Name: 光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶ光遺伝学的レーザー走査光刺激法を用いた前脳回路の機能解析。Channelrhodopsin発現ニューロンを標的に、in vitro脳切片でシナプス特性と神経回路の機能トポグラフィーを評価する。

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この研究は、NIH/NIDCD grant R03 DC 011361、SVM CORP grant LAV3202、NSF-LA EPSCoR grant PFUND86、Leica Microsystems (CCL) および NIH/NIDCD grant R01 DC 008794 (SMS) からの出版助成金によって支援されました。

1. 手術と注射
<ol>
	<li>ケタミン(100-120 mg / kg)とキシラジン(7.5-16 mg / kg)の腹腔内注射(22-25 G針を推奨)を使用してマウスに麻酔をかけます。.
	<ol>
		<li>反応が引き出されなくなるまで、つま先を強くつまんで鎮静を評価します。.記載されているすべての動物手順については、必要に応じて地域のIACUCガイドラインに従うように変更してください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鎮静したマウスを定位固定装置に置き、頭と耳をそれぞれのホルダーに固定します。
	<ol>
		<li>動物を定位固定装置に入れる前に、滅菌眼科用軟膏で目を滑らかにします。.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>カミソリで頭皮を剃り、ベタジン綿棒でその部分を滅菌します。</li>
	<li>メスを使用して、正中線切開をカットし、注入する領域の上の皮膚とその下の筋肉を反射させます。</li>
	<li>メスの刃をトレフィンとして回転させて、露出する領域の上で開頭術を行います。または、ドレメルに取り付けられた小さなドリルビットを使用して開頭術を行います。
	<ol>
		<li>開頭術を行うには、メスの刃またはドリルビットを頭蓋骨の表面に置き、十分な骨が発掘されて下の軟膜が現れるまでゆっくりと回転させます。</li>
		<li>最初の掘削が完了したら、細い鉗子を使用して開頭術を拡大し、端から骨を慎重に取り除きます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 μLのシリンジに注入するウイルス溶液(UNC Vector Core)を充填します。
	<ol>
		<li>トランスフェクション効果を高めるには、4 μg/mLポリブレンでウイルス溶液を調製します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射する領域に針を下げ、シリンジポンプでウイルスを含む溶液200nlを圧力注入します。
	<ol>
		<li>針を引き出す前に、シリンジを10分間放置します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非吸収性のモノフィラメントナイロンで皮膚を縫合し、切開部を抗生物質軟膏で覆います。
	<ol>
		<li>縫合糸は7〜10日後に取り外す必要があります。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>術後鎮痛のためにブプレノルフィン(0.05-0.1 mg / kg)を注射します。.</li>
	<li>チャネルロドプシンの適切な発現を可能にするために、動物が術後14〜21日間回復するのを待ちます。.</li>
</ol>
2. スライスの準備
<ol>
	<li>回復期間の後、イソフルラン麻酔で動物に深く麻酔をかけます。これは、後足および/またはつま先がしっかりとつまんでいるときの離脱反射がないことによって確認されます。</li>
	<li>斬首によって脳を解剖し、続いて頭蓋骨に正中線と前頭の切り傷を付けます。</li>
	<li>頭蓋骨を正中線から剥がして脳を露出させます。</li>
	<li>細かいスコップスパチュラを使用して脳を慎重に取り除き、脳神経を脳の基部から分離します。</li>
	<li>冷やした氷冷人工脳脊髄液(ACSF;mM:125 NaCl、3 KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgCl2、2 CaCl2、25 NaHCO3、25グルコース)を含む小さな100 mlビーカーに解剖した脳をすばやく入れます。</li>
	<li>ACSFから脳を取り出し、ACSFで予め濡らした濾紙で覆われた顕微鏡スライドに置きます。</li>
	<li>きれいなかみそりの刃を使用して、脳を希望の方向にブロッキングカットします。</li>
	<li>脳の詰まった表面を瞬間接着剤で切断ステージに貼り付けます。</li>
	<li>ステージをビブラトーム切断チャンバーに移します(切断の準備ができるまで冷凍庫に保管されます)。</li>
	<li>氷冷したACSFをカッティングチャンバーに注ぎます。</li>
	<li>振動組織スライサーを使用して、脳切片を400〜500μmでスライスします。</li>
	<li>脳切片を酸素化ACSFを含む保持チャンバーに移し、実験前に30°Cで少なくとも1時間インキュベートします。</li>
</ol>
3. 生理学的記録
<ol>
	<li>インキュベーション期間後、スライスを改造した顕微鏡ステージの記録チャンバーに移します。</li>
