蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

本手順の全体的な目的は、固定細胞または生細胞において、複数のタンパク質種をナノメートル精度で同時にイメージングすることです。まず、顕微鏡からのフォーカスされた画像がカメラチップ上に投影されるまで、カメラと光学系の位置を調整します。次に、レーザービームが顕微鏡ステージ上の試料に直接整列するように配置します。

次に、準備した細胞サンプルに光を照射し、目的のタンパク質を発現している細胞を選択します。最終ステップとして、サンプルにレーザーを照射し、細胞の蛍光をカメラチップに導いてデータセットを取得することで、蛍光光活性化局在化顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。最終的に、蛍光光活性化局在化顕微鏡を用いることで、固定細胞または生細胞において、ワイドフィールドまたは全反射照明蛍光を用いてサンプルの薄い領域を分離した状態で、ナノメートル空間スケールでの複数種のタンパク質の局在を示すことができます。

共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、固定細胞または生存細胞において、複数のタンパク質をナノメートル分解能で同時にイメージングできることです。以下の手順では、付属のテキストプロトコルの図1に示されている多色F Omセットアップの概略図に基づく番号体系を参照します。顕微鏡の調整を開始するには、10x対物レンズを装着し、ランプを透過光に設定した状態で、校正スケールまたは定規を顕微鏡ステージの上に配置してください。垂直線を視野の中心に合わせます。

次に、フィールド絞りを閉じ、接眼レンズを通して垂直方向を確認し、顕微鏡の照明を調整します。フィールド絞りの縁にピントが合っていない場合は、フィールド絞りとレッドル（redle）の両方にピントが合うまでコンデンサーの高さを調整します。次に、フィールド絞りが視野の中心に位置するように水平方向の位置を調整し、レッドルの中心グリッドのみが照らされるまでフィールド絞りを閉じます。

これらのコンポーネントを初めて組み立てる際は、各チャネルの光路長が等しくなるように調整してください。これを実現するには、カメラチップ上の赤色を調整し、ミラー7とミラー9を調整して検出アパーチャを閉じ、2つのチャネル間の空間的な重なりを防ぎます。その後、反射光チャネルでラジカルの像にピントを合わせ、透過光チャネルでも同様にピントが合っているかを確認してください。

透過光チャネルの画像にピントが合っていない場合は、ラジカル画像が両方のチャネルで同時にピントが合うまでミラー9を移動させます。レーザーの調整を開始するには、レーザー光路からレンズ1を取り外し、活性化ビームおよび読み出しビームを遮断します。次に、ミラー4にホワイトカードを密着させ、顕微鏡のシャッターを開き、ミラー4の前にあるカード上にラジカル画像が投影されるまでピントを合わせます。

次に、読み出しビームの遮蔽を解除し、ミラー1を調整して、ミラー4にあるラジカル画像の十字線上に読み出しレーザーを合わせます。中心に合わせた後、ラジカル画像をミラー5に投影し、ビームがミラー5の画像の十字線の中央に位置するようにミラー4を調整します。これで、読み出しビームがM4とM5の両方で中心に配置されたことになります。

次に、シャッター1を閉じて読み出しビームを遮断します。続いて、ラジカル画像をミラー3に投影します。レーザー光路からビームエキスパンダーを取り除き、活性化レーザーの遮断を解除します。

次に、ミラー2を調整し、活性化ビームをミラー3上のラジカル像の十字線に中心合わせします。中心が合ったら、ミラー2と3の間にビームエキスパンダーを再度設置し、ビームがラジカル像の十字線の中央に来るまでビームエキスパンダーの位置を調整します。ミラー3でラジカル像をミラー5に投影し、焦点を合わせます。

顕微鏡のフォーカスノブを使用して、活性化ビームが赤色イメージの中心に位置するまで、ダイクロイックミラー1の角度を調整します。次に、対物レンズを装着せず、顕微鏡シャッターを開いた状態で、シャッター2を閉じて活性化レーザーを遮断します。読み出し用シャッターであるシャッター1を開き、レーザーを顕微鏡の後方開口部から投影させます。

ミラー5を調整し、ビームが顕微鏡から出るようにします。これにより、レンズ1と対物レンズを元の位置に戻した状態で、ビームが顕微鏡から垂直に射出されるようになります。活性化レーザーを遮断した状態で、100 µMのブロミンBを含むサンプルをステージ上に配置します。読み出し用レーザーを60倍の対物レンズを通して色素に照射します。

電子増倍ゲインを無効にした状態で、この画像をカメラに送信します。次に、対物レンズをサンプルに合わせ、フォーカスを調整します。

ビームプロファイル全体をイメージングできるよう、アパーチャを十分に開きます。次に、ビームプロファイルの中心とアパーチャが同心円状になるように、アパーチャを横方向に移動させます。カメラソフトウェアを使用して、両方のチャンネルを包含する最小のカメラ読み出し領域となる関心領域（ROI）を選択し、これらの座標を記録してください。

