Name: 上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ 上皮内蛍光法を用いてマウス消化管内のカンジダ・アルビカンスの形態と局在を可視化する手法。この技術は腸内細菌叢との相互作用を解明し、炎症性腸疾患の診断に応用可能です。

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著者たちは、カロライナ・トロピーニ、キャサリン・ン、ジャスティン・ソネンブルク、KC黄に、FISH技術開発の指導をいただき、感謝したいと思います。テレサ・オメアラは原稿に関する有益なコメントを提供し、ミリアム・レヴィは写真撮影を手伝いました。この研究は、NIH助成金R01AI108992、R01DK113788、感染症病因におけるバロウズウェルカム賞によって支援されました。

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここで説明する方法は、任意の性別または株の構成コロニー化マウスのGI管におけるC.アルビカンス酵母およびヒファエの可視化を可能にする。FISHプローブは、真菌細胞質全体に分布する23S rRNAにハイブリダイズします。我々の方法は、腸内細菌20を可視化するための以前に報告されたプロトコルから適合した。C.アルビカンスは宿主内の形態を変化するので、真菌細胞の形状と局在化を監視する方法が有用である。例えば、この方法を用いて、酵母が消化管全体を支配するという仮説を否定し、特定の「フィラメント欠陥」変異体12のインビボとインビトロ表現型との間の不一致を露呈した。
C. アルビカンス共罰のマウスモデルがいくつか存在する。実験室マウスとヒトの微生物叢は異なっており、マウスでは、安定したコロニー形成を確立するために抗生物質または専門的な食事の使用が必要である。抗生物質による治療はまた、ヒトのC.アルビカンスの植民地化を増強し、播種性疾患10の主要な危険因子である。この研究で使用される抗生物質は比較的安価であり、細菌微生物叢の信頼性の高い減少をもたらす。抗生物質は、動物からすべての細菌を排除するのではなく、拮抗細菌種の負担を軽減するために使用されることに注意してください。研究者が細菌の不在時にC.アルビカンス-宿主相互作用を研究したい場合、または抗生物質や特別な食事の使用を避けるために、生殖不能動物は、従来の飼育動物の代わりにすることができます。しかし、グノトビオティックマウスは、特定の免疫および解剖学的異常を示すため、すべての目的に適しているとは言えない。
FISH染色を成功させるためには、いくつかのステップが重要です:推奨される固定方法は、GI組織の構造的完全性、特に粘液層や三次元などの腸内腔の脆弱な内容物を維持するために重要です。真菌および細菌の組織16.水を含む多くの一般的に使用される固定ソリューションは、発光アーキテクチャに大きな損害を与があることに注意してください。このプロトコルで推奨される固定後のワッシュの固定剤とソリューションには水が含まれていないため、水による汚染を避けることは重要です。もう一つの重要なステップは、ハイブリダイゼーションオーブン内のスライドのインキュベーション中にハイブリダイゼーション溶液の蒸発を避けるために重要であるハイブリダイゼーションステップです。この問題を回避するために、スライドを防水容器に入れることをお勧めします。あるいは、マイクロアレイのハイブリダイゼーションに最初に使用されるような水密ハイブリダイゼーションチャンバーを使用することもできる。
C. アルビカンス特異的 FISH プローブは、このプロトコルで説明されています。しかしながら、多くの実験室飼育マウスは天然腸内微生物叢の一部としてC.アルビカンスまたは他の真菌を含まないので、パン真菌プローブは実験的に植民地化された動物においてC.アルビカンを特異的に染色し得る。パン真菌プローブの置換は、その優れたハイブリダイゼーション特性と高い信号対雑音比のために望ましいかもしれません。パン真菌プローブがC.アルビカンスの擬似特異的プローブとして使用される場合、未感染動物(すなわち、抗生物質で治療されるがC.アルビカンスではない)における染色の欠如を文書化することが重要である。非コロニー化対照動物の染色は、食品微粒子へのFISHプローブの付着に起因する可能性のある背景染色を評価するのにも有用である。全体的に、FISHプローブの使用は、カルコフルオ白(キチンを染色する、細胞タイプによって異なる可能性がある細胞壁成分)、GMS、または市販の抗真菌抗体などの真菌を染色する他のほとんどの方法よりも高い特異性を提供します。さらに、FISH染色は、種特異的rRNAに微分標識されたFISHプローブを使用して、複数の生物のコイニングを可能にします。
この技術の1つの注意点は、特定のC.アルビカンス酵母細胞タイプがFISH(例えば、不透明およびGUT細胞タイプ)によって非常によく似ているように見えることである。これらの細胞型を区別するために、細胞型特異的真菌mRNAにハイブリダイゼーションプローブを開発することが有用であろう。それにもかかわらず、現在の形態では、FISH技術はすでに、両方の条件12で評価されたC.アルビカンス変異体のインビボとインビトロ挙動との間の驚くべき相違を明らかにし、における複雑な相互作用を示す。既存のインビトロアッセイによって十分に模倣されていない自然な一般環境。追加の野生型および変異型宿主における異なるC.アルビカンス染色のさらなる研究は、真菌宿主相互作用にさらなる洞察をもたらす可能性が高い。特に、ヒト21におけるC.アルビカンスの高力力に関連する炎症性腸疾患のモデル、およびC.アルビカンスの過剰増殖および疾患の他のモデルにおいてC.アルビカンスをプロファイルすることが有益であろう。FISH技術はまた、特定の宿主細胞を染色するために免疫ヒスト化学と組み合わせてもよい。全体的に、ここで提示される方法は、哺乳動物GI管内のC.アルビカンの局在および形態を決定するための合理的に迅速かつ信頼性の高い手段を提供する。