	<li>実験中は、プラチナワイヤースライスホルダーに取り付けられた数本のナイロンフィラメントを使用して、スライスを浴に固定します。</li>
	<li>スライスをACSFで常に灌流します。</li>
	<li>127 K-グルコン酸、3 KCl、1 MgCl2、0.07 CaCl2、10 HEPES、2 Na2-ATP、0.3 Na-GTP、0.1 EGTAを含む細胞内溶液で満たされた場合、記録ピペットの先端抵抗は3〜6 MΩになります。細胞内溶液は、KOHまたはグルコン酸で調整されたpH 7.3と、280〜290 mOsmの浸透圧を持つ必要があります。</li>
	<li>標準的な可視化された全細胞記録設定を使用して、陽圧22,23を印加しながら記録するニューロンの近くに記録ピペットを置きます。</li>
	<li>吸引力を当てながら正圧を放ち、ギガオームシールを形成します。</li>
	<li>短時間の吸引を適用して膜を破り、全細胞構成記録を形成します。</li>
	<li>電圧クランプまたは電流クランプでニューロンの応答を記録します。</li>
</ol>
4. レーザー走査型光刺激
<ol>
	<li>データ収集ソフトウェアとハードウェアを開始します、以前のレポート23-29. で説明しました
	注:Tidelwave25と、最近ではMatlabで作成され、Janelia Farms30のKarel Svbodaの研究室によって開発されたEphus26取得プログラムの両方を利用しています。Ephusにおけるレーザー走査型光刺激の詳細については、Suter et al.を参照してください。26 とステップバイステップガイド30. 
	注:この記事で説明されているセットアップは、Shepherd(2012)23で説明されているセットアップから派生しています。レーザービームは、ミラーのオープンビームシステムを介して顕微鏡の上部ポートに導かれ、対物レンズを介してスライスに向かいます(図2)。</li>
	<li>レーザーのごく一部をフォトダイオードに迂回させ、レーザー光路に顕微鏡カバースリップを配置し、このフォトダイオードからの電流出力を使用して実験中のレーザー強度を監視します。
	<ol>
		<li>ソフトウェアに記録されたフォトダイオード電流出力を、機器のセットアップ中にパワーメータを使用して、対物レンズの背面焦点面で測定されたレーザーパワーに較正します23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可変NDホイールを回転させてレーザー出力を制御します。私たちの実験では、使用されたレーザー出力は25〜70 mW(後焦点面)の間で変化しました。</li>
	<li>レーザーとシャッターのパルスパラメータを変更して、レーザー刺激の長さとタイミングを設定します。レーザー刺激は通常2ミリ秒です。</li>
	<li>「Grab Video」機能を使用して、刺激する領域の画像をキャプチャします。</li>
	<li>希望の寸法に応じて刺激グリッドを選択します。通常、隣接する行と列の間に80μmの間隔を空けた16 x 16の刺激アレイを使用します。</li>
	<li>取得した画像でマッピンググリッドをオーバーレイし、x、y、および度のオフセットを目的の位置と向きに調整します。</li>
	<li>「マップ」機能を有効にすると、刺激とデータ取得が開始されます。</li>
	<li>光刺激誘発応答を取得した後、Tidelwave25のオフラインマップ分析プログラムまたはEphus26の「MapAnalysis」プログラムを使用して、マッピングデータの分析を実行します。</li>
</ol>
5. 固定スライスイメージング
<ol>
	<li>記録後、脳スライスを0.01 M PBS(pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで一晩移します。</li>
	<li>スライスを4%PFA/0.01 M PBS中の30%スクロースで4°Cで一晩移します。</li>
	<li>クライオスタットを使用して50 μm切片を切断し、0.01 M PBSに収集します。</li>
	<li>切片を0.01 M PBSで室温で2回すすぎます。</li>
	<li>セクションとカバースリップを適切な退色防止媒体に取り付けます。</li>
	<li>切片を共焦点顕微鏡に移します。</li>
	<li>白色光を使用してROIに焦点を当てます。</li>
	<li>画像取得の波長、画像サイズ、および繰り返しを選択します。YFPは514nm(Ex)/527nm(Em)を使用します。</li>
</ol>

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).</li>
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<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
