マイクロ流体パターニングと蛍光に基づく単一細胞細菌増殖の追跡

まず、カーボンフリーバッファーに蛍光タグを付けた細菌培養物を添加します。

遠心分離して細菌をペレット化し、上清を廃棄します。

中性洗剤を含む新鮮なカーボンフリーバッファーにペレットを再懸濁します。

炭素源がないと成長が止まりますが、洗剤は凝集を防ぎ、細胞を浮遊状態に保ちます。

細菌懸濁液を注射器に投入し、ポンプに接続します。

床に埋め込まれたトラップを備えたチャネルを含むマイクロ流体チップの入口に懸濁液を注入します。

チャネル出口から液体をゆっくりと引き出します。

液体が後退すると、毛細管現象の力が細菌を出口に導きます。

このプロセスでは、単一の細菌細胞がトラップに定着し、細菌のパターン化が生じます。

予熱した栄養豊富なブロスで水路を継続的に洗い流します。

細菌は増殖を再開し、トラップ内にマイクロコロニーを形成します。

蛍光顕微鏡を使用してタイムラプス画像をキャプチャし、制御された環境で細菌の増殖を分析します。

1ミリリットルのMOPS培地を遠心分離バイアルにピペットで入れ、10マイクロリットルの0.132モルリン酸カリウムを加えます。

100マイクロリットルの一晩培養物を遠心分離バイアルに分注し、培養物を2,300倍gで2分間遠心分離します。上清をそっと捨てて、0.015%のトゥイーン20と0.01%のリン酸カリウムを含む1ミリリットルの新鮮なMOPS培地にペレットを再懸濁し、細菌懸濁液を1ミリリットルのシリンジにロードします。シリンジとチューブ接続を固定するには、チューブに針を直接挿入します。

次に、シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がテンプレート領域をトラップで覆うまで、チャネルの上流部分にある入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入します。シリンジポンプを毎分0.07〜0.2マイクロリットルの流量に設定して、細菌懸濁液を回収し、顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視します。テンプレートを細胞でパターン化したら、引き抜き流量を上げてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、事前に少なくとも30分間脱気し、摂氏30度に予熱した新しいLBで洗い流します。

次に、シリンジポンプを毎分2マイクロリットルの流量に設定して、チャネルを穏やかに洗い流します。チャネルがいっぱいになったら、再び流量を上げます。増殖中の細菌を希望の倍率と時間間隔で画像を取得します。