自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

この手順の全体的な目標は、オープンソースソフトウェアと基本的な機器を使用して、自動化されたマルチウェルプレートワークフローに時間依存性蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)を実装する方法を実証することです。この方法論は、一連の固定細胞または生細胞のFLIMベースの読み出しに適用できます。また、細胞シグナル処理やタンパク質相互作用を読み取るのに特に役立ちます。

この手法の主な利点は、FLIMが堅牢な定量的読み取り値を提供し、1回の測定で相互作用母集団分率を提供できることです。数百の視野にわたる数千の細胞にグローバル解析技術を適用することで、フォスター樹脂エネルギー伝達(FRETリードアウト)を利用することができます。例えば、寿命が約20ピコ秒に変化するという利点を生かします。

Frederik Gorlitz氏と共にこの手順を実演するのは、当社の研究員であるSunil Kumar氏とソフトウェア開発者のIan Munro氏です。まず、マイクロマネージャーを起動し、openFLIM-HCAプラグインを開きます。FLIM制御タブで、遅延ボックスキャリブレーションファイルを選択し、キャリブレーションファイルを開きます。

遅延発生器ユニットと対象のレーザー繰り返し率の特定の組み合わせのキャリブレーションファイルを選択します。ファイルメニューで[ベースフォルダの設定]を選択し、データを保存するフォルダを選択します。適切なパラメータがすべて設定されたことを確認した後、実験全体について、ゲート付き光インテンシファイアコントロールボックスでゲート幅を4ナノ秒に手動で設定します。

装置応答関数の画像データを取得するには、レーザー光が漏れないように対物レンズの前のフィルターキューブカセットにビームブロックを手動で配置し、顕微鏡フレームへの反射を最小限に抑えるためにビームブロックを角度付けます。[光路制御]タブで、回転するディスクユニットの励起、ダイクロイック、および発光フィルターを設定し、回転するニプコウディスクから散乱する励起光の割合を、カメラ積分時間でシステムを飽和させることなくイメージングできるようにします。FLIM制御タブで、プログラム可能な高速遅延ボックスでカバーされる遅延の全範囲で最大ポイント検出機能を使用します。

次に、表示された出力トレースを確認します。また、コース遅延時間を設定して、完全な機器応答機能プロファイルが高速遅延ボックスのスキャン範囲内に収まるようにします。減光と露光時間のパラメータを調整します。

フレームの蓄積だけでなく、カメラが輝度タイムゲートで飽和せず、実効積分時間が200ミリ秒以上になるようにします。FLIMコントロールメニューで、高速遅延ボックスを選択し、全遅延範囲で25ピコ秒の遅延ステップを設定します。次に、populate delaysを選択し、[snap FLIM image]をクリックして、機器の応答関数画像を取得します。

そして、買収が完了するまで待ちます。光路制御メニューで、NDを選択し、blockedをクリックしてレーザーをブロックします。FLIM制御メニューを開き、高速遅延ボックスを選択して、増分ボックスの値を増やすことで遅延ステップの数を減らします。

次に、[FLIM画像のスナップ]をクリックして、背景カメラ画像を取得します。参照ダイデータを取得するには、XYZ制御タブに移動し、Go to wellダイアログボックスにH4ウェルを入力します。次に、光路制御タブに移動し、高速遅延ボックスの全範囲にわたって find max point 関数を使用して M ターコイズ蛍光タンパク質をイメージングするための適切な励起、ダイクロイック、および蛍光フィルターを選択します。

次に、先ほど示したように、参照ダイ データと対応する背景イメージを取得するための適切なパラメーターを設定します。マルチウェルプレートサンプルからFLIMデータを取得するには、セットアップHCAシーケンシング取得メニューに進みます。[XYZ位置]タブを選択し、画像化するウェルとウェルごとに取得する視野の数を設定します。

イメージングするサンプルを含む代表的な視野を選択し、カメラの積分時間に最適な減光フィルターを、読み出しカメラのダイナミックレンジの75%に達するように設定します。XYZコントロールタブで、オートフォーカスダイアログボックスのリターンフォーカスコントロールを選択し、顕微鏡を目的の細胞または構造に手動で焦点を合わせます。オートフォーカスの検索範囲を2000マイクロメートルに設定し、Enterキーを押します。

次に、AFをクリックしてオートフォーカス手順を開始します。オフセット値は、フォーカスオフセットオートフォーカスフィールドに表示されます。このオフセット値をAFオフセットウィンドウに入力し、[AFnow]を2回クリックしてオートフォーカス手順を繰り返します。

オフセット値はゼロに設定され、オートフォーカスシステムが正しく機能していることを示します。次に、[FLIM control]タブで、遅延ポイントの対数サンプリングを確保するための自動ゲート機能を選択します。累積フレームを、目的の合計データ集録時間が得られる値に設定します。

次に、FLIM取得ダイアログボックスで、HCAシーケンスの開始ボタンをクリックしてFLIMマルチウェルプレート取得を実行し、先ほど示したように背景カメラ画像を取得します。ここでは、コセルで発現したモデルフレットシステムとマルチウェルプレートを使用した代表的なFLIMフレットアッセイを示し、各ウェルで明らかな典型的な視野の自動取得蛍光寿命画像の例を示しています。この実験では、ネガティブコントロールウェルの寿命が最も長く、ドナーの寿命はリンカー長が最も短く、フレット構造が最も低

全体として、各ウェルのすべての視野で平均された平均寿命は、マルチウェルプレート全体で異なりました。ウェル A1 で画像化されたすべての細胞のドナー蛍光強度減衰プロファイルを平均化し、モノ指数関数的減衰モデルと装置応答関数への適合を行うことで、フィッティングモデルが有効であることがわかります。ピクセル単位のモノ指数関数的適合から得られたマルチウェルプレートの各カラムの平均蛍光寿命をさらに分析すると、リンカー長が短いほどフレットコンストラクトの寿命が短くなることが示され、異なるフレット効率の実験をシミュレートできます。

この実験では、タンパク質オリゴマー化に対するさまざまな阻害剤の作用のフレットアッセイのFLIMデータに、単一の指数関数的崩壊モデルを適合させました。蛍光寿命プレートマップは、8つの視野で平均化されたウェルあたりの平均寿命を示しています。1つの小さなセットで、ウェルごとに4つの視野をイメージングしますが、FLIMアッセイは、機器の応答機能、参照ダイデータの取得、FLIMフィットでの分析の実行時間を含め、約2時間半で完了できます。

FLIMアッセイを実施する際には、装置のレスポンス関数と参照ダイデータとその背景画像を取得することを忘れないでください。これにより、FLIMデータの解析に必要なすべての情報を得ることができます。当社のオープンソースソフトウェアであるFLIM fitを使用すると、このデータをより複雑な崩壊モデルに適合させることも可能です。たとえば、フレット母集団の割合を決定できるようにします。

当社のFLIM HCAテクノロジーは、創薬コミュニティの研究者がフレットの堅牢な測定を行うのに役立っています。将来的には、この技術により、細胞ベースのアッセイで解離定数を測定できるようになると期待しています。このビデオ論文とWikiの情報が、他の研究者が独自のFLIM HCA装置を構築し、それをフレットや他のアッセイに適用するのに役立つことを願っています。

レーザーでの作業は危険な場合があり、そのような機器を使用するときは、すべてのレーザービームを囲むなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。