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<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodpsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+control+by+layer+six+in+cortical+circuits+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gain control by layer six in cortical circuits of vision.</a> Nature. 483, 47-52 (2012).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Na.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65, 230-245 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+convergence+of+layer+6+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Intracortical convergence of layer 6 neurons.</a> Neuroreport. 23, 736-740 (2012).</li>
<li>Mancuso, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+probing+of+functional+brain+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic probing of functional brain circuitry.</a> Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).</li>
<li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+affordable+LED+arrays+for+photo-stimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cre+recombinase+to+specific+neuron+populations+with+bacterial+artificial+chromosome+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs.</a> J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).</li>
<li>Cox, C. L., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+outputs+of+inhibitory+interneurons+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus.</a> Neuron. 27, 597-610 (2000).</li>
<li>Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+by+laser+photostimulation+of+connections+between+the+thalamic+reticular+and+ventral+posterior+lateral+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat.</a> J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).</li>
<li>Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+somatosensory+cortical+layer+6+feedback+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus.</a> Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).</li>
<li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li>
<li>Suter, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephus%3A+multipurpose+data+acquisition+software+for+neuroscience+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments.</a> Front Neural Circuits. 4, (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+modulators+of+auditory+thalamocortical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission.</a> Hear Res. , 287-2843 (2012).</li>
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<li>Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics</a> (2003).</li>
<li>Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://syntheticneurobiology.org">http://syntheticneurobiology.org</a> (2003).</li>
<li>Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: 
