Name: 機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 3 s
Description: 学ぶ シリカ被覆磁性ナノ粒子の合成とアミン官能化、デフェロキサミンとの結合方法。Yersinia enterocoliticaの捕獲効率を評価し、細菌診断への応用可能性を示す。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、クラウス・ハントケ教授(ドイツ・テュービンゲン大学)が、この研究で使用されたエルシニア・エンテオコリティカ株を親切に供給してくれたことを感謝する。この研究は、欧州連合(EU)のFEDERプログラムが共同出資するスペインの国家研究機関(AEI/FEDER)からのAGL2015-63740-C2-1/2-RおよびRTI2018-093634-B-C22(AEI/FEDER、EU)からの助成金によって支えられました。サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学とア・コルーニャ大学での研究も、GC2018/018、GRC2018/039、およびED431E 2018/03(CICA-INIBIC戦略グループ)の助成金によって支えられ、Xunta de Galiciaから。最後に、このビデオプロトコルのボイスオフを行う彼女の素晴らしいコラボレーションのためにヌリアカルボに感謝したいと思います。

注:不活性雰囲気条件下で行われた反応については、すべてのガラス製品は、以前に65°Cでオーブンで乾燥し、ゴム中隔で密封し、アルゴンで3回パージしました。
1. フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成
<ol><li>Fe3O4磁性ナノ粒子(MP)の合成<ol>
<li>20 mLガラスバイアルに0.5gのFe(acac)3を加え、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。3</li>
		<li>この混合物を2分間超音波処理し、加熱ブロックに移し、180°Cで72時間加熱します。</li>
		<li>反応が完了したら、バイアルを冷却し、ナノ粒子を4000 x gで4000 x gで30分間リンスし、遠心分離を少なくとも2回繰り返します。</li>
		<li>ネオジム(NdFeB)磁石を用いて磁力引力により上清からナノ粒子を分離し、残留溶媒を廃棄する。</li>
		<li>96%エタノール繰り返し工程1.1.4でリンスする。そして溶媒が透明に見えるまで40 kHzで1分間の浴中で超音波処理と交互に上清を捨てます。</li>
	</ol></li>
	<li>磁気ナノ粒子 SiO2コーティング(MNP@SiO2)<ol>
<li>80 mLのイソプロパノールでMNPの2gの懸濁液を調製し、4 mLの21%アンモニア、7.5mLの蒸留水、0.56 mLのテトラエチルオルソケイ酸(TEOS)を磁気攪拌棒で丸底フラスコに加えます。</li>
		<li>連続撹拌で40°Cで2時間加熱し、1時間超音波処理します。</li>
		<li>MNPを磁石で分離し、上清を捨て、イソプロパノールの30mLに分散させる。</li>
		<li>手順 1.2.1 を繰り返します。および 1.2.2.</li>
		<li>96%エタノールで磁気攪拌棒を取り出して洗浄し、すべての材料を回収します。</li>
		<li>磁石を用いて磁力で上清からナノ粒子を分離する。</li>
		<li>上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。</li>
		<li>室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>トリエトキシシラン(3-アミノプロピル)を用いたMNP@SiO2の機能化<ol>
<li>前工程から得られたMNP@SiO2の500mgを不活性雰囲気下でN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)でリンスし、40kHzで1分間超音波処理する。その後、上清を捨てて、この処理を3回繰り返します。</li>
		<li>丸い底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気攪拌棒で攪拌し、9 mLのAPTESを加えます。</li>
		<li>混合物を60°Cで12時間かき混ぜます。</li>
		<li>上清を捨て、超音波処理と交互に96%エタノールでナノ粒子をすすいだ。</li>
	</ol></li>
	<li>フェロキサミンの合成<ol>
<li>100mg(0.15ミリモル)のデフェキサミンメシル酸塩と53.0mg(0.15 mmol)のFe(acac)33を蒸留水5mLに5mLで溶解し、室温で一晩攪拌します。</li>
		<li>得られた生成物を分離漏斗で20mLのEtOAcで3回洗浄し、次いで、回転エバポレーターを使用して真空下で有機溶媒を除去する。</li>
		<li>水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンを赤い固体として手に入れる。</li>
	</ol></li>
	<li>N-スクシニルフェロキサミンの合成<ol>
<li>350mg(3.50 mmol)のコハク酸無水物を、不活性雰囲気下の50mLの丸底フラスコで5mLのピリジン中のフェロキサミン100mg(0.17ミリモル)の溶液に加えます。</li>
