光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

この手順の全体的な目的は、最新の光遺伝学的手法を適用し、in vitroのスライス標本において標的となる神経経路を光刺激することです。これは、まず目的の神経細胞株にchannel rhodopsinを発現させることで達成されます。手順の第2段階では、研究対象となる ilgiliな脳構造の急性スライス標本を作成します。

次のステップでは、チャネルロドプシンを発現している線維への光刺激に対する、スライス標本内のニューロンからの応答を記録します。最終ステップでは、チャネルロドプシンを発現しているニューロンおよび線維の分布をイメージングします。最終的に、この手法により、オプトジェネティクスで標的とした神経成分へのレーザースキャニング光刺激を用いて、神経回路の機能的なトポグラフィーおよびシナプス特性の評価が可能になります。

従来の電気刺激法に対する本手法の主な利点は、特定のニューロン細胞種を特異的に標的として刺激し、それらの長距離投射をin vitroで検討できることです。この手法は、複雑な神経回路の機能的組織化など、システム神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。トランスフェクション効率を高めるためのpolyを4 µg/mL含有するウイルス溶液を注入するため、注射器と針を準備してください。

その後、シリンジポンプを用いて溶液200 nanolitersを圧注します。2～3週間後には、チャネルロドプシンがスライス内で十分に発現します。作製は可能な限り迅速に行う必要があります。注入済みの脳を取り出した後、清潔なカミソリを用いて脳を希望の方向でブロック状に切り出します。次に、脳の切り出し面を瞬間接着剤を用いて切断ステージに固定します。

次に、ステージを冷却されたバイブラトム切断チャンバーへ移し、氷冷したA CSFをチャンバー内に注ぎます。脳切片をバイブラトムを用いて4〜500 µmの厚さの切片にスライスします。脳切片を酸素供給された保持チャンバーに移し、実験に進む前に30 °Cで少なくとも1時間インキュベートします。

実験の準備が整ったら、脳切片を電気生理学的記録装置のステージに移動させます。標準的なホールセルパッチクランプ法を用いてニューロンの記録を行います。ピペットに正圧をかけながら、記録用ピペットをニューロンの近傍に配置します。

細胞との接触が完了した後、圧力を解放し、吸引をかけてギガシールを形成します。次に、短時間の吸引を行い、細胞膜を破砕してホールセル構成にした後、電圧クランプまたは電流クランプモードで記録を行います。レーザースキャナーは、tidal waveまたはEFAsデータ収集ソフトウェアのいずれかを使用して操作してください。

レーザーの出力を制御するため、使用前にソフトウェアをフォトダイオードで校正する必要があります。光路上に可変ニュートラル密度ホイールを設置します。ホイールを回転させ、後焦点面で測定を行うことでレーザーの出力を調整します。

出力は通常、25からD milliwattsの間に設定します。シャッターのパルスパラメータによって、ソフトウェア内での刺激の長さとタイミングを制御します。刺激する領域の画像は、ビデオキャプチャ機能を用いて作成できます。

次に、間隔 80 micron の 16 × 16 グリッドなどの刺激グリッドを設定します。その後、取得した画像にグリッドを重ね合わせ、XY座標とオフセット角度を調整して、刺激を開始するための最適な向きに設定します。マップ機能を有効にします。

データは保存され、tidal waveのオフライン解析プログラムを用いて解析するか、あるいはEFAsソフトウェアのマップ解析プログラムを用いて解析することができます。スライスでの生理学的記録を完了した後、YFPタグ付きチャネルオプシンの発現パターンを記録できます。まず、4°Cにて0.01 M PBS中の4% PFAでスライスを一晩固定します。

翌日、スライスを30% sucrose 4% PFA溶液に移し、一晩かけて凍結保護を行います。その翌日、クライオスタットを用いてスライスを50 micronの厚さに切片化します。切片をPBSで洗浄し、抗退色剤を用いて共焦点顕微鏡でのイメージングのために封入します。

白色光で関心領域を特定した後、励起波長に514 nm、蛍光波長に527 nmを使用します。これは、興奮性グルタミン酸作動性ニューロンにおいてchannel rod Dobsonを発現させるYFPAウイルス構築物（EYFP）をイメージングするためであり、BSYマウスの一次視覚皮質に注入されました。

ウイルス発現は、一次視覚野と二次視覚野の間の経路、およびLGNの皮質視床繊維において確認された。星印で示した二次視覚野のニューロンからのホールセルパッチクランプ記録により、ePSCが検出された。チャネルロドプシンの発現繊維のレーザースキャン光刺激の結果、V2の下層および一次体性感覚野の第6層からの皮質視床投射が認められた。腹側後核は、第6層の皮質視床ニューロンおよびその投射にチャネルロドプシンを発現させるためのCre-Loxアプローチを用いて解析された。期待通り、CreトランスジェニックマウスへのFlocked AAV構築物の導入により、標的とした第6層ニューロンおよび第4層まで延びるその繊維においてチャネルロドプシンが発現した。

Channelrhodopsin-EYFPの発現は、VPに投射する線維においても認められ、VPニューロンから生理学的記録を行った。ホールセルパッチクランプ法を用いた解析により、星印で示された記録ニューロン近傍への光刺激に続き、ePSCを誘発できることが明らかになった。オフライン解析では、VPにおける光刺激に対する平均応答振幅を示している。Channelrhodopsin-EYFPを発現する第6層皮質視床ニューロンの50 micron厚切片を再切断して解析した結果、第6層から第4層へと走行し、そこで終末して広範に樹状分枝する標識線維の微細なパターンが認められた。

さらに、皮質視床線維が白質に入り、視床に向かって走行していることが観察されました。このビデオを視聴することで、in vitro スライス標本において、標的となる神経経路を光刺激するために現代的な光遺伝学的手法を適用する方法について、十分に理解できたはずです。なお、本手順に関連する校正ステップにおいて、レーザーの使用は極めて危険であることに十分注意してください。

保護メガネを着用してください。