上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

このプロトコルは、カンディダ・アルビカンスが哺乳類の胃腸管に生息する方法について、これまでに得た最良の洞察のいくつかを生み出しました。例えば、最近まで、カンディダが腸内のどこに局在しているか、またはこのニッチ内で仮定している多くの形態のどれが本当に分かりませんでした。この技術の主な利点は、真菌が宿主構造または微生物叢の細菌との三次元相互作用を妨げることなく、自然環境内でカンディダを視覚化できることです。

腸は複雑な環境であるため、実験室でモデル化することは非常に困難であるため、ホストモデルでカンディダ生物学を直接探査する方法を見つけることは非常に満足しています。カンディダ・アルビカンスを含む腸内微生物叢の特定の成分は、炎症性腸疾患などの疾患において役割を果たすと疑われている。この技術は、患者から得られた生検標本における特定の微生物の存在を診断するために使用される可能性がある。

ガヴジ技術の習得と臓器を引き裂くことなく胃腸セグメントを解剖する能力は、最適な結果を得るために重要です。開始するには、与えられた接種の計算された体積で各動物をガビン。1ミリリットルの注射器にオートクレーブ動物の給餌針を取り付け、すべての気泡を取り除くように1つのガベージボリュームで注射器を埋めます。

注射器を滅菌面に置きます。動物を固定するには、支配的な手で尾の根元でそれを保持し、耳のすぐ後ろの緩い皮膚に動物の背中に非支配的な手をスライドさせます。親指と人差し指でしっかりと一緒に擦り傷を集める。

擦り傷で動物を拾い、それをひっくり返し、尾の周りに同じ手の小さな指をループして、動物を手のひらに固定します。動物の頭をそっと伸ばし、体と直線になるようにします。その後、支配的な手で注射器を拾い、湾曲した針を下に向けて動物に垂直に持ちます。

針のボールを使って口の内側の隅をそっと引っ掛け、口の側に沿って針を喉の後ろに進め、針を中央に動かします。針のボールが動物の喉の後ろにあるら、針を上に傾けて動物のボディラインと平行にして、喉を滑らかに滑るようにします。針が喉を滑らかに滑らない場合、針が適切に配置されていない可能性があり、再配置して再試行するために引き出す必要があります。

わずか数ミリメートルが見えるまで、動物が針を飲み込むことを可能にする針をスムーズに進めます。針のボールが、プランジャーを軽く進めることで胃の中に入っていることをテストし、抵抗がない場合は接種を継続します。接種が行われたら針をゆっくりと引き出し、動物をケージに入れます。

呼吸や苦痛の徴候について5〜10分間動物を監視し続け、それが出血の直後に正常な活動を再開することを確認する。次の動物に同じ接種を使用する場合は、アルコール拭きで針をきれいにしてください。別の接種を使用する場合は、針を交換してください。

鈍い終わりの鉗子を使用して腹部の皮膚の一部をつまみ、はさみを使用して骨盤の基部の近くの皮膚および下層筋膜を切開する。腹腔の両側に沿って胸部までU字形の切開を伸ばし、皮膚を外に持ち上げます。鈍い終わりの鉗子を使用して、セサミを使用して腹膜腔からセカムを穏やかに抽出し、盲腸と小腸と大腸の間の接続を切断する。

セカム全体を神学のカセットに入れて、ねじらず平らに置きます。2番目のフォームパッドを上に置き、カセットを閉じます。次に、メタカーンを含むスクリューキャップジャーにカセットを入れます。

1~2個の便ペレットを含み、カセットの長さより短い大腸のセクションを物品切りする。ティッシュをカセットに入れ、平らでねじずたっと保ちます。2番目のフォームパッドで重ねてカセットを閉じ、メタカーンに入れる。

小腸の各部分をサンプリングするには、消化材料を含む1〜2センチメートルのセグメントを物品化する。カセットにティッシュを入れ、2番目のフォームパッドで重ね、カセットを閉じてメタカーンに入れます。胃を切除するとき、食道と小腸への接続を切断します。