		<li>得られた混合物を室温で16時間かき混ぜます。その後、回転エバポレーターで減圧下でピリジンの過剰を除去し、濃い赤色の固形物を得た。</li>
		<li>反応粗物を3mLのメタノールに溶解する。</li>
		<li>メタノール溶液をセファデックスカラム(直径20mmの列に20cmのセファデックス)に移し、0.5 mL/minで溶出します。</li>
		<li>赤い分画を収集し、回転エバポレーターを使用して真空下でメタノールを除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>コンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faの合成<ol>
<li>乾燥MNP@SiO2の30mgをDMFで2回@NHし、ナノ粒子を100 mLのエルレンマイヤーフラスコで30分間不活性雰囲気下で30分間超音波処理します。</li>
		<li>N-スクシニルフェロキサミン(200mg、0.30ミリモル)、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-(ジメチルアミノ)-六フッ化ホスホウ酸ホスホニウム(BOP、 173 mg, 0.45 mmol), 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt, 46 mg, 0.39 mmol) およびN,N-ジイソプロピレチルアミン (DIPEA, 128.8 mg, 1.21 mmol) DMF (混合 A) の 10 mL で DMF (混合 A) 下で 50 mL のラウンド底フラスコス.</li>
		<li>アルゴンガス雰囲気(Mix B)を2使用して、乾燥した無酸素条件下での超音波処理の下でDMFの3mLで2@NH2をすすったMNP@SiOを中断します。</li>
		<li>ミックスAを加える B ドロップワイズをミックスします。</li>
		<li>室温でオービタルシェーカーを使用して最終混合物を一晩振ります。</li>
		<li>得られたコンジュゲート(MNP@SiO2@NH@Fa)を磁石を用いて懸濁液から分離する。</li>
		<li>得られた固体をリンスし、エタノールの10 mLでそれを5回超音波処理します。</li>
		<li>真空下で固体を24時間乾燥させます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. ナノ粒子を用いた病原性細菌の捕獲を定量化するY.エンテゴコリチ株による細菌アッセイ
<ol><li>滅菌2 mLチューブで1mg/mLでPBS内のすべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートの懸濁液を調製します。</li>
	<li>ルリア・ベルタニ(LB)の5mLでY.エンゴコリティカの培養を37°Cで一晩インキュベートして準備します。</li>
	<li>鉄欠損トリプティック大豆ブロス(TSB)の50 μLを10 mM 2,2′ビピリジルを加えて調製します。</li>
	<li>5 mLの鉄欠乏性TSBをY.エンゴコリチの一晩培養物の50 μLで接種し、OD600 = 0.5\u20120.8に達するまで撹拌して37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>ステップ2.4で得られた培養液の100μLを取り、900μLのPBSを含む2.0 mLチューブで希釈し、最初の1/10希釈を得た。次に、同じ手順を使用して最初の希釈から1/100希釈液を調製し、1 x 106コロニー形成ユニット(CFU)/mLで細菌細胞の濃度をほぼ得る。</li>
	<li>2.0 mLチューブの細菌懸濁液1/100希釈液の1mg/mLで1mg/mLのナノ粒子懸濁液を100μL加え、渦で均質化します。</li>
	<li>培養液を20°Cで1時間培養する。</li>
	<li>磁石を用いてMNP/バクテリアの凝集体を分離し、上清を慎重に捨てます。</li>
	<li>ボルテックスを使用して1 mL PBSで分離したナノ粒子を2回リンスする。</li>
	<li>ナノ粒子をPBSの1 mLで懸濁し、CFU/mLでの細菌捕獲量をカウントします。</li>
	<li>前の懸濁液から1 x10-4希釈に達するまで4回連続して1/10希釈液を調製する。</li>
	<li>各希釈液を10μLずつTS寒天プレートにプレートし、一晩で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。個々のコロニーの数を数えるためにスポットを増幅するために適切なソフトウェアで画像を処理します。 注:各MNP中間体は、合成の進捗状況をフォローアップすることを特徴としました。まず、結晶構造を確認するためにXRDによって裸のMPを研究した。次いで、各中間体のFT-IRスペクトルを実行し、対応する反応で生じた変化をチェックした。また、各中間体のラマン分光分析もFT-IRスペクトルから推測された結論を確認するために行った。TGA分析により、有機材料を持つ中間体の重量の損失を推定することができました。各中間体の形態および大きさをTEMによって研究した。最後に、XPS分析は、各MNP中間表面における原子酸化状態を決定し、コンジュゲートMNP@SiO2@NH@Faにおける共有結合形成を確認するために重要であった。</li>
</ol>