カンディダ・アルビカンスは、真菌性交腸ならびに日和見ヒト病原体である。この酵母は、定義された環境ニッチを欠き、代わりにヒトおよび他の哺乳動物1の消化管、皮膚、および泌尿生殖器管内に伝播する。C.アルビカンスに関する初期の研究は主にその毒性の可能性に焦点を当てたが、いくつかの最近の報告は、腸内に交播生物が正常な健康に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。ホスト2、3、4.哺乳類腸内のC.アルビカンス・コンメンサリズムの調査を容易にするために、安定したGIコロニー形成のマウスモデルと、真菌酵母細胞およびヒファエを可視化するsituハイブリダイゼーション(FISH)ベースの蛍光法を開発した。腸内腔。
いくつかの例外5を除いて、実験室育ちのマウスは、典型的には消化管の真菌コロニー形成に対する耐性を示す。コロニー形成耐性は、特定の細菌種によって媒介されると考えられている;しかし、これは、抗生物質6、7またはおそらく細菌種組成物8、9を変更する化学的に定義された食事の使用を有する動物の治療によって克服することができる。同様に、ヒトにおいて、広域スペクトル抗生物質の使用は、C.アルビカンスの過剰増殖および播種10に関連している。私たちのマウスのコロニー形成モデルは、広範囲の抗生物質を使用して、免疫担当のC.アルビカンスコロニー形成を確立し、従来飼育されたマウスを形成します。ペニシリンとストレプトマイシンは、C.アルビカンスの108コロニー形成単位(CFO)を有するガバゲージュの前に1週間、動物の飲料水中に提供される。抗生物質注入水が続く限り、C.アルビカンスはGI管を通って伝播し、10 6−108 CFO/gの便性のテッタに達する。真菌のコロニー形成の高レベルにもかかわらず、動物は健康なままで、感染していないコントロールと同じ速度で体重を増やします。このモデルは、複数のC.アルビカンス・コンメンサリズム因子11、12をスクリーニングし、特徴付けるために正常に使用されています。
真菌王国の他のメンバーと同様に、C.アルビカンスは巨大な形態形成可塑性13が可能である。インビトロ条件下では、少なくとも6種類の単細胞酵母細胞型、ならびに多細胞性ヒファおよび偽子宮内の間で遷移することが示されている。酵母からヒプファへの移行は、その最も特徴的な毒性属性の一つであり、ほとんどの哺乳類疾患モデルおよび感染したヒト組織において、ヒファおよび偽ヒファが優勢である。マウス消化管内のC.アルビカンスの局在化と細胞形態を決定するために、固定組織学的セクションで酵母とヒファを染色するFISH技術を開発しました。プローブは、真菌細胞質全体に分布する真菌23SリボソームRNA(rRNA)にハイブリダイズする蛍光標識DNAオリゴヌクレオチドで構成されています。宿主組織は、宿主粘膜、消化器、細菌微生物叢、腸内粘液を含む腸の立体構造を保持する方法で固定されているため、この技術は真菌の局在化を可能にする染色されたとき、これらのランドマークに関して細胞。FISH技術は、周期性アシッドシフ(PAS)やゴモリのメテナミン銀(GMS)などの真菌の伝統的な組織学的汚れと良好に比較し、これらの試薬は特異的ではないので、市販の抗真菌抗体と比較します。C.アルビカンス。さらに、標準的な固定剤は粘液層を除去し、腸内腔14、15の他の内容物を破壊する。
この記事では、マウスGI管の高品位C.アルビカンスコロニー形成、安楽死動物からの消化管の解剖、発光を保持する方法での組織固定のための詳細な指示を提供しますアーキテクチャ、およびFISHを使用して宿主組織内のC.アルビカンスの検出のために。C.アルビカンスの野生型および変異株に加えて、ギャバゲーション技術は、他の微生物を送出するために使用することができる。固定技術は、腸の内容物の保存が望まれる任意の研究に有用であろう。FISHプロシージャは1日以内に完了することができ、複数の微分標識されたプローブを使用して複数の真菌種を局在させるために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>1mLシリンジ</td><td>BD</td><td>309659</td><td>はどのベンダーからでも代用可能</td></tr><tr><td>BHI血液寒天</td><td></td><td></td><td>は、どのベンダーからでも代用可能</td></tr> <tr><td>C. albicans FISHプローブ</td><td>IDT DNAテクノロジー</td><td>ズ カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション用チャンバー インキュ</td><td></td><td></td>ベーション用チャンバー <td>蒸発を減らすための水密チャンバー</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>C2432</td><td>>=99.5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ロシュ</td><td>10236276001</td><td>どのベンダーからでも代用可能</td></tr><tr><td>デリケートなタスクワイパー組織</td><td>キンバリー・クラーク</td><td>34256CT</td><td>キムワイプ</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7021-5KG</td><td>は、どのベンダーからでも代用可能</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ</td><td>E7023</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>給餌針</td><td>ケイデンス株式会社</td><td>7910</td><td>金属; 