダンスを提供するよう努めます。
重要なステップ
FPALMや同様の技術によって提供される画像解像度の向上には、顕微鏡の安定化にもっと注意を払う必要があります。従来の顕微鏡画像は、~20〜50 nmのスケールでのサンプルドリフトや振動運動(振動)によって目に見えて歪むことはありませんが、超解像顕微鏡画像はそのような動きによって劣化します。たとえば、不要な動きの原因には、顕微鏡およびサンプル内の熱勾配、エアテーブルに取り付けられた機器の冷却ファン、顕微鏡ステージまたはエアテーブルへの物体の不注意な接触、および建物内の振動(空気処理装置やその他の機械によって引き起こされる可能...

細胞構造は広範囲の空間スケールで存在しますが、回折限界の物理的制約により、~250 nm未満の長さスケールでの細胞組織の蛍光イメージングは従来の顕微鏡では制限されています。この限界は、蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM1)や類似の技術2,3の出現により克服され、多数の個々の分子を~10 nmの精度で局在化し、数十ナノメートルの分解能で画像を生成できます。FPALMは、光学制御を使用して分子のサブセットを活性化および不活性化することに基づいています(FPALMの詳細な説明、およびこのイメージングシステムの実装方法については、Gould et al.4)この技術により、単一分子の全集団の空間分布をマッピングすることができ、数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さスケールで生体構造を解明することができます。ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡法(以下、ローカリゼーション顕微鏡法と呼ぶ)は、現在、さまざまな生物学的問題に対処するために適応されており、技術開発により、例えば、偏光FPALMによる個々の分子配向のイメージング、またはP-FPALM5、複葉剤FPALM6または他の技術7-9による3次元の単一分子の蛍光イメージングが可能になったローカリゼーション顕微鏡は、生細胞10-12における単一分子の超解像蛍光イメージングにも適用されています。ローカリゼーション顕微鏡は、固定細胞13-16の複数の種のイメージングにも適用されています。最近、3つのタンパク質種が固定細胞と生細胞の両方でFPALMで同時にイメージングされました17。ローカリゼーション顕微鏡は、さまざまな方法で標識されたサンプルをイメージングできます。 例としては、PAFPまたはPSFP融合タグで発現したタンパク質、ケージ入り有機色素で標識した抗体または分子、または従来の有機色素が含まれます。従来の蛍光色素の使用は、融合タンパク質タグの不在下でのタンパク質の標識を可能にする一方で、超解像イメージングにおける非ケージ有機色素の使用に一般的に必要とされる条件では、サンプルを還元バッファーに浸漬する必要があります2. さらに、抗体色素複合体の細胞内送達では、通常、細胞を固定し、その膜を透過処理する必要があります。 または、生細胞がエレクトロポレーションまたはその他の手段によって透過性にする必要があります。バッファー条件と膜透過化を減らすための要件により、有機色素の生細胞イメージングへの適合性は制限されますが、最近の開発により、HaloTagとFPALMを膜構造のイメージングに効果的に使用できるようになりました18。
FPALMは、生細胞に適用された最初の局在化顕微鏡技術でした10。生細胞では、標識された分子の位置の時間依存的な空間マップを提供するだけでなく、FPALMは複数のフレームにわたって単一分子を追跡し、ミリ秒の時間スケールで決定された分子の軌跡を追跡することができます19。したがって、FPALMは、かなり短い時間スケールとナノスケールの分解能へのアクセスを提供します。
Multicolor FPALMは、光活性化可能なタンパク質や有機ケージまたはノンケージ色素など、さまざまなプローブに使用できます。ここでは、2つの蛍光タンパク質種、Dendra2およびPAmCherryの同時イメージングのためのプロトコールとセットアップについて詳しく説明します。NIH-3T3線維芽細胞において、βアクチンに結合したPAmCherry(PAmCherry-actin)とインフルエンザ赤血球凝集素に結合したDendra2(Dendra2-HA)をイメージングした結果を報告する。セットアップで説明されているコンポーネントは、他のプローブのイメージングにより適した他のハードウェアと交換できます。この場合、テキストで明示的にするように努めました。
Multicolor FPALMは、生細胞または固定細胞内の複数のタンパク質種の空間分布を報告するのに理想的です。この手法は、ナノメートルの長さの空間スケールでの空間的および/または動的な関係の調査に特に適していますが、画像は数十ナノメートルから数十ミクロンまでの長さのスケールで局在を報告します。マルチカラーFPALMの主な利点の1つは、セットアップが比較的安価に構築でき、さまざまなプローブの組み合わせに非常に柔軟に使用できることです。コンポーネントからシステムを構築し、キャリブレーションするプロセスでは、データの品質と解釈可能性、ひいては研究成果を損なう可能性のある要因についても、かなりの理解を得ることができます。ここでは、FPALMを使用して、PSFPおよびPAFP融合コンストラクトを使用して、複数のタンパク質種の光学セットアップ、サンプル調製、およびデータ取得の方法について詳しく説明します。このプロトコルは固定細胞の分析を説明していますが、これらの手順は生細胞のイメージングに容易に適用できます。
ここで説明する光学セットアップは、PSFP Dendra2 と PAFP PAmCherry の同時イメージングに最適です。他の多くのプローブをマルチカラーイメージングに使用できます。ただし、必要な正確なコンポーネントは、選択したプローブの励起スペクトルと発光スペクトルによって異なる場合があります。ダイクロイックミラー、フィルター、レーザー波長の選択は、これらの考慮事項に基づいて行う必要があります。