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	 <a target="_blank" href="http://www.gensat.org/cre.jsp">http://www.gensat.org/cre.jsp</a> (2003).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益はないと宣言している。
著者(CCL)は、このプロトコルのこの撮影に使用される機器を製造するライカマイクロシステムズから出版助成金を受け取りました。

記載されているプロトコルは、前脳回路、すなわち視床および皮質の回路の調査に限定されない、神経回路の機能的トポグラフィーおよび生理学のin vitro評価のためのアプローチを詳述する。光遺伝学的トランスフェクション用のいくつかのウイルスコンストラクトが科学界に提供されており、UNC Vector Coreから容易に入手できます。すぐに入手できるウイルス構築物の説明については、UNC Vector Core31、スタンフォード大学32のDeisserothラボ、およびMITのBoyden合成神経生物学ラボ33の光遺伝学リソースページを参照してください。これらのオプシンの変異体はこれらの研究室によって開発されており、ニューロンの興奮性を制御するための幅広いモードを可能にします1,2。UNC Vector Coreからこれらのベクターを入手するには、元のラボからの材料移転契約が必要です。このプロトコルでは、ポリブレンの添加がトランスフェクションの有効性を高めることに注目します。さらに、発現に影響を与える別の変数は手術後の回復期間であり、マウスの前脳経路で堅牢な発現を得るには少なくとも14日間の期間で十分であることに注意します。
特定のニューロン群の標的トランスフェクションのために、いくつかのCreトランスジェニックマウス系統が開発されており、開発された「floxed」逆オープンリーディングフレームウイルスコンストラクトと組み合わせて使用できます11。神経科学研究に関連するいくつかの株は、変異マウス地域リソースセンター34を通じて入手できます。これらのトランスジェニック系統におけるCre-リコンビナーゼ発現パターンのアトラスは、GENSATデータベース35を通じて提供されます。さらに、Jackson Labsは、いくつかのCreトランスジェニック株、および特定のニューロングループでオプシンを構成的に発現する他の株を提供しています。これらのマウス系統を利用するための重要なステップは、繁殖コロニーの取得と確立に必要な時間を考慮に入れることであり、これは関心のある特定の系統によって異なる場合があります。
光刺激については、最近のプロトコル29に記載されている、ノースウェスタン大学のシェパードラボによって開発されたセットアップを利用し、適応させました。グルタミン酸のアンケージングに最適化されていますが、このセットアップは、変更なしでチャネルロドプシンの光刺激にも適しています。このセットアップにより、光刺激遺伝子座の正確な空間制御と位置決めが可能になり、記録されたニューロンのチャネルロドプシン神経支配の機能的トポグラフィーの評価が可能になります。空間制御は、この光刺激の方法によって強化されるが、LEDベースのフィールド照明20を利用する方法よりも法外なコストがかかる。さらに、脳組織の不均一性は、光遺伝学、または光の操作を伴う技術の制限です。しかし実際には、結果は主に定性的な方法で解釈されるため、それが要因になることはめったにありません。脳領域間のより定量的な比較が必要な場合は、いつでも最大光強度を使用して「飽和」応答を達成できます。
さらに、レーザー走査光刺激とデータ収集を制御するために、Matlabで記述されたTidelwaveとEphusの両方のソフトウェアプログラムを使用しました25,26。しかしながら、同様のシステムを設定する者は、Janelia Farms開発サイト30を通じて利用可能なサポートを有する、より新しいEphusソフトウェア26を採用することが推奨される。ハードウェア要件はわずかに異なるため、重要なステップは、これらのソフトウェア パッケージのどれを使用するかを選択することです。さらに、マップ分析プログラムは、それぞれのデータ収集プログラムに合わせて調整されています。
これらのステップのいくつかは、開業医の特定の設定に合わせて変更できます。ウイルス溶液の注入は、シリンジ以外の送達機構を使用して行うことができ、たとえば、~40 μmのチップ直径に引っ張られたキャピラリーガラスピペット も うまく機能します。手術の場合、注射のガイドにそのような座標が必要ない場合は、非定位固定ヘッドホルダーを置き換えることができます。さらに、ACSFおよび細胞内溶液組成は、例えば、抑制電流を分離するためにセシウムまたは高塩化物細胞内溶液を置換する など 、特定の実験要件に応じて変更され得る。また、固定スライスにおける発現パターンのイメージングに代わる方法も、浴灌流システムを備えた適切なイメージングリグ上のライブスライスで行うことができる。
要約すると、このプロトコルにより、開業医は、標準的な方法では不可能である可能性のある、in vitro での投影の機能的トポグラフィーとシナプス生理学を特徴付け ることができます。スライスで保持できない長距離投影を特徴付けます。記載されているトランスフェクションプロトコルは、送達メカニズムが同じであるため、 in vivo光遺伝学的実験1〜3、12、14に適用できます。最後に、このプロトコルはマウスのトランスフェクションを記述していますが、利用可能なウイルスベクターの多くを使用して、理論的にはこれらのオプシンを幅広い哺乳類種にトランスフェクションおよび発現させることができ、したがって、無数の比較および種特異的な研究が可能になります1-3。