20 X1-1/2" W/2-1/4; オートクレーブ滅菌可能</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>その他の蛍光色素が利用可能</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>その他の蛍光色素が利用可能</td></tr><tr><td>フォームパッド</td><td>フィッシャー</td><td>22038221</td><td>カセット内に収まるフォームパッドを注文</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>マクロンファインケミカル</td><td>MK881746</td><td>ACS試薬、>= 99.5%</td></tr><tr><td>ガラスコプリンジャー</td>フィ<td>ッシャー08-815</td>は<td></td><td>、背中合わせに最大10スライドを保持します</td></tr><tr><td>組織学カセット</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>盲腸が押しつぶされないように深いカセット</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションカバースリップ</td><td>シグマ</td><td>GBL712222</td><td>RNaseフリー</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td></td><td></td><td>任意のベンダーから置換可能</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td>は、<td></td></tr><tr><td>Leeらの1975</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>ACS試薬、>=99.8%</td></tr><tr><td>マウス</td>、<td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>成人BALB/c、18-21グラム(8-10週間)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>に記載されているように調製された任意のベンダーから置換できる<td>フィ</td><td>ッシャー50-980-487</td><td>16%溶液</td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>シグマ</td><td>P3558-1KG</td><td>パラプラストPBSを埋め込む組織用</td></tr>、<tr><td>pH 7.4</td><td>UCSF細胞培養施設 培地生産ユニット</td><td>CCFAL003</td><td>カルシウム、マグネシウムフリー、任意のベンダーから代用できます</td></tr>ペ<tr><td>ニシリンG</td><td>シグマ</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>サブローデキストロース寒天</td><td></td><td></td>培地<td>任意のベンダーから代替</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>バクスター</td><td>2F7123</td><td>滅菌、任意のベンダーから代替可能</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Σ</td><td>S3014</td><td>任意のベンダーから代替可能; RNase-フリー</td></tr>を維持する <tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td> <td>Σ</td><td>L3771</td><td>任意のベンダーから代替可能; RNase-free</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>スーパーPAPペン</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー8899</td><td>は、任意のベンダーから置き換えることができます</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>シグマ</td><td>T3253</td><td>は、任意のベンダーから置き換えることができます;RNaseフリーを維持する</td></tr><tr><td>Vectashield</td>ベクター<td>研究所</td><td>H-1000</td><td>は、DAPI</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>シグ</td><td>マ214736</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>を含まないことができます任意のベンダーから代替</td></tr></tbody></table>

