微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量

このプロトコルは、TOF顕微鏡によるライブイメージングを用いて細胞分泌を調査する方法を示し、クラスタリングイベントや高活性領域を検出するためのツールを提供します。このプロトコルを用いて、細胞分裂を正常化し、特殊な分泌事象を促進するマイクロパターン表面上の細胞培養を生成することができる。細胞は免疫調節において重要な役割を果たす様々な高分子を分泌する。

癌では、規制緩和された分泌は、侵入を促進するタンパク質分解酵素の放出に影響を与える。分泌の定量化により、がんの劣化分泌や抗原提示などの動的プロセスをよりよく理解することができます。当社のイメージングおよび分析プロトコルは簡単ですが、マイクロパターンの一部に広がる単一の細胞の生成が必要です。

このビデオでは、マイクロパターンカバーリップ上の細胞を培養する方法と、容量統計ツールを使用して分泌事象を可視化および分析する方法を紹介します。マイクロパターニング用のカバーリップを調製するには、直径25ミリメートルのガラスカバーリップを深紫外線下で5分間殺菌します。カバーリップが活性化されている間に、ポリリジングラフトポリエチレングリコールの1つの30マイクロリットルの滴を、湿気の多いチャンバー内のパラフィンフィルムにカバースリップごとに加えます。

活性化の終了時に、カバーリップ活性化面側を下の滴の上に置き、湿気の多いチャンバーを覆い、室温で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、カバーリップを蒸留水で2回洗います。カバースリップが乾燥している間に、水晶のフォトマスクを蒸留水で1回、アルコールで1回洗います。

フォトマスクを濾過空気流で乾燥させ、フォトマスククロムコーティングサイドを深紫外線まで5分間露出させます。イルミネーションの最後に、各フォトマスクのクロムコーティングされた側に10マイクロリットルの水を加え、各カバースリップのポリエチレングリコール側を水滴の上に置きます。余分な水を取り除いた後、脱水を避けるためにスライドの上にフィルムカバーを置きます。

フォトマスクのクロムコーティングされていない側面をさらに5分間深い紫外線にさらす後、フォトマスクに余分な水を加えてカバーリップを取り除きます。このステップは、表面にマイクロパターンの刻印を生成します。次に、層流フードの下で1時間、湿気の多いチャンバーのパラフィン膜上の細胞外マトリックスタンパク質溶液にカバーリップをインキュベートします。

調製したマイクロパターン表面にセルシードを行う場合、インキュベーションの終わりに、カバーリップを磁気カバースリップホルダーマイクロパターン側に上に置き、すぐにカバーリップにパターンメディアを追加します。シールを追加した後、カバースリップホルダーに追加のパターン媒体を充填する前に、磁気デバイスでカバーリップを固定します。その後、ガラスの蓋でホルダーを閉じます。

細胞の準備ができたら、5回の50回のトランスフェクトされた不死化網膜色素上皮細胞をカバースリップに加え、細胞培養インキュベーターで10分間ホルダーに細胞をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、1つのピペットを使用して古い培地を吸引し、2番目のピペットを使用して洗浄ごとに新鮮な培地で細胞を5回洗浄し、非付着細胞および残りのウシ胎児血清を除去します。最後の洗浄後、ホルダーを3時間インキュベーターに戻し、完全な細胞の広がるようにします。

エキソサイトーシスイベントを画像化するには、カバースリップホルダーを全内部反射蛍光顕微鏡の下に置き、完全に広がるVAMP7-pHluorinを発現する細胞を探します。VAMP7-pHluorinエキソサイトーシスイベントの可視化を可能にする全内部反射蛍光角度までレーザーの角度を変更し、エキソサイトーシス速度とタイムスケールと互換性のある周波数で5分間の取得を行います。エキサイトーシスの座標を取得するには、フィジーで取得したexocytosisイベントムービーを開き、外側に広がる明るい信号の出現によって、手動でエキソサイトーシスイベントを識別します。

点ツールを使用して exocytosis イベントの中心をマークし、解析と測定を使用して、X 座標と Y 座標、および時間座標を測定します。1 つのセルの測定値を 1 つのテキスト ファイルに保存します。スプレッドシートでテキスト ファイルを開き、スライス x 列と y 座標列以外の列をすべて削除します。

次に、楕円形のツールと測定を使用して、中心と直径を測定し、各セルの x 座標と y 座標とフェレットの直径を取得します。すべてのセルの測定値を 1 つのテキスト ファイルに保存します。スプレッドシートでテキスト ファイルを開き、x と y 座標とフェレットの直径列以外の列をすべて削除します。

次に、各セルの半径の測定値を追加し、各セルのフェレットの直径から半径を取得します。直線ツールを使用して、各セルのマイクロパターンリングの厚さを測定します。この測定値を 1 つのテキスト ファイル内のすべてのセルに保存し、接着の長さをセルの半径で割って正規化された接着の長さを計算します。

単一セル空間解析の場合は、まず RStudio のパッケージをインストールし、RStudio にパッケージをロードします。ESA 関数を使用してパッケージを実行します。ユーザーインターフェイスが開き、データセット TXT ファイルのディレクトリと出力プロットのディレクトリを選択します。

スクリプトは自動的に開始し、解析を実行し、対応するプロットのPDFファイルと数値結果を含むTXTファイルを提供します。細胞の内部では、プローブ内の床はリソソームの低pHによって消し止めされるが、興奮の間、プロトン放出によりpHが増加するにつれてpフルオリンがシグナルを発し始める。pHluorinシグナルは、リソソーム陽子の速い放出を表すエキソサイトーシス中のピークを示し、続いて、原形質膜におけるプローブの2D拡散を表す指数シグナル減衰を示す。

典型的には、ヒト網膜網膜色素沈着細胞は、平均エキソサイトーシス率0.28ヘルツの重要なリソソーム分泌活性を示す。カーネル密度推定によってエキソサイトーシスの2D分布を可視化し、局所密度の違いを明らかにすることが可能です。完全な空間的ランダム性から、クラスタリング、分散、またはクラスタリングと分散の混合物という 3 つの逸脱が考えられます。

リプリーのK関数は、これらの偏差を評価するために使用することができます。なお、非接着領域におけるエキソサイトーシス事象は、接着分子が、形質膜における分泌ホットスポットを誘導する唯一の構造ではないことを示すクラスター化も行われている。代表細胞の弾性率に従ってエキソサイトーシス事象のヒストグラムをプロットすると、接着剤と非接着領域の境界周辺のピークが明らかになります。

対の分析は、表面密度が非接着領域よりも接着領域において低いことを示し、細胞周辺におけるエキソサイトーシスの強い減少に起因する可能性がある。マイクロパターン上の細胞接着と統計解析を組み合わせることで、分泌などの複雑な細胞プロセスが宇宙でどのように制御されているかを特定する機能が容易になります。分泌活性のクラスタリングの根源となる分子メカニズムを決定するには、将来の作業が必要です。