この時点で、読み出しビームプロファイルを代表するスナップショットを1枚記録します。次に、シャッター1を閉じて読み出しレーザーを遮断し、シャッター2を開きます。活性化ビームプロファイルの測定を開始するために、活性化レーザーをサンプルに照射します。必要に応じて、電子増倍ゲインを100未満に設定し、ビームが各視野の中心にくるまで第1ダイクロイックミラーを調整してください。

次に、多色F-palm画像の取得を開始するために、活性化ビームプロファイルのスナップショットを記録します。室内の照明をすべて消灯します。その後、フリップマウントを介して水銀ランプの光を形質導入細胞に照射し、フィルターキューブを、プレフォトスイッチ状態の適切な励起波長を含むものに変更します。

細胞を選択したら、フリップマウントを下げてレーザーが顕微鏡内に通過できるようにし、付属のテキストプロトコルに従って、イメージングに適したダイクロイックミラーを含むフィルターターレットに切り替えます。次に、この画像をカメラに投影し、背景蛍光からトランスフェクトされた細胞を区別し、分子が光活性化可能であることを確認します。その後、活性化レーザーを用いて、10 micro watts未満の低出力でサンプルを短時間照射します。

次に、電子増倍ゲインを200に、フレーム数を5から10,000の間に設定し、キネティックシリーズ取得に向けてカメラソフトウェアを準備します。また、露光時間を10から30ミリ秒の間に設定します。その後、活性化ビームを遮断し、読み出しビームの遮断を解除して、照明された細胞の画像をカメラに投影します。

個々の分子が見えなくなるまでフォーカスを下げ、細胞膜の底部付近の焦点面を選択します。その後、分子が再び見え始めるまで、徐々にフォーカスを上げていきます。次に、活性化ビームの遮蔽を解除し、1 W/cm²未満の強度でサンプルを照射します。

活性化レーザーの前にある中性密度フィルターを動的に調整し、1平方ミクロンあたり0.1から1個の可視光光分解性分子の密度を維持しながら、カメラソフトウェアを通じてこれらのデータの収集を開始します。全反射蛍光イメージングを行う場合は、ミラー5とレンズ1を単一の移動ステージに取り付け、顕微鏡の入口のすぐ後ろで横方向に移動できるようにします。ミラー5とレンズ1を移動させると、対物レンズからサンプルを通過して上方に射出されるレーザーが徐々に片側に傾きます。レーザーの角度が垂直から90度になるまで、ステージの移動を続けてください。

この時点で、出射レーザー自体は消失し、入射レーザーは入射ビームと逆平行に、かつ側方にずれた状態で開口部へと後方反射されます。画像取得が完了し、サンプルが全反射蛍光状態に入ると、背景光の減少が確認できるはずです。すぐに顕微鏡のシャッターを閉じ、両方のビームを遮断してください。電子増倍ゲインを無効にします。

カメラを1フレーム記録に設定し、カメラの読み出し領域を最大サイズに設定します。最後に、顕微鏡ランプに装着したロングパスフィルターを用いて、F3またはF4の上にカードを置いて1つのチャンネルを遮断します。サンプルを照明し、この画像をカメラに投影します。

透過光下で細胞全体を代表するスナップショットを記録します。ここでは、DENDRA 2 HemagglutininとPAM Cherry actinの両方を発現しているNIH 3T3細胞の2色F-PALM取得例を示します。左側の透過光チャンネルは、右側の反射光チャンネルよりも長い波長を含んでいます。

ここでは、背景減算および左右チャネルのオーバーレイ変換後の、同一の2色F OM取得画像のスナップショットを示します。個々の分子を識別し、局在化させることができます。透過チャネルでより明るく見える分子もあれば、2つのチャネル間で放出がより均等に分布している分子もあります。

これはPAM cherryとDENDRA twoのそれぞれにおける放出スペクトルの違いを示しており、解析においてこれら2つの種を識別するために用いられます。ここに示すヒストグラムは、許容範囲を適用した後のすべての局在化分子について、赤色透過チャネル強度を全強度で除した比率を示しています。ピクセルは、左下の画像では白く見え、右下の最終合成画像では赤く見えます。一方、緑色領域のピクセルは、右上の画像では白く見え、右下の最終合成画像では緑色に見えます。

レンダリング時に選択するしきい値レベルは、ノイズの程度や共局在の見た目に大きく影響します。ここでは、ブリードスルーの程度が異なる3つの異なるレンダリングオプションを示しており、下2つに最も保守的なしきい値レベルを示しています。Color F palm alpha ヒストグラムは、画像内に2つの識別可能なピークがある場合に最も解釈しやすくなります。

左側のヒストグラムはさらなる解析の候補として適していますが、他の2つのヒストグラムから得られる画像は、この手順に従うと解釈が非常に困難になります。タンパク質が生存細胞膜のナノスケールでどのように構成されているかといった追加の疑問に答えるためには、全内部反射顕微鏡法やライブセルイメージングなどの手法を用いることができます。このビデオを視聴することで、独自のFAR顕微鏡をセットアップし、データ acquiring に使用する方法を十分に理解できるはずです。

レーザーの使用は極めて危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する前に必ず安全トレーニングを完了させてください。