上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

カンダ・アルビカンスは、ヒトおよび他の多くの哺乳動物における腸内微生物叢の真菌成分である。C.アルビカンスは、ほとんどの植民地化された宿主に症状を引き起こさないが、コンメンサル貯水池は感染症のリポジトリとして機能し、腸内の高真菌力低下剤の存在は炎症性腸疾患に関連している。ここでは、C.アルビカンス細胞形態と局在化を安定した消化管コロニー形成のマウスモデルで可視化する方法について説明する。コロニー形成は、経口抗生物質で治療された動物におけるC.アルビカンスの単回投与を用いて確立される。腸組織のセグメントは、宿主粘膜と同様に、発光内容物(微生物および粘液)のアーキテクチャを維持する方法で固定される。最後に、その中の蛍光は、C.アルビカンスおよびヒファエを染色する真菌rRNAに対するプローブを用いて行われる。このプロトコルの主な利点は、消化管のコロニー形成中にC.アルビカンス細胞形態とその細胞構造と宿主構造との空間的関連を同時に観察できることです。

提供された指示に従って、この技術の結果は、宿主上皮、粘液、および断面GI組織におけるC.アルビカンスにおける核の蛍光標識であろう。野生型カンジダ・アルビカンス細胞は、円形、単細胞酵母細胞または高度に細長い細胞、時には分岐、多細胞性ヒファエ(細胞細胞分裂は、子宮内では明らかされない)として現れるべきである。C.アルビカンスの変異体は、さらに、より小さく、わずかに細長い「灰色」酵母として、またはより大きく、わずかに細長い「GUT」(消化管誘発転移)または「不透明」酵母として現れる。
図1は、口腔の移動に使用される給餌針と、移動手順中の針の重要な位置を示しています。図 2は、臓器解剖とマウスの GI セグメントの外観に使用される一般的なセットアップを示しています。
図3は、インビトロおよびマウスモデル内の伝播後の異なるC.アルビカンス細胞型のFISH染色を示す。図3Aは、固定、透過、インビトロ伝播ヒファの蛍光および相画像を示す。ハイファ形成は、液体リーの培地18を2%N-アセチルグルコサミンで誘導し、pHは37°Cで誘発した。図3Bは、固定、透過、インビトロ伝播酵母細胞の蛍光および相画像を示す。図3C,Dは、それぞれ固定、透過、インビトロ伝播性GUT細胞および不透明細胞を示す。GUTおよび不透明な細胞型は、走査型電子顕微鏡で可視化した場合を除き、形態学的に区別がつかない。インビトロ伝播細胞のFISH染色は、細胞が十分に透過していない場合、最適ではないことに注意してください。弱い染色と拡散染色の例を図3Cに示す。最良の結果を得るには、細胞固定および透過条件を調査する細胞の種類および種ごとに経験的に決定されるべきである。幸いなことに、断面組織のC.アルビカンを視覚化するための推奨プロトコルは、より一貫した透過を生成します。
図3E-Gは、マウス大腸におけるC.アルビカンスを、C.アルビカンス特異的プローブ(図3E)またはパンファンガルプローブで染色した(図3FF,G)を示す。これらの画像では、C.アルビカンスは赤色で表示され、宿主細胞核は青色で、粘液層は緑色です。丸い酵母と非常に細長いヒファ(白い矢印)の両方が大腸で発生します。パンフンガルプローブでは染色が明るくなりますのでご注意ください。図3Gは、同じコンパートメント内のume6変異体を示し、パン真菌プローブで染色した.Ume6は、インビトロ条件下でのヒファ形成に必要な転写因子をコードする19.興味深いことに、この変異体によって表示される酵母ロックされた表現型は、腸内で再現されず、宿主12内で冗長因子を活性化しなければならないことを示唆している。図4は、マウス粘膜に直隣接する領域および腸内腔のより中央領域を含む、マウスGI管の異なるセグメントにおける野生型C.アルビカンスの出現を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> 図1:ギャバージ中の主要な給餌針位置。(A) 給餌針。(B) 舌の側面に挿入された針ボールを供給する。(C) 食道に挿入して直立位置に針を供給する。(D) 鼻の上に数ミリのミリメートルが見える胃に挿入された給餌針。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> 図 2: 解剖レイアウトの例(A)解剖パッドとツール。(B) 物品化された GI 管。遠位(肛門)切片への近位(食道):I.胃。II. 近位小腸.III. 小腸の内側。IV. 遠位小腸V. セカムVI. 大腸。ピンクの破線の境界線ボックスは、固定する組織を示します。(C) カセットに配置された組織。ローマ数字はパネルBと同<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">じです。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> 図3:2%N-アセチルグルコサミン、pH6.8を有する液体リーの媒体18で成長したC.アルビカンスヒファエのFISHの代表的な画像。(B)YEPD+2%寒天プレート上で増殖したC.