<ol><li>Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles+for+the+manipulation+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells.</a> Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).</li>
<li>Zheng, T., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-based+detection+of+Fe%28III%29+and+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens.</a> Metallomics. 4, 866-880 (2012).</li>
<li>Hider, R. C., Kong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li>
<li>Sandy, M., Butler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Iron+Acquisition%3A+Marine+and+Terrestrial+Siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores.</a> Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).</li>
<li>Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetite+Nanocrystals+%3A+Nonaqueous+Synthesis%2C+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization.</a> Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).</li>
<li>Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+silica+coated+iron+oxide+magnetic+nano-particles%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+-+Part+A%3A+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles.</a> Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).</li>
<li>Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+tissue+plasminogen+activator+by+binding+to+silica-coated+magnetic+nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).</li>
<li>El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+glyco-nanoparticles%3A+a+unique+tool+for+rapid+pathogen+detection%2C+decontamination%2C+and+strain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation.</a> Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).</li>
<li>Martínez-Matamoros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+functionalized+magnetic+nanoparticles+conjugated+with+feroxamine+and+their+evaluation+for+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection.</a> RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).</li>
<li>Cozar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+surface-enhanced+Raman+study+of+desferrioxamine+B+and+its+Fe%28III%29+complex%2C+ferrioxamine+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B.</a> Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).</li>
<li>Shebanova, O. N., Lazor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a-C%3AH+and+oxygen-containing+Si%3AC%3AH+films+by+Raman+spectroscopy+and+XPS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solid+State+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS.</a> Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).</li>
<li>González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopic+study+of+bioactive+silica+based+glasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Non-Crystalline+Solids%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses.</a> Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).</li>
<li>Veres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a-C%3AH+and+oxygen-containing+Si%3AC%3AH+films+by+Raman+spectroscopy+and+XPS%5BTitle%5D)+AND+%22Diamond+and+Related+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS.</a> Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+investigation+of+Si-C+covalent+bonding+of+single+carbon+nanotube+grown+on+silicon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate.</a> Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).</li>
<li>Graf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPS+and+NEXAFS+studies+of+aliphatic+and+aromatic+amine+species+on+functionalized+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science%22%5BJournal%5D)">XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces.</a> Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).</li>
<li>Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+HMDSO%2FO2+plasma+deposits+using+a+high-sensitivity+and+-energy+resolution+XPS+instrument%3A+curve+fitting+of+the+Si+2p+core+level%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level.</a> Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).</li>
<li>Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+bacteriophage+conjugated+magnetic+particles+for+E.+coli+capturing%3A+Influence+of+bacteriophage+loading%2C+temperature+and+tryptone%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).</li>
<li>Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+amino-functionalized+magnetic+nanoparticles+for+enhancement+of+bacterial+capture+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency.</a> RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).</li>
<li>Zhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+pathogenic+bacteria+and+viruses+by+multifunctional+amine-modified+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles.</a> Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).</li>
</ol>

開示するものは何もありません。

このプロトコルは、共有結合による磁性ナノ粒子とシドロフォアフェロキサミンとのコンジュゲートの合成を記述する。マグネタイトの合成は、水系における腐食の磁気コアを保護するためにシリカコーティングを続けて、ピナら5によって報告されたプロトコルを用いて行い、凝集を最小限にし、機能化に適した表面を提供する6。シリカコーティング工程を改変した。Li et al.6によって報告された3つのコーティングを行う代わりに、Mpは、APTES7で機能化ステップを継続するのに十分であったこの方法(図2D)において2つのシリカ層でコーティングされた。
デフェソキサミンは、室温で数時間以内に分解しやすいため、鉄(III)と錯体した。鉄錯体を得る最良の方法は、液体-液体抽出による精製が非常に簡単であり、フェロキサミンが定量収率で得られるので、アセチルアセトネート鉄...