<table><tbody><tr><td>LabTek IIチャンバー</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>キャリブレーション用ビーズ</td></tr><tr><td>テトラスペックビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>キャリブレーション用4色ビーズ</td></tr><tr><td>対物レンズ 浸漬油</td><td>ツァイス</td><td>518F</td><td>高NA対物レンズ用浸漬オイル(対物レンズの選択による)</td></tr><tr><td>HPLCウォーター</td><td>フィッシャー科学</td>的な<td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>媒体</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>またはCellgro 10-090</td></tr><tr><td>抗生物質</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>リポフェクタミン</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>Optimem I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>MPBiomedicals</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>1689149<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AA433689M</td><td>注意:有毒</td></tr></tbody></table>

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を適用すると、サンプル内の個々の蛍光標識単分子の分布の空間マップ(画像)を数十ナノメートルの空間分解能で取得できます。蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)は、目的のタンパク質に融合した光活性化可能(PAFP)または光切り替え可能(PSFP)の蛍光タンパク質、または抗体やその他の目的分子に結合した有機色素を使用して、単一細胞内の複数種の分子を同時にイメージングできます。以下のアプローチを用いることで、多数の(数千から数十万)の個々の分子の集団を単一細胞でイメージングし、10~30nmの精度で局在化します。得られたデータは、細胞内の複数のタンパク質タイプのナノスケールの空間分布を理解するために適用できます。この技術の主な利点の1つは、空間分解能の劇的な向上です:従来の光学顕微鏡では回折によって分解能が200~250nmに制限されますが、FPALMは長さのスケールを一桁以上小さくすることができます。多くの生物学的仮説は異なる生体分子間の空間的関係に関係しているため、FPALMの分解能の向上は、従来の蛍光顕微鏡ではアクセスできなかった細胞組織の問題に対する洞察を提供することができます。ここでは、サンプル調製とデータ取得の方法について詳しく説明するだけでなく、FPALMの光学セットアップについても説明します。超解像顕微鏡法を希望する研究者にとってのもう1つの考慮事項はコストです:社内のセットアップは、ほとんどの市販のイメージングマシンよりも大幅に安価です。この手法の限界には、細胞サンプル内の目的分子の標識を最適化する必要性や、結果を視覚化するための後処理ソフトウェアの必要性などがあります。ここでは、PAFPおよびPSFP発現を使用して、固定細胞内の2つのタンパク質種をイメージングする方法について説明します。また、この技術の生細胞への拡張についても説明する。

インフルエンザ血凝集素（HA）は、数十ナノメートルからマイクロメートルオーダーのクラスターを形成し、これらのクラスターはアクチンと様々な度合いで共局在します（図5）。これらの空間分布は、これら2つのタンパク質に関するより粗いスケールのイメージング結果28、およびHAの空間分布のアクチンへの依存性19を裏付けるものです。多色FPALM画像を用いることで、これらのクラスターの密度、面積、周囲の長さ、およびナノスケールとマイクロスケールの両方における2つの分子種間の共局在度をさらに記述することが可能です。得られた画像の解像度は数十ナノメートルオーダーです1,17。ここに提示したレンダリング画像では、画像上の個々の点は、単一の標識タンパク質分子の局在を20 nmの精度で表しています。透過光光源を用いて全視野（FOV）の画像を追加で取得することで（図6）、FPALM画像を細胞全体およびその周辺環境との関係において観察することができます。
上述の2色セットアップ...

