マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

次の手順の全体的な目標は、特定の接着マイクロパターンで達成される細胞構造と位置の正規化により、画像取得の容易な自動化と、従来のガラスカバースリップサポートでは達成できなかった薬物効果の高感度で堅牢な定量化による簡単な画像処理を可能にすることを示すことです。これは、L字型のSI 3ラベル付きマイクロパターンを持つSI 2チップにヘリセルを播種することによって達成されます。細胞は、L.Theパターン細胞は次にレボススタチンとインキュベートされるか、または未処理のままにされ、次いで固定され、染色されてActonの細胞骨格と核を視覚化するために、L.Theパターン細胞の両端にまたがる主要なストレス繊維を構築する三角形の形状を採用する。

次に、マイクロパターン細胞の画像を取得し、cell refマクロを使用して解析用の画像スタックを生成し、表現型を定量化するためのhypotenuseマクロを使用して処理します。最終的には、標準的な細胞培養条件では検出できないマイクロパターンHELOC細胞に対する低用量のBLEsスタチンの有意な効果を示す結果を得ることができます。こんにちは、ようこそ。

本日は、細胞解析に接着性マイクロパターンを使用する方法を説明するとともに、これらの接着性マイクロパターン上で非常に低用量の薬物を簡単に定量化できる実験データを示す実験プロトコルをご紹介します。したがって、これらのマイクロパターンを初めて見たとき、細胞解析中の画像キャプチャのばらつきの問題をどのように解決できるかをすぐに理解できます。なぜなら、マイクロアレイのように、細胞の配列を実際に持つことで、顕微鏡のステージを細胞から細胞へと簡単に移動させ、段階的に画像をキャプチャできるようになるからです。

しかし、もちろん、それが提供するマイクロパターンの利点はそれだけではありません。実際には、クロスボやYなどの特定の典型的なマイクロパターンでは、細胞小器官、有糸分裂紡錘体、細胞骨格、および異なるタンパク質ネットワークがすべて細胞から細胞へ、または細胞から細胞への同じ方向にあることを意味する内部細胞構造を正常化しているため、はるかに多くの改善を提供します。 これにより、これらの特定のパターンに対する薬物の影響を予測し、定量化することがはるかに容易になります。さて、これは古典的なペトリ皿やマイクロプレートで通常行われることとはまったく直感に反するように思えるかもしれません。

もちろん、細胞が動き回り、さまざまな形態を採用しているのをよく見かけます。一方、接着マイクロパターンでは、すべての細胞がこの接着マイクロパターンに反応し、同じようにアーキテクチャを整理しているため、同じように見え始めます。これは実はちょっと人工的に見えるかもしれませんが、よく見るとペトリ皿はさらに人工的ではないでしょうか。

なぜなら、組織では、細胞は隣接する細胞だけでなく、細胞外マトリックスによっても制約されているからです。そのため、彼らは多くの空間情報を受け取っており、それがセルアーキテクチャの方向性を示しています。そして、これはオンサイトでマイクロパターンの広告に私たちが行っていることです。

私たちはこの空間情報を細胞に復元しており、すべての細胞がこれに反応して同じように整理しています。そして今、細胞はすべて似ているため、参照細胞の概念を導入することができます、つまり、すべての画像を平均化して単一の画像を得ることができ、これは特定の条件で細胞がどのように見えるかを実際に代表しています。次に、薬物を追加し、その参照細胞をもう一度見て、その薬物に応答して細胞の形態や組織をどのように変化させたかを確認できます。

2つのsitu 2チップを6ウェルプレートの2つの独立したウェルに個別に配置して、situ 2のロゴが読み取れるようにします。この実験に使用した situ 2 チップは、FibroGen SI 3 で染色されたマイクロパターンを持っていますので、使用前には暗所に保管してください。トリプシンによって約80%confluentであるhela細胞を収集し、それらが4分間300 Gの顕微鏡遠心分離機の下で適切に個別化されていることを確認し、細胞を穏やかにカウントし、1ミリリットルあたり15、000細胞の濃度に希釈します。