MNPを用いた細菌検出方法は、抗体の分子認識に基づく、アプタマー、バイオプロテイン、病原性細菌1によってMNPに結合した炭水化物。シレブロフォアは細菌の外膜上の特定の受容体によって認識されることを考慮に入れて、彼らはまた、それらの特異性を増加させるためにMNPにリンクすることができます2.シドロフォアは、細菌3、44によるFe3+取り込み3に関与する小さな有機分子である。サイドロフォアとMNPの間のコンジュゲートの調製と、細菌の捕獲および単離に対する評価はまだ報告されていない。
小分子を用いた磁性ナノ粒子のコンジュゲート合成における重要なステップの1つは、MNPの表面に小分子が結合していることを確認するために結合の種類または相互作用の選択である。このため、磁気ナノ粒子とフェロキサミン(エルシニア・エンゴコリチカが認識するシドロフォア)とのコンジュゲートを調製する手順は、MNPの変更可能な表面の生成に焦点を当て、カルボジイミド化学によってシデロフォアに共有結合することを可能にした。均一なマグネタイトナノ粒子(MNP)を得るために、核形成及びサイズ制御を改善するために、ベンジルアルコールとのソルボ分解反応を、振盪せずに熱ブロック中に運んだ。次いで、水性媒体6におけるナノ粒子懸濁液の保護と安定性を向上させるステーバー法によりシリカコーティングを生成した。フェロキサミンの構造を考慮して、シデロフォアと共役する適切なナノ粒子(MNP@SiO2@NH2)2を生成するためにアミン基の導入が必要である。2これは、ソルゲル法7を用いてシリカ改変ナノ粒子(MNP@SiO2)の表面に存在するアルコール基を用いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(apTES)の凝縮によって達成された。
並行して、フェロキサミン鉄(III)錯体は、水溶液中のアセチルアセトネートの鉄と市販のデフェオキサミンを複合化することによって調製した。N-スクシニルフェロキサミンは、リンカーとして作用するスクシニル基を持ち、コハク酸無水とフェロキサミンの反応により得られた。
MNP@SiO2@NH22とN-succinylferoxamineの間の結合は、MNP@SiO2@NH@Fa@を与えるために、カップリング試薬ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-()を使用してカルボジイミド化学を介して行った( ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を軟質塩基性培地中でN-スクシニルフェロキサミン8中の末端酸基を活性化する。 N2
MPが特徴付けられると、野生型(WC-A)およびフェロキサミン受容体FoxAを欠くY.エンテオコリチカ(FoxA WC-A 12-8)の変異体を捕捉する、裸で機能的な磁気ナノ粒子の能力を評価した。プレーンMP、機能化されたMPおよび共役MNP@SiO2@NH@Faは、各@Y.エンゴコリチカ株と相互作用することを許可した。バクテリア共役凝集体を、磁場の印加により細菌懸濁液から分離した。分離した凝集体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で2回リンスし、PBSで再懸濁して連続希釈を調製し、次いでコロニー計数用にメッキした。このプロトコルは、MNP@SiO2@NH@Faの合成の各ステップ、全ての中間体および共役体の構造的特徴付け、および中間体に関するコンジュゲートの特異性を評価する容易な方法として細菌捕獲アッセイを示す。9

<table><tbody><tr><td>1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物 HOBT</td><td>Acros</td><td>300561000</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-ビピリジル</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D216305</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリエトキシシラン 99%</td><td>Acros</td><td>151081000</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム溶液 28% NH3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸BOP試薬</td><td>アクロス</td><td>209800050</td><td></td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>822259</td><td></td></tr>デ<tr><td>フェロキサミンメシル酸塩>92,5%(TLC)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、無水、96%</td><td>パニーズアック</td><td>131085</td><td></td></tr><tr><td>エチルアセテート、エクストラピュア、SLR、フィッシャーケミカル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセチルアセトン酸鉄(III)97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F300</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス(レノックス)</td><td>Sigma</td><td>Aldrich L3022</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン、99.5+%, アクロシール</td><td>アクロス</td><td>459591000</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド、99.8%、エクストラドライ、アクロシール</td><td>アクロス</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>ピリジン、99.5%、エクストラドライ、アクロシール</td><td>アクロス</td><td></td><td></td>339421000</tr><tr><td>セファデックス LH-20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>LH20100</td><td></td></tr><tr><td>無水コハク酸 >99%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>239690</td><td></td></tr><tr><td>オルソリケート テトラエチル >99,0%</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>86578</td><td></td></tr></tbody></table>