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

本手順の全体的な目的は、固定細胞または生細胞において、複数のタンパク質種をナノメートル精度で同時にイメージングすることです。まず、顕微鏡からのフォーカスされた画像がカメラチップ上に投影されるまで、カメラと光学系の位置を調整します。次に、レーザービームが顕微鏡ステージ上の試料に直接整列するように配置します。次に、準備した細胞サンプルに光を照射し、目的のタンパク質を発現している細胞を選択します。最終ステップとして、サンプルにレーザーを照射し、細胞の蛍光をカメラチップに導いてデータセットを取得することで、蛍光光活性化局在化顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。最終的に、蛍光光活性化局在化顕微鏡を用いることで、固定細胞または生細胞において、ワイドフィールドまたは全反射照明蛍光を用いてサンプルの薄い領域を分離した状態で、ナノメートル空間スケールでの複数種のタンパク質の局在を示すことができます。共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、固定細胞または生存細胞において、複数のタンパク質をナノメートル分解能で同時にイメージングできることです。以下の手順では、付属のテキストプロトコルの図1に示されている多色F Omセットアップの概略図に基づく番号体系を参照します。顕微鏡の調整を開始するには、10x対物レンズを装着し、ランプを透過光に設定した状態で、校正スケールまたは定規を顕微鏡ステージの上に配置してください。垂直線を視野の中心に合わせます。次に、フィールド絞りを閉じ、接眼レンズを通して垂直方向を確認し、顕微鏡の照明を調整します。フィールド絞りの縁にピントが合っていない場合は、フィールド絞りとレッドル（redle）の両方にピントが合うまでコンデンサーの高さを調整します。次に、フィールド絞りが視野の中心に位置するように水平方向の位置を調整し、レッドルの中心グリッドのみが照らされるまでフィールド絞りを閉じます。これらのコンポーネントを初めて組み立てる際は、各チャネルの光路長が等しくなるように調整してください。これを実現するには、カメラチップ上の赤色を調整し、ミラー7とミラー9を調整して検出アパーチャを閉じ、2つのチャネル間の空間的な重なりを防ぎます。その後、反射光チャネルでラジカルの像にピントを合わせ、透過光チャネルでも同様にピントが合っているかを確認してください。透過光チャネルの画像にピントが合っていない場合は、ラジカル画像が両方のチャネルで同時にピントが合うまでミラー9を移動させます。レーザーの調整を開始するには、レーザー光路からレンズ1を取り外し、活性化ビームおよび読み出しビームを遮断します。次に、ミラー4にホワイトカードを密着させ、顕微鏡のシャッターを開き、ミラー4の前にあるカード上にラジカル画像が投影されるまでピントを合わせます。次に、読み出し

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蛍光光活性化局部化顕微鏡法による生体構造の同時多色イメージング

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。...

細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。...

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

我々は、蛍光標識された抗体の逐次結合および溶出を用いて、単一分子精度で異種ナノ構造内の複数の分子をイメージングする方法を実証する。...

madSTORMを用いたT細胞の高度に多重化された超解像イメージング

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1...

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

このプロトコルは、レーザー光源の生成方法、組織サンプルの調製方法、イメージングの実施方法、およびデータの分析方法の詳細を含む、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡技術のステップバイステップガイドを提供します。SLAMは、組織微小環境を調査するために4つの相補的なラベルフリーコントラストを測定することにより、非線形顕微鏡を進歩させます。...

同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

このプロトコルは、最適化された分離、固定、標識を用いてクロマチンおよびRNAポリメラーゼIIの信頼性の高いナノスケール可視化を実現し、単離シロイナズナの核の単分子局在顕微鏡イメージングの効率的なワークフローを提供します。この手法は、他のクロマチン関連タンパク質や高分解能イメージングのためのヒストン修飾にも容易に適応可能です。...

シロイナナズナ核における単一分子局在顕微鏡の効率的なプロトコル

学ぶ蛍光光活性化局在顕微鏡（FPALM）によるナノメートル精度の複数タンパク質同時イメージング法。固定細胞と生細胞の両方で数千個の蛍光標識タンパク質を高解像度で可視化し、細胞内タンパク質の局在動態を分子レベルで研究する。

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

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