哺乳類の前脳の精巧な回路は、その絡み合った構成要素の機能的役割を解剖するための実験的な課題を提起しています。これらの関係を解きほぐすことは、最近、ニューロン集団とその投影を特異的に刺激および阻害するための光遺伝学的方法の開発によって支援されています1-3。これらのアプローチは、光に応答する膜チャネルの遺伝的に制御された発現を利用します4-6。特に注目すべきは、光依存性イオンチャネルであるチャネルロドプシンが、光刺激後にニューロン膜を脱分極させ、発現ニューロンとその突起の興奮につながる4,7。逆に、光依存性塩化物ポンプであるハロロドピンは、膜を過分極し、したがって、標的の投影を阻害する6,8,9。これらのオプシンのいくつかの変種が操作されており、目的のニューロン集団におけるトランスフェクションおよび発現のために複数のベクターが作製され、これらのオプシンを構成的に発現する、またはそれらの発現のcre-loxを介した制御を可能にするトランスジェニックマウス系統が操作されています1,2,10,11。
これらの光遺伝学的方法と材料の有用性は、現代の実験的神経科学に革命をもたらし、生物の生理学と行動における特定の神経回路の役割の解剖を可能にしました12-15。特に、これらの方法は、in vitroスライス調製物16-20を用いた脳回路の機能解剖に強力に適用することができる。この文脈では、この方法の主な利点の1つは、大脳皮質半球16の間の交連接続など、厚いスライスで保存することが不可能ではないにしても困難な長距離突起の生理機能を特徴付ける能力である。さらに、この技術により、ハロロドプシン6,8,9を用いた微細な時間精度による投影の選択的阻害など、他の方法では不可能な操作が可能になります。さらに、これらのオプシンの細胞型特異的発現により、神経回路内の単離された成分を選択的に刺激または阻害することができる1,2,11,15,21。このように、これらの新しい光遺伝学的ツールは、生理学と行動へのニューロンの寄与の前例のない分析を可能にします。
ここでは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター1,2を使用してマウスの脳でチャネルロドプシンを発現するためのプロトコルについて説明します。標的ニューロン集団の特異的トランスフェクションは、このプロトコルを使用して達成でき、目的の標的ニューロンでCre-recombinaseを発現するプロモーターコンストラクトまたはトランスジェニックマウスと「floxed」ウイルスコンストラクト1,11,15,21(図1)を適切に選択できます。ここでは、例として、一次視覚野(V1)と二次視覚野(V2)の間の皮質皮質突起を調べ、一次体性感覚野(S1)から腹後内側核(VPm)への第6層皮質視床突起についても調べます。この特異的発現をin vitroでのレーザー走査型光刺激と組み合わせて、シナプス生理学と機能トポグラフィーを評価します。ここで紹介するセットアップにより、光刺激の軌跡の正確な空間配置と制御が可能になります。最後に、共焦点顕微鏡を用いた発現パターンの可視化について説明します。

<table><tbody><tr><td>ポリブレン</td><td>サンタクルス バイオテクノロジー</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 32% 溶液</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>ベクター ラボ</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV ウイルス コンストラクト</td><td>UNC ベクター コア</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>マウス 定位ヘッドホルダー</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>ナノクール インジェクター</td><td>ハーバード装置</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>UVレーザー:355 nm、Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSSレーザー株式会社</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>ガルボノメーター</td><td>ケンブリッジスキャン</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>ミラー</td><td>ケンブリッジスキャン</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>マウント</td><td>ケンブリッジスキャン</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>ケーブル</td><td>ケンブリッジスキャン</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>ドライバー/コントローラー</td><td>ケンブリッジスキャン</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>シャッター - ZMコーティング(UV対応)</td><td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>シャッターコントローラー</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>電流増幅器</td><td>スタンフォードリサーチシステムズ</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713ボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 ブレイクアウトボックス</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>ケーブル</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

感覚前脳は複雑に接続された細胞タイプで構成されていますが、その機能特性はまだ完全には解明されていません。これらの前脳回路の相互作用を理解することは、最近、ニューロン活動の光媒介調節のための光遺伝学的方法の開発によって支援されています。ここでは、ウイルス媒介トランスフェクションを介して光遺伝学的に発現するチャネルロドプシンのレーザー走査光刺激を使用して、in vitroで前脳回路の機能構成を調べるためのプロトコルについて説明します。このアプローチは、トランスジェニックマウスにおけるcre-lox組換えの有用性も利用して、特定のニューロン細胞タイプでの発現を標的としています。トランスフェクション後、ニューロンは全細胞パッチクランプを使用してスライス調製物に生理学的に記録され、チャネルロドプシン発現繊維のレーザー走査型光刺激に対するニューロンの誘発応答が測定されます。このアプローチにより、機能的なトポグラフィーとシナプス特性の評価が可能になります。形態学的相関は、生スライスまたは後固定組織の共焦点顕微鏡を用いて、チャネルロドプシン発現繊維の神経解剖学的発現をイメージングすることによって得ることができる。これらの方法により、従来のアプローチに拡張された前脳回路の機能的研究が可能になります。

Balb/CマウスのV1（一次視覚野）にpAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFPを注入し、マウスの一次視覚野（V1）と二次視覚野（V2）の間の投射に対するレーザースキャン光刺激を行った。図3）。このウイルス構築物中のCaMKIIaプロモーターにより、興奮性グルタミン酸作動性ニューロンにおいてチャネルロドプシン-EYFPが特異的に発現します。1,15生理学的記録のためのスライス調製後、チャネルロドプシン-EYFP繊維の発現を、 すなわち 接合されたEYFPのエピ蛍光が、V1からV2へと移動する様子が観察された（図3A）。さらに、外側膝状体（LGN）における皮質視床線維も観察された（図3A). V2のニューロンを用いたホールセルパッチクランプ記録により、V2の下層にあるchannelrhodopsin-EYFP発現繊維をレーザースキャン光刺激した後に誘発されるEPSCが明らかになった（図3B).
別の例として、本プロトコルを用いて、一次体性感覚野（S1）第6層から腹後側核（VP）への皮質視床投射のレーザースキャン光刺激を行いました。ここでは、Cre-Lox法を用いて、標的となる第6層ニューロンおよび皮質視床投射にチャネルロドプシンを特異的に発現させました。具体的には、B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcdマウス（図1および 4）のS1にpAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pAを注入しました。このトランスジェニックマウス系統は、第6層の皮質視床ニューロンに特異的にCreリコンビナーゼを発現しており21、そのため、「floxed」AAV構築物をトランスフェクションすることで、これらのニューロンのみにChR-YFPが発現します。スライスの作製後、第6層ニューロンおよび第4層とVPに投射する繊維にチャネルロドプシン-EYFPが観察されました（図4Aおよび 4B）。ホールセルパッチクランプ法を用いてVPmニューロンから生理学的記録を行ったところ、記録したニューロン付近でレーザースキャン光刺激を行うことでEPSCが誘発されることが明らかになりました（図4Cおよび 4D）。
生理学的記録の後、標識された線維の形態をより容易に評価することができました。ここでは、第6層皮質視床ニューロンにchannelrhodopsin-EYFPを発現させたスライス標本を再切片化（50 μm）しました（図5）。これにより、第6層から第4層へと走行し、そこで終止して広範囲に樹状分枝する標識線維の精緻なパターンが明らかになりました（図5A）。さらに、皮質視床線維が白質に入り、視床に向かって走行している様子が観察されました（図5Aおよび図5B）。
<img alt="マウスモデルにおける標的ChR-YFP発現のためのCre-loxPを用いた遺伝子編集の図解" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
図1. Cre-Loxアプローチによるチャネルロドプシンの標的発現の概略図。目的のニューロン集団にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスに、YFPなどの蛍光タンパク質と融合したチャネルロドプシンをコードする「floxed」ウイルスを注入します。トランスフェクション後、Creリコンビナーゼを持つニューロンのみがチャネルロドプシン-EYFPを