機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

本研究では、磁気ナノ粒子の合成、SiO2によるそのコーティング、2続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、エルシニアエンゴコリチカによって認識される副腎泳動であるデフェオキシアミンとの共役が、コルチニル部分をリンカーとして用いた。
マグネタイト(Fe3O4)の磁性ナノ3粒子(MNP)をソルボ熱法で調製し、ステーバー法を用いてSiO2(MNP@SiO2)で被覆し、続いてAPTESとの官能化を行い、その後にAPTES(MNP@SiO2@NH2)を用いた。2 222次いで、フェロキサミンをカルボジイミドカップリングによりMNP@SiO2@NH2と共役し、MNP@SiO2@NH2@Faを与えた。222コンジュゲートおよび中間体の形態と特性は、粉末X線回折(XRD)、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)、ラマン分光法、X線光電子分光(XPS)、透過電子顕微鏡(TEM)、エネルギー分散X線(EDX)マッピングを含む8つの異なる方法で調べた。この徹底的な特徴付けにより、コンジュゲートの形成が確認された。最後に、ナノ粒子の容量と特異性を評価するために、それらは、エルシニアエンテオコリチカを用いた捕獲細菌アッセイで試験した。

各中間体と最終コンジュゲートの形態と特性を決定するために、徹底的な構造特性化が行われます。この目的のために、技術XRD、FT-IR、ラマン分光法、TGA、TEM、EDXマッピングおよびXPSは、共役体の形成を実証するために使用される。X線光電子分光法(XPS)によって獲得されたナノ粒子の表面における原子の酸化状態は、ナノ粒子とシドロフォアとの間の共有結合の形成を確認するための最も関連するデータである。これらの結果に同意して、このプロトコルは再現可能です。
裸MNP、機能化されたMPおよび共役体は、PBS溶液中の各Y.エンゴコリチカ株と混合される。バクテリア-Mpの凝集体は磁石を使用して懸濁液から分離される。凝集体をPBSで2回リンスした後、PBSで再懸濁してコロニーカウント用にメッキされる連続希釈液を調製する。
このプロトコルを用いて調製した中間体および最終的な共役は、合成の各ステップで起こる変化を表示するためにいくつかの技術に提出された。赤外線およびラマン分光法は、合成の各ステップを監視するための簡単かつ迅...

この研究は、磁気ナノ粒子の調製のためのプロトコル、SiO2でのコーティング、続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、コクニル部分をリンカーとして使用したデフェキサミンとの結合を説明する。すべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートに対してY.エンゴコリティカを用いた深い構造特性評価の説明および捕獲細菌アッセイも詳細に説明する。