アルビカンス丸酵母細胞のFISH。(C)C.アルビカンスGUT細胞(ySN1045)のFISHは、YEPD+2%寒天プレート上で増殖した。(D)YEPD +2%寒天プレート上で増殖したC.アルビカンス不透明細胞のFISH。(E)大腸における野生型C.アルビカンス(ySN250)を、C.アルビカンス特異的プローブで染色した。(F)大腸における野生型C.アルビカンスを、パン真菌プローブで染色した。(G)大腸におけるUme6変異体(ySN1479)は、パンフンガルプローブで染色された:赤はC.アルビカンス、青は宿主上皮核、緑はムチンである。矢印はヒファエを示す。矢印は酵母を示す。スケールバー = 20 μm. Images F および G はウィッチリーら12から適合しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> 図4:異なる腸コンパートメントにおけるFISH染色C.アルビカンの外観野生型C.アルビカンスは、マウスGI管の示されたセグメントに示されている。各コンパートメント内では、画像は、宿主粘膜と腸内腔の中央領域に隣接する領域を示しています。染色はパンファンガルプローブで行った。スケールバー = 20 μm. 画像はウィッチリーら12から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">抗生物質ストック(200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリンG</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ストレプトマイシン</td>
			<td>400 mg/μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">メタカーン</td>
		</tr>
<tr>
<td>株式</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ボリューム</td>
			<td>単位</td>
		</tr>
<tr>
<td>メタノール</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>クロロホルム</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>氷酢酸</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">ハイブリダイゼーションソリューション</td>
		</tr>
<tr>
<td>株式</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ボリューム</td>
			<td>単位</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M トリス-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M ナCl</td>
			<td>0.9メートル</td>
			<td>180</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% ホルムアミド</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL (使用間の -20 °C で小さなアリコートに保持)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ルナセフリーウォーター</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FISH洗浄液</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M トリス-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M ナCl</td>
			<td>0.9メートル</td>
			<td>9</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ルナセフリーウォーター</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">ムチン核染色液</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI、10 μg/mL</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>レクチン, 40 μg/mL</td>
			<td>1.6 μg/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS、 pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: このプロトコルで使用される一般的な量とソリューションの濃度。