カセットにティッシュを入れ、メタカーンにカセットを入れる。カセットをメタカーン溶液中の少なくとも3時間、2週間未満室温にしておきます。固定後、フォームパッドを取り外し、各無傷の組織セクションをカセットに戻します。

その後、100%メタノールで35分間、100%エタノールで25分間、キシレンで20分間2回洗浄します。カセットをペーパータオルで乾かし、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏70度で2時間、溶かしたパラフィンワックスに入れます。次に、ワックスからカセットを取り出し、余分なワックスを排出させ、ワックスブロックに埋め込まれるまで室温で保管します。

パラフィン埋め込まれた組織学的セクションを脱ワックスし、スライドをキシレンで満たされた事前に温めた瓶に挿入する。瓶を摂氏60度で10分間放置し、キシレンウォッシュを捨てます。新鮮な室温キシレンを瓶に注ぎ、インキュベーションを繰り返します。

その後、瓶に100%エタノールを充填し、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドを瓶から取り出し、空気乾燥させます。魚のプローブでC.albicansを染色するには、パットペンを使用して組織セクションの周りに円を描くことによって開始します。

ハイブリダイゼーション溶液を含むプローブのピペット50マイクロリットルを固定組織に、ピペットチップで軽く広げます。気泡を防ぐために、ハイブリダイゼーションカバースリップで液体をオーバーレイします。その後、水密ハイブリダイゼーションチャンバーにスライドを密封し、暗闇の中でハイブリダイゼーションオーブンで摂氏50度で3時間のセクションをインキュベートします。

インキュベーションの後、コプリン瓶に洗浄液を加えます。スライドからカバースリップを鉗子で慎重に取り外し、スライドを洗浄液に入れます。瓶にアルミホイルを覆い、摂氏50度で20分間インキュベートします。

次に、洗浄液を注ぎ出し、瓶をPBSで補充してスライドを洗います。すぐに注ぎ、新鮮なPBSで再充填し、合計2回のスリングプロセスを繰り返します。繊細なタスクワイプでPBSを離れてウィックし、パットペンで腸組織セクションを囲みます。

透明なプラスチック容器にスライドを入れ、50マイクロリットルのムチン核染色液を組織部に加えます。容器にアルミホイルを覆い、45分間摂氏4度でインキュベートします。インキュベーションの後、スライドをコプリンの瓶に入れ、PBSで2回洗います。

ペーパータオルで余分なPBSをタップし、ティッシュで最後の滴を拭き取ります。各セクションに取り付け媒体を1滴置き、泡を防ぐためにガラスカバースリップでオーバーレイします。取り付け媒体をカバースリップ全体の下に広げます。

コーナーにマニキュアでカバースリップを固定し、蛍光顕微鏡を使用してスライドを画像化します。このプロトコルは、インビトロおよび宿主組織においてC.albicansを蛍光的に標識するために使用することができる。インビトロ伝播した催眠術、丸酵母細胞、腸細胞、および不透明細胞を固定し、透過し、蛍光および位相コントラスト顕微鏡で区別した。

丸い酵母と非常に細長いヒファエは、マウスの大腸で画像化された。宿主組織は、C.albicans特異的プローブまたは汎真菌プローブで染色された。C.albicansは赤、宿主細胞核青色、および粘液層を緑色と標識した。

C.albicansは、宿主粘膜に隣接する領域および腸内腔のより中央領域を含むマウスの消化管の異なるセグメントで検出された。これまでギャバジ技術を行ったことがない科学者にとって、この方法を試みる前に専門的な訓練を受ける必要があります。魚の染色後、免疫蛍光技術は、宿主粘膜の付加的特徴を染色するために使用することができる。

これにより、宿主の組織損傷または免疫応答の特性を認めることができる。この技術により、カンディダ・アルビカンス変異体の真菌細胞形態と宿主内での生存との関係を特徴付け、治療法を開発する際に利用できるカンディダ・アルビカンス生物学の理解を深めました。