不完全なD-M-E-M-F 12培養培地では、ウェルあたり60、000個の細胞を分注します。細胞が中心に集中する傾向がある培地に回転運動を導入するのを避けるために、プレートはできるだけ動かさないようにする必要があります。細胞をボンネットの下で10分間沈殿させてから、細胞インキュベーターに移します。

細胞インキュベーター内で10〜20分以内に、10分後に細胞が接着し始めますので、細胞が付着した場合は顕微鏡で定期的にチェックしてください。細胞培地を交換し、以下の手順を4回繰り返して余分な細胞を取り除きます。プレートを平らに保ちながら、ウェルの側面から培地を穏やかに吸引します。

チップが乾燥しないように、十分なメディアを保持するように注意してください。4ミリリットルのPBSを追加し、チップの中心から吸引します。次に、ウェルの側面に移動して、以前と同様にPBSの大部分を吸引し、顕微鏡で浮遊細胞を確認します。

浮遊細胞が大量に残っている場合は、洗浄手順を繰り返してください。細胞が非常に少ない場合は、PBSの一部を吸引し、2ミリリットルの新鮮な培地の吸引液と交換し、4ミリリットルの新鮮な培地を2回追加します。細胞を細胞インキュベーターで3時間インキュベートし、細胞が完全に広がるようにします。

この方法を使用すると、マイクロパターンの10〜30%が1つのセルで占められ、他のパターンは空になるか、複数のセルで占められます。細胞をBLEスタチンで処理するには、17ミリモルの薬物ストック溶液を最終濃度5マイクロモルに希釈し、4ミリリットルの培地に0.1%DMSOで溶解します。コントロールでは、0.1%DMSOの培地を調製し、細胞培地のみを吸引し、チップの乾燥を防ぐためにBLEsスタチンまたはコントロール溶液と迅速に交換します。

細胞を摂氏37度で1時間インキュベートします。このインキュベーション中に、細胞骨格バッファーを調製します。2ミリリットルのcbに1グラムのスクロースを追加します。

これにより、内部の細胞構造が維持されます。1ミリリットルのCBスクロースと4ミリリットルの5%PFAを混合します。CBスクロース溶液に2ミリリットルのPFAを加えます。

新鮮な6ウェルプレートの2つのウェルで。細胞を固定するには、鉗子を使用してCYの2チップをピックアップし、CBショ糖溶液中に2ミリリットルのPFAを含む6ウェルプレートに入れます。細胞を室温で10分間インキュベートし、PFAを除去し、細胞をPBSで一度洗浄した後、2ミリリットルの100ミリモル塩化アンモニウムで細胞を10分間洗浄します。

残留PFA架橋活性を急冷するために、0.1%トリットン×100を含有するPBSを2ミリリットル添加して細胞を透過させ、1.5%BSA含有PBSで2〜2000のZI標識フェインを1〜2000でPBS染色アクチンフィラメントで2回洗浄し、室温で1時間インキュベートする。次に、細胞を2ミリリットルのPBSで一度洗浄します。次に、原子核を維持します。

PBSで売った1ミリリットルあたり1ミリグラムの2ミリリットルを加え、室温で3分間インキュベートします。2ミリリットルのPBSで2回洗います。alのような取り付け解決の25から30マイクロリットルの標準的なスライドに側面の2つのチップを取付けなさい。

3つの波長で画像を取得するために、イメージングソフトウェアMetamorphとNIKアイコンのeclipse T顕微鏡を使用します。CCDヘママツカメラとインテンスライト水銀ファイバーイルミネーターを搭載。まず、倍率20倍を選択します。

次に、メニュー バーで、多次元取得を開きます。実験のさまざまなパラメーターを設定します。まず、データの保存場所を指定します。

波長の数を3に設定し、SIの3波長を選択し、12のマイクロパターンがカメラフィールドの中央に配置されるようにカバースリップスライドを配置します。フィールドごとに視覚化されるマイクロパターンの数は、カメラと対物レンズの設定によって異なります。波長ごとに露光時間を設定し、オートフォーカス

PS threeの場合は、多次元集録を実行するジャーナルを作成し、MDA jnlとして保存します。スキャンステージ機能を開くと、12種類のマイクロパターンを含む24枚の画像を取得できます。マイナス400ミクロン×ステップサイズ、300ミクロン×ステップサイズで6列4行を入力し、ジャーナルMDAのjnlプレススキャンを実行して、3つの波長で24枚の画像の自動取得を開始します。