このプロトコルの目的は、哺乳動物の消化管におけるカンディダ・アルビカンス細胞の形状および局在を可視化することである。

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

このプロトコルは、カンディダ・アルビカンスが哺乳類の胃腸管に生息する方法について、これまでに得た最良の洞察のいくつかを生み出しました。例えば、最近まで、カンディダが腸内のどこに局在しているか、またはこのニッチ内で仮定している多くの形態のどれが本当に分かりませんでした。この技術の主な利点は、真菌が宿主構造または微生物叢の細菌との三次元相互作用を妨げることなく、自然環境内でカンディダを視覚化できることです。腸は複雑な環境であるため、実験室でモデル化することは非常に困難であるため、ホストモデルでカンディダ生物学を直接探査する方法を見つけることは非常に満足しています。カンディダ・アルビカンスを含む腸内微生物叢の特定の成分は、炎症性腸疾患などの疾患において役割を果たすと疑われている。この技術は、患者から得られた生検標本における特定の微生物の存在を診断するために使用される可能性がある。ガヴジ技術の習得と臓器を引き裂くことなく胃腸セグメントを解剖する能力は、最適な結果を得るために重要です。開始するには、与えられた接種の計算された体積で各動物をガビン。1ミリリットルの注射器にオートクレーブ動物の給餌針を取り付け、すべての気泡を取り除くように1つのガベージボリュームで注射器を埋めます。注射器を滅菌面に置きます。動物を固定するには、支配的な手で尾の根元でそれを保持し、耳のすぐ後ろの緩い皮膚に動物の背中に非支配的な手をスライドさせます。親指と人差し指でしっかりと一緒に擦り傷を集める。擦り傷で動物を拾い、それをひっくり返し、尾の周りに同じ手の小さな指をループして、動物を手のひらに固定します。動物の頭をそっと伸ばし、体と直線になるようにします。その後、支配的な手で注射器を拾い、湾曲した針を下に向けて動物に垂直に持ちます。針のボールを使って口の内側の隅をそっと引っ掛け、口の側に沿って針を喉の後ろに進め、針を中央に動かします。針のボールが動物の喉の後ろにあるら、針を上に傾けて動物のボディラインと平行にして、喉を滑らかに滑るようにします。針が喉を滑らかに滑らない場合、針が適切に配置されていない可能性があり、再配置して再試行するために引き出す必要があります。わずか数ミリメートルが見えるまで、動物が針を飲み込むことを可能にする針をスムーズに進めます。針のボールが、プランジャーを軽く進めることで胃の中に入っていることをテストし、抵抗がない場合は接種を継続します。接種が行われたら針をゆっくりと引き出し、動物をケージに入れます。呼吸や苦痛の徴候について5〜10分間動物を監視し続け、それが出血の直後に正常な活動を再開することを確認する。次の動物に同じ接種を使用する場合は、アルコール拭きで針をきれいにしてください。別の接種を使用する場合は、針を交換してください。鈍い終わりの鉗子を使用して腹部の皮膚の一部をつまみ、はさみを使用して骨盤の基部の近くの皮膚および下層筋膜を切開する。腹腔の両側に沿って胸部までU字形の切開を伸ばし、皮膚を外に持ち上げます。鈍い終わりの鉗子を使用して、セサミを使用して腹膜腔からセカムを穏やかに抽出し、盲腸と小腸と大腸の間の接続を切断する。セカム全体を神学のカセットに入れて、ねじらず平らに置きます。2番目のフォームパッドを上に置き、カセットを閉じます。次に、メタカーンを含むスクリューキャップジャーにカセットを入れます。1~2個の便ペレットを含み、カセットの長さより短い大腸のセクションを物品切りする。ティッシュをカセットに入れ、平らでねじずたっと保ちます。2番目のフォームパッドで重ねてカセットを閉じ、メタカーンに入れる。小腸の各部分をサンプリングするには、消化材料を含む1〜2センチメートルのセグメントを物品化する。カセットにティッシュを入れ、2番目のフォームパッドで重ね、カセットを閉じてメタカーンに入れます。胃を切除するとき、食道と小腸への接続を切断します。