色素標識磁性ミクロスフェアを用いたマルチプレックス定量的細菌検出

スペクトル的に異なる蛍光色素で内部染色された磁性ポリスチレン微小球の混合物を含むアッセイプレートを取ります。

各マイクロスフェアセットは、異なる病原性細菌特異的捕捉抗体と共有結合しています。

熱殺した病原性細菌混合物を加えます。インキュベート。

捕捉抗体は標的細菌抗原に結合し、マイクロスフェア-細菌複合体を形成します。

磁気分離器を使用して複合体を沈殿させます。結合していない細菌を捨て、バッファーで洗浄します。

マイクロスフェア結合細菌に特異的に結合するバッファーとビオチン化検出抗体を追加します。

複合体を磁気的に分離し、バッファーで洗浄します。

複合体をバッファーに再懸濁します。ピペットレポーター分子は、ビオチン化検出抗体に結合する蛍光色素共役ストレプトアビジンを含む。

複合体を磁気的に分離して洗浄します。バッファーに再懸濁します。

フローベースの分析では、最初のレーザーがマイクロスフェアの内部蛍光色素を励起し、独自のスペクトルシグネチャを生成し、独自のマイクロスフェアセットを識別します。

2番目のレーザーは、マイクロスフェア上の細菌に結合した蛍光色素レポーターを励起し、さまざまなミクロスフェアセット上の細菌を定量し、多重化された定量的細菌検出を可能にします。

サンプルを捕捉するには、まず50マイクロリットルのマイクロスフェア、または抗体を捕捉するために結合したビーズを96ウェルプレートに加えます。次に、50マイクロリットルの病原菌に続いて50マイクロリットルのPBS-TBNをバックグラウンドウェルに加えます。

プレートをホイルプレートシールで覆い、プレートシェーカーで800rpmで1時間インキュベートします。

その後、プレートを磁気セパレーターに1分間置き、ビーズを分離します。プレートを磁気プレートセパレーターに保持したまま、残りの溶液を排出します。次に、実験用ペーパータオルで3〜4回軽くたたいて乾かします。PBS-TBNでウェルを2回徹底的に洗浄します。

サンプル検出の場合は、50マイクロリットルのアッセイバッファーに続いて、50マイクロリットルのビオチン化検出抗体を1ミリリットルあたり4マイクログラムの濃度でウェルに加えます。

プレートを暗所で1時間インキュベートして、細菌と検出抗体の間の効率的な相互作用を可能にします。続いて、磁気分離器を使用してビーズを分離し、前述のようにPBS-TBNでビーズを洗浄します。

ビーズを50マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁し、50マイクロリットルのストレプトアビジン-R-フィコエリトリンまたは蛍光レポーター分子であるSAPEを加えます。プレートをホイルプレートシールで覆い、プレートシェーカーで30分間インキュベートします。

ウェルを洗浄したら、ビーズを100マイクロリットルのPBS-TBNに再懸濁し、プレートをフローベース分析装置にロードします。

適切なソフトウェアを使用して測定値を記録します。各生物の正味中央値蛍光強度値は、標準曲線を介して評価して、サンプル中に存在する細菌量を決定できます。