微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量
September 16th, 2020
微小パターン化細胞上のリソソームエキサイトーシスのライブイメージングは、このプロセスの空間的定量化を可能にする。マイクロパターンを用いたモルフォロジーの正規化は、細胞プロセスの空間分布に関する一般的なルールを明らかにする優れたツールです。
このプロトコルは、TOF顕微鏡によるライブイメージングを用いて細胞分泌を調査する方法を示し、クラスタリングイベントや高活性領域を検出するためのツールを提供します。このプロトコルを用いて、細胞分裂を正常化し、特殊な分泌事象を促進するマイクロパターン表面上の細胞培養を生成することができる。細胞は免疫調節において重要な役割を果たす様々な高分子を分泌する。
癌では、規制緩和された分泌は、侵入を促進するタンパク質分解酵素の放出に影響を与える。分泌の定量化により、がんの劣化分泌や抗原提示などの動的プロセスをよりよく理解することができます。当社のイメージングおよび分析プロトコルは簡単ですが、マイクロパターンの一部に広がる単一の細胞の生成が必要です。
このビデオでは、マイクロパターンカバーリップ上の細胞を培養する方法と、容量統計ツールを使用して分泌事象を可視化および分析する方法を紹介します。マイクロパターニング用のカバーリップを調製するには、直径25ミリメートルのガラスカバーリップを深紫外線下で5分間殺菌します。カバーリップが活性化されている間に、ポリリジングラフトポリエチレングリコールの1つの30マイクロリットルの滴を、湿気の多いチャンバー内のパラフィンフィルムにカバースリップごとに加えます。
活性化の終了時に、カバーリップ活性化面側を下の滴の上に置き、湿気の多いチャンバーを覆い、室温で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、カバーリップを蒸留水で2回洗います。カバースリップが乾燥している間に、水晶のフォトマスクを蒸留水で1回、アルコールで1回洗います。
フォトマスクを濾過空気流で乾燥させ、フォトマスククロムコーティングサイドを深紫外線まで5分間露出させます。イルミネーションの最後に、各フォトマスクのクロムコーティングされた側に10マイクロリットルの水を加え、各カバースリップのポリエチレングリコール側を水滴の上に置きます。余分な水を取り除いた後、脱水を避けるためにスライドの上にフィルムカバーを置きます。
フォトマスクのクロムコーティングされていない側面をさらに5分間深い紫外線にさらす後、フォトマスクに余分な水を加えてカバーリップを取り除きます。このステップは、表面にマイクロパターンの刻印を生成します。次に、層流フードの下で1時間、湿気の多いチャンバーのパラフィン膜上の細胞外マトリックスタンパク質溶液にカバーリップをインキュベートします。
調製したマイクロパターン表面にセルシードを行う場合、インキュベーションの終わりに、カバーリップを磁気カバースリップホルダーマイクロパターン側に上に置き、すぐにカバーリップにパターンメディアを追加します。シールを追加した後、カバースリップホルダーに追加のパターン媒体を充填する前に、磁気デバイスでカバーリップを固定します。その後、ガラスの蓋でホルダーを閉じます。
細胞の準備ができたら、5回の50回のトランスフェクトされた不死化網膜色素上皮細胞をカバースリップに加え、細胞培養インキュベーターで10分間ホルダーに細胞をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、1つのピペットを使用して古い培地を吸引し、2番目のピペットを使用して洗浄ごとに新鮮な培地で細胞を5回洗浄し、非付着細胞および残りのウシ胎児血清を除去します。最後の洗浄後、ホルダーを3時間インキュベーターに戻し、完全な細胞の広がるようにします。
エキソサイトーシスイベントを画像化するには、カバースリップホルダーを全内部反射蛍光顕微鏡の下に置き、完全に広がるVAMP7-pHluorinを発現する細胞を探します。VAMP7-pHluorinエキソサイトーシスイベントの可視化を可能にする全内部反射蛍光角度までレーザーの角度を変更し、エキソサイトーシス速度とタイムスケールと互換性のある周波数で5分間の取得を行います。エキサイトーシスの座標を取得するには、フィジーで取得したexocytosisイベントムービーを開き、外側に広がる明るい信号の出現によって、手動でエキソサイトーシスイベントを識別します。
点ツールを使用して exocytosis イベントの中心をマークし、解析と測定を使用して、X 座標と Y 座標、および時間座標を測定します。1 つのセルの測定値を 1 つのテキスト ファイルに保存します。スプレッドシートでテキスト ファイルを開き、スライス x 列と y 座標列以外の列をすべて削除します。
次に、楕円形のツールと測定を使用して、中心と直径を測定し、各セルの x 座標と y 座標とフェレットの直径を取得します。すべてのセルの測定値を 1 つのテキスト ファイルに保存します。スプレッドシートでテキスト ファイルを開き、x と y 座標とフェレットの直径列以外の列をすべて削除します。
次に、各セルの半径の測定値を追加し、各セルのフェレットの直径から半径を取得します。直線ツールを使用して、各セルのマイクロパターンリングの厚さを測定します。この測定値を 1 つのテキスト ファイル内のすべてのセルに保存し、接着の長さをセルの半径で割って正規化された接着の長さを計算します。
単一セル空間解析の場合は、まず RStudio のパッケージをインストールし、RStudio にパッケージをロードします。ESA 関数を使用してパッケージを実行します。ユーザーインターフェイスが開き、データセット TXT ファイルのディレクトリと出力プロットのディレクトリを選択します。
スクリプトは自動的に開始し、解析を実行し、対応するプロットのPDFファイルと数値結果を含むTXTファイルを提供します。細胞の内部では、プローブ内の床はリソソームの低pHによって消し止めされるが、興奮の間、プロトン放出によりpHが増加するにつれてpフルオリンがシグナルを発し始める。pHluorinシグナルは、リソソーム陽子の速い放出を表すエキソサイトーシス中のピークを示し、続いて、原形質膜におけるプローブの2D拡散を表す指数シグナル減衰を示す。
典型的には、ヒト網膜網膜色素沈着細胞は、平均エキソサイトーシス率0.28ヘルツの重要なリソソーム分泌活性を示す。カーネル密度推定によってエキソサイトーシスの2D分布を可視化し、局所密度の違いを明らかにすることが可能です。完全な空間的ランダム性から、クラスタリング、分散、またはクラスタリングと分散の混合物という 3 つの逸脱が考えられます。
リプリーのK関数は、これらの偏差を評価するために使用することができます。なお、非接着領域におけるエキソサイトーシス事象は、接着分子が、形質膜における分泌ホットスポットを誘導する唯一の構造ではないことを示すクラスター化も行われている。代表細胞の弾性率に従ってエキソサイトーシス事象のヒストグラムをプロットすると、接着剤と非接着領域の境界周辺のピークが明らかになります。
対の分析は、表面密度が非接着領域よりも接着領域において低いことを示し、細胞周辺におけるエキソサイトーシスの強い減少に起因する可能性がある。マイクロパターン上の細胞接着と統計解析を組み合わせることで、分泌などの複雑な細胞プロセスが宇宙でどのように制御されているかを特定する機能が容易になります。分泌活性のクラスタリングの根源となる分子メカニズムを決定するには、将来の作業が必要です。