カセットにティッシュを入れ、メタカーンにカセットを入れる。カセットをメタカーン溶液中の少なくとも3時間、2週間未満室温にしておきます。固定後、フォームパッドを取り外し、各無傷の組織セクションをカセットに戻します。その後、100%メタノールで35分間、100%エタノールで25分間、キシレンで20分間2回洗浄します。カセットをペーパータオルで乾かし、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏70度で2時間、溶かしたパラフィンワックスに入れます。次に、ワックスからカセットを取り出し、余分なワックスを排出させ、ワックスブロックに埋め込まれるまで室温で保管します。パラフィン埋め込まれた組織学的セクションを脱ワックスし、スライドをキシレンで満たされた事前に温めた瓶に挿入する。瓶を摂氏60度で10分間放置し、キシレンウォッシュを捨てます。新鮮な室温キシレンを瓶に注ぎ、インキュベーションを繰り返します。その後、瓶に100%エタノールを充填し、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドを瓶から取り出し、空気乾燥させます。魚のプローブでC.albicansを染色するには、パットペンを使用して組織セクションの周りに円を描くことによって開始します。ハイブリダイゼーション溶液を含むプローブのピペット50マイクロリットルを固定組織に、ピペットチップで軽く広げます。気泡を防ぐために、ハイブリダイゼーションカバースリップで液体をオーバーレイします。その後、水密ハイブリダイゼーションチャンバーにスライドを密封し、暗闇の中でハイブリダイゼーションオーブンで摂氏50度で3時間のセクションをインキュベートします。インキュベーションの後、コプリン瓶に洗浄液を加えます。スライドからカバースリップを鉗子で慎重に取り外し、スライドを洗浄液に入れます。瓶にアルミホイルを覆い、摂氏50度で20分間インキュベートします。次に、洗浄液を注ぎ出し、瓶をPBSで補充してスライドを洗います。すぐに注ぎ、新鮮なPBSで再充填し、合計2回のスリングプロセスを繰り返します。繊細なタスクワイプでPBSを離れてウィックし、パットペンで腸組織セクションを囲みます。透明なプラスチック容器にスライドを入れ、50マイクロリットルのムチン核染色液を組織部に加えます。容器にアルミホイルを覆い、45分間摂氏4度でインキュベートします。インキュベーションの後、スライドをコプリンの瓶に入れ、PBSで2回洗います。ペーパータオルで余分なPBSをタップし、ティッシュで最後の滴を拭き取ります。各セクションに取り付け媒体を1滴置き、泡を防ぐためにガラスカバースリップでオーバーレイします。取り付け媒体をカバースリップ全体の下に広げます。コーナーにマニキュアでカバースリップを固定し、蛍光顕微鏡を使用してスライドを画像化します。このプロトコルは、インビトロおよび宿主組織においてC.albicansを蛍光的に標識するために使用することができる。インビトロ伝播した催眠術、丸酵母細胞、腸細胞、および不透明細胞を固定し、透過し、蛍光および位相コントラスト顕微鏡で区別した。丸い酵母と非常に細長いヒファエは、マウスの大腸で画像化された。宿主組織は、C.albicans特異的プローブまたは汎真菌プローブで染色された。C.albicansは赤、宿主細胞核青色、および粘液層を緑色と標識した。C.albicansは、宿主粘膜に隣接する領域および腸内腔のより中央領域を含むマウスの消化管の異なるセグメントで検出された。これまでギャバジ技術を行ったことがない科学者にとって、この方法を試みる前に専門的な訓練を受ける必要があります。魚の染色後、免疫蛍光技術は、宿主粘膜の付加的特徴を染色するために使用することができる。これにより、宿主の組織損傷または免疫応答の特性を認めることができる。この技術により、カンディダ・アルビカンス変異体の真菌細胞形態と宿主内での生存との関係を特徴付け、治療法を開発する際に利用できるカンディダ・アルビカンス生物学の理解を深めました。