このビデオでは、Lマイクロパターンを使用して、細胞の未結合部分を支える単一の主要なアクチンストレスファイバーの形成をトリガーし、プレーンなフィブロネクチンに座っている細胞と比較して、BLEsスタチンの細胞への影響の視覚化と測定を簡素化します。自動化された画像処理と分析のために、生の画像のスタックからオープンソースプログラムの画像J用に書かれた2つのカスタムメイドマクロの概要を説明し、最初のマクロは個々のセルを抽出して参照セルを作成します。2つ目のマクロは、細胞膜の崩壊を測定します。

最初のステップは、生の画像から個々の細胞をセグメンテーションすることです。蛍光標識されたマイクロパターン画像は、マイクロパターンを中心とした領域をデリケートするために使用され、各波長の画像にトリミングされ、各波長のスタックに再組み立てされます。単一細胞のミクロパターンを選択するために、マクロは画像あたりの核の数を検出し、複数の核を含むもの、または核を含まないものをすべてのスタックで排除します。

最後に、画像Jプラグインのマルチスタックregを使用して、マイクロパターンの位置に基づいて収集されたすべての画像とすべてのチャネルを再調整します。このステップでは、シングルセル解析や参照セルの作成に使用できる個々の画像のラインスタックが生成されます。画像Jでは、参照セルは、フィルタリングされ整列された画像をスタックから投影することによって構築されます。

いくつかの投影方法を適用できますが、通常は、画像スタックの外れ値を排除するために中央値の投影が選択されます。参照セルは、マイクロパターンセルでのみ得られる表現および画像解析のためのユニークで有用なツールです。その調査を容易にするために、ルックアップテーブルまたはLUTを適用して、モノカラー画像をコード化された周波数マップに変換します。

BLEsスタチン効果を特徴付けるために、細胞の剛性と崩壊を2番目の画像Jマクロを使用して分析しました。簡単に言うと、Lマイクロパターンの閾値画像は、セルの三角形形状の理論的な斜辺を定義するために使用されます。次に、細胞形状を定義するために、アクトン染色画像の閾値化が行われます。

理論上の斜辺と実際の凹面細胞膜との間の面積の差は、理論上の斜辺の下の領域を示す細胞が測定され、崩壊していると見なされます。5マイクロモルのBLEsスタチンの影響は、処理条件と対照条件で崩壊した細胞の数を比較することによって特徴付けられました。BLEスタチンで処理された、または未処理のまま放置されたLマイクロパターン細胞の典型的な画像は、細胞が固定され、マイクロパターンを染色されたことを示しています。

アクチンと核はそれぞれ赤、緑、青で示されています。対照条件と比較したBLEsスタチンの細胞形状への影響に注意してください。BLEsスタチンまたはプレーンフィブロネクチンのコントロールとのインキュベーション後の代表的な細胞をここに示します。

細胞を固定して染色したアクチンと核はそれぞれ緑と青です。治療された状態と制御された状態の間の類似性に注意してください。BLEスタチンで処理した細胞または未処理のまま放置した細胞から得られた参照細胞の典型的な画像を示します。

このアプローチにより、研究中の表現型を簡単に観察できる可能性に注意してください。これは、マクロ斜辺を使用したBLEsスタチンの細胞への影響の分析の例です。対照細胞の25%が崩壊していましたが、アクチニン収縮ネットワークの弱体化を反映して、スタチン処理された5マイクロモルBLEs細胞では75%が3倍に増加しました。

これを見た後、接着剤のマイクロパターンがハイコンテント分析におけるいくつかのボトルネックをどのように解決するかを十分に理解しているはずです。まず、接着性のマイクロパターンを使用することで、画像キャプチャ処理の分析がはるかに簡単になりました。第二に、マイクロパターンは、薬物の形態と挙動を正常化することで細胞間のばらつきを減らすため、非常に低用量で薬物の非常に微妙な影響を検出することができます。

そして最後に、細胞解析で良好な結果を得るために通常必要な数千個の細胞と比較すると、当社の参照セルを使用して堅牢で有意な結果を得るには、数十個の細胞しか必要としません。