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

磁気ナノ粒子は、磁気特性が強く、表面の機能化が容易なため、分析科学やナノ医薬品に最適なツールです。ここでは、アミノ機能化シリカ磁性粒子とシドロフォアフェロキサミンとの間のコンジュゲートの最初のインスタンスを、フォトジェニック材料の捕捉評価と共に報告する。シドロフォアは、鉄のパタケ機構において重要な役割を果たす小さな有機分子であり、細菌の特定の外膜受容体によって認識されています。このビデオは、ステップバイステップで、磁気鉄ナノ粒子を調製するための効率的なプロトコルを表示します。次いで、分散液を保護し、磁気核を保護するためにシリカでコーティングしました。得られた反応器表面をアミン基で機能させた。フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成20 mLガラスバイアルに0.5グラムのFe(acac)3を加えます。その後、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。この混合物を2分間超音波処理します。その後、加熱ブロックに移し、摂氏180度で72時間加熱します。ナノ粒子を96%エタノールでリンスします。そして30分間遠心分離機。ネオジム磁石を用いて、磁力により上清からナノ粒子を分離する。残留溶媒を捨てる。溶剤が透明に見えるまで、超音波処理と交互に上清を捨てます。80ミリリットルのイソプロパノールで2グラムのMNPの懸濁液を調製し、4ミリリットルの21%アンモニア、7.5ミリリットルの蒸留水、および0.56ミリリットルのTEOSを加える。混合物を摂氏40度で2時間加熱し、連続攪拌します。その後、1時間超音波処理します。MNPを磁石で分離し、上澄み物を捨て、イソプロパノールの30ミリリットルに分散し、アンモニア、蒸留水、およびTEOSを、前述の順序と同じ順序で添加する。連続攪拌で2時間40度の摂氏で混合物を加熱します。その後、1時間超音波処理します。磁気スターバーを取り外して便利に洗い、すべての材料を回収します。上清を捨て、96%エタノールでナノ粒子を3回すすいで、超音波処理と交互に。室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。ジメチルホルムアミドを用いて前工程から得られたMNP@SIO2の500ミリグラムをリンスする。それらを超音波処理し、破棄します。丸底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気バーでかき混ぜ、9ミリリットルのAPTESを加えます。60度で12時間かき混ぜます。上清を捨て、96%エタノールでナノ粒子を3回すすいで、超音波処理と交互に。100mgのデフェキサミン、メシル酸塩、53.0ミリグラムの鉄アセチルアセトネートを5ミリリットルの蒸留水に溶解します。混合物を室温で一晩かき混ぜます。得られた生成物を分離漏斗で20ミリリットルの酢酸エチルで3回洗浄する。真空下で有機溶剤を除去します。水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンと赤い固体を与えます。50ミリリットルの丸底フラスコで5ミリリットルのピリジンで100mgのフェロキサミンの溶液に350ミリグラムのコハク酸無水物を加える。得られた混合物を室温で16時間かき混ぜる。減圧下で過剰のピリジンを除去する。反応粗物を3ミリリットルのメタノールに溶かします。メタノール溶液をLH-20カラムに移し、0.5 mL/分で溶出します。赤い分画を収集し、真空下でメタノールを除去します。乾燥アミンの30mgをDMFで2回、ナノ粒子を100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで30分間超音波処理する。200ミリグラムN-スクシニルフェロキサミンの溶液を準備し、 173 ミリグラム ベンゾトリアゾール 1-yl-オキシトリスホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩 BOP, 46 mg 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール HOBt および 128.8 ミリグラム N, N-ジイソプロピレチルアミン DIPEA, DMF 10 mL, 50 ミリリットルラウンドボトムフラスコス.乾燥した酸素のない状態で超音波処理の下で、DMFの3ミリリットルで、以前にすすったMNP@SiO2@NH2を中断します。アルゴン雰囲気を使用してください。加えます, ドロップワイズ, Bを混合 B.シェイク最終混合物, 軌道シェーカーを使用して, 室温で一晩.得られたコンジュゲートを磁石を用いて懸濁液から分離する。Y.エンゴコリチカ株による細菌アッセイは、ナノ粒子を含む病原性細菌の単離および捕獲を定量化する。滅菌チューブ内の1mg /mLですべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートをPBSに調製します。ルリアベルタニ、LB、スープの5 mLでY.entorocoliticaの文化を一晩準備します。鉄欠乏性の5 mLのトリプケース大豆ブロス、TSB、10 mM 2、2-ビピリジル溶液の50マイクロリットルを添加して調製します。Y.エンゴコリチカの一晩培養物の50マイクロリットルで5ミリリットルの鉄欠乏性TSBブロスを接種する。0.5~0.8のOD600に達するまで、攪拌で37度のインキュベート。一晩培養した100マイクロリットルを取り、900マイクロリットルのPBSを含むチューブで希釈し、最初の1/10希釈液を得る。次いで、同じ手順を用いて最初の希釈から1/100希釈を調製し、10で細菌細胞の濃度を得て、ミリリットル当たり6コロニー形成単位の電力を得た。1/100細菌希釈液の1ミリリットルに100マイクロリットルのナノ粒子懸濁液と1mg/mLを加えます。MNP菌凝集体を分離し、磁石を用いて、廃棄し、慎重に、上清を廃棄する。分離したナノ粒子を1ミリPBSで2回、渦を使用してリンスする。前の懸濁液から4つの連続した1/10希釈液を準備し、マイナス4希釈の力に10を供給する。TS寒天プレートに各希釈液の10マイクロリットルをプレート。エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。画像を処理し、便利なソフトウェアを使用して、個々のコロニーの数をカウントするスポットを増幅する。ナノ粒子とシドロフォアとの共有結合の形成を確認するために、我々は、各ステップで新しい官能基と一致して新しいバンドがどのように出現するかを観察し、合成を監視するためにFT-IRラマン分光法を採用しています。TEMおよびSEM顕微鏡を用いて、形態および粒子サイズを観察した。熱重量分析は、有機材料の添加による重量損失を測定する。そして、XPSは、表面の原子の異なる酸化状態を分析し、共有結合の形成を確認することを可能にします。最後に、最終的なコンジュゲート上のすべての中間体を使用して、細菌を捕捉する能力をテストし、バイオセンサーとしての特性を確立しました。このプロトコルは、マグネタイトナノ粒子の高い生体適合性を利用するように設計されました。シリカによるコーティングは、分散を改善し、水性媒体の劣化から磁気核を保護します。また、カルボディイミド化学によって酸修飾シデロフォアを共有結合するために必要なアミン基と機能化する反応性表面を与える。この場合、N-スクシニルフェロキサミン。コンジュゲート細菌捕獲能力を試験し、その結果、PBS細菌懸濁液に提示されたかさばる効果に関する特定の相互作用のために中間体と有意な差を与えることなく、少数のコロニーが見つかった。