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ゼブラフィッシュの急速な発展、小型サイズと透明性感染症の自然免疫制御の研究のための途方もない利点があります...

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

出典: Ng, K. M., Tropini, C. 蛍光の 現場 ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージングによる腸内細菌叢-宿主相互作用の可視化。 J. Vis. Exp.

マウス腸切片における腸内細菌の蛍光インポジションハイブリダイゼーション

このビデオは、皮下組織におけるカンジダ・アルビカンスのバイオフィルム形成を研究するためのin...

カンジダIn vivoマウスモデルにおけるバイオフィルム形成

マウス皮下モデルにおけるカンジダ・アルビカンスのバイオフィルム開発の実験的手順を提示します。真菌バイオフィルムは、コロニー形成単位の数を決定し、生成される光の量が生細胞の数に対応する非侵襲的な生物発光イメージングによって定量化されました。...

生物発光イメージングが続くマウス皮下モデルにおける医学関連の異物にカンジダ·アルビカンスバイオフィルム発展

ここでは、真菌、カンジダ・アルビカンス、およびザイモサンやIgGコーティングビーズを含む0.5μmを超える微粒子などの病原体の食作用中の初期のカスケードを視覚化し、定量化するための顕微鏡ベースの技術について説明します。...

食作用の初期段階の可視化

カンジダ・アルビカンスのバイオフィルムの内部特徴を見て定量化するために、屈折率マッチングによって明らかにされた固定無傷の標本を用意します。そして、光学断面顕微鏡を用いれば、バイオフィルムの厚みを完全にもった3次元画像データを得ることができる。...

カンディダ・アルビカンスバイオフィルムの明確化とイメージング

腸ホモジネート抽出物および免疫蛍光染色を用いた本研究で説明したex vivoアッセイは、GI管における カンジダ・アルビカン...

胃腸管における カンジダ・アルビカンス ・ヒphphal形態形成を研究するエクスビボアッセイ

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。...

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス...

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

この原稿は、非侵襲的共焦点顕微鏡を使用して、哺乳類宿主における活動感染中の形態形成表現型について中等度のカン ジダアルビカンス 変異体ライブラリをスクリーニングする方法について説明しています。...

哺乳類宿主における活動感染中のカンジダ・アルビカンス変異株の形態形成表現型をスクリーニングするためのin vivoイメージングの使用

カテーテル上にバイオフィルムが形成され、C.albicansと宿主の相互作用が臨床CRIとよく相関するC.albicans関連カテーテル関連感染症(CRI)のマウスモデルを確立しました。このモデルは、C.albicansバイオフィルム関連CRIのスクリーニング療法に役立ち、臨床的変革の基礎を築きます。...

マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

学ぶ 上皮内蛍光法を用いてマウス消化管内のカンジダ・アルビカンスの形態と局在を可視化する手法。この技術は腸内細菌叢との相互作用を解明し、炎症性腸疾患の診断に応用可能です。

上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

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