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概要
この研究では、マイクロパターン化された表面上のTOF顕微鏡法を用いて網膜色素上皮細胞におけるリソソームの胞外排出を調査しました。このアプローチにより、分泌イベントの空間的定量化が可能となり、免疫調節およびがんにおける高分子放出の理解が深まります。
主要な研究要素
研究分野
- 細胞生物学
- がん生物学
- 顕微鏡技術
背景
- リソソームの胞外排出は分泌機能において重要な役割を果たします。
- 分泌の調節不全はがんの進行に影響を与える可能性があります。
- マイクロパターン化アプローチは細胞形態を正常化し、分析を向上させます。
使用した方法
- TOF顕微鏡法による生体イメージング
- 網膜色素上皮細胞
- マイクロパターン化のためのカバースリップのマイクロファブリケーション
主な結果
- 胞外排出イベントの空間的定量化が達成されました。
- 細胞分裂の正規化により、分泌イベント検出の精度が向上しました。
- データ分析により、胞外排出の空間分布の詳細な追跡が可能になりました。
結論
- この研究はリソソーム分泌の空間力学に関する洞察を提供します。
- この発見はがんおよび免疫反応における細胞プロセスの理解に関連しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative spatial analysis of lysosomal exocytosis in micropatterned cells enables precise interrogation of secretory mechanisms relevant to immune regulation and cancer biology. This approach enhances predictive confidence in early discovery by revealing non-random clustering of secretion events and the influence of cell adhesion. The method supports risk-adjusted decisions at the target validation and assay development inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by quantifying spatial clustering of exocytosis events.
- Clarifies the contribution of adhesion molecules to secretory hot spot formation.
- Supports functional target validation by linking secretion patterns to cellular microenvironments.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing random from regulated secretion behaviors.
Screening & Assay Development
- Standardizes cell morphology using micropatterns for reproducible assay conditions.
- Generates quantitative outputs through spatial statistical tools such as Ripley’s K function and NND analysis.
- Enables reliable detection of secretory activity for downstream compound evaluation.
- Supports assay scalability and platform reuse by providing normalized, high-content readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial secretion analysis with disease-relevant models, such as cancer cell invasion and immune modulation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by quantifying dynamic secretion processes.
- De-risks translational advancement by revealing spatial determinants of secretory dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the spatial regulation of exocytosis and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness.
- Analytics: Provides statistical outputs (e.g., clustering indices, density maps) for robust condition comparison.
- Translational Research: Connects spatial secretion patterns to disease-relevant cellular behaviors.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable analytical framework for diverse secretory and trafficking studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in secretory pathway analysis.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of spatial secretion assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on quantitative spatial data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, micropatterning, and spatial statistics.
- Needs access to TIRF microscopy and computational tools for spatial analysis.
- Demands cross-team standardization of cell culture and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or secretory pathways.
- Manual event annotation and data curation can be resource-intensive.