synthesis-functionalized-magnetic-nanoparticles-their-conjugation

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。...

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

このビデオでは、ナノセンサーを使用して食品や水のサンプルに含まれる細菌汚染物質を検出する技術を示しています。標的となる病原菌は、磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせによって検出されます。...

蛍光磁気ナノセンサーによる細菌汚染の検出

このビデオは、異なるセットに染色されたカルボキシル化磁性ポリスチレン微小球を使用した多重化された定量的細菌検出を示しています。この手順には、ビーズ-バクテリア複合体の形成、磁気分離、およびフローベースの分析が含まれ、同じ反応ウェル内の複数のバクテリアの正確かつ同時定量が可能になります。...

色素標識磁性ミクロスフェアを用いたマルチプレックス定量的細菌検出

ここでは、強力な磁気モーメントと強い近赤外（NIR）吸光度磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルを記述します。このプロトコルはまた、分子特異的な標的化を必要とするさまざまな生物医学アプリケーションのためのFc部分を介してナノ粒子への抗体結合が含まれています。...

Immunotargeted磁気プラズモニックナノクラスターの合成

非対称性のフェロセン種の合成は、溶液技術を使用して困難です。 本稿では、固相合成による簡便でクリーンな反応を用いてフェロセン-ビオチンバイオコンジュゲートを作製する方法に焦点を当てる。...

固相樹脂系の方法論を経由して、非対称フェロセン派生バイオコンジュゲートシステムのための合成方法論

マイクロ波技術は、アテローム性動脈硬化症のプラークの特徴付けのための酸化鉄ナノ粒子の非常に高速な合成を可能にします。ナノ粒子の外部側のアミノビスフォスフォネートの使用は、アテローム性動脈硬化症領域での高速蓄積を提供します。...

アテローム性動脈硬化症の高速検出のための酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波駆動型の合成

コバルトドープマグネトフェリチンの合成とカチオン化のためのプロトコールと、カチオン化マグネトフェリチンで幹細胞を迅速に磁化する方法が紹介されています。...

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

結核菌抗原の血清学的診断試験を改善するために、肺外結核を検出する超常磁性鉄ナノプローブを開発しました。...

超常磁性鉄酸化物ナノプローブの合成、特性解析、応用による肺外結核検出

酸化鉄ナノ粒子は、非水性ゾルゲル法を介して合成され、アニオン性短分子またはポリマーでコーティングされる。ヒト幹細胞内部の磁気ナノ粒子の組み込みや生体変換をモニタリングするための磁気測定の使用は、振動試料磁力計(VSM)を用いて実証されています。...

磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする

この研究では、特定の細胞を標的とする抗体を用いて磁性ナノ材料を生体機能化するためのプロトコルを提供します。その一例として、鉄ナノワイヤを用いてがん細胞を標的としています。...

磁性ナノ材料の生体機能化

学ぶ シリカ被覆磁性ナノ粒子の合成とアミン官能化、デフェロキサミンとの結合方法。Yersinia enterocoliticaの捕獲効率を評価し、細菌診断への応用可能性を示す。

機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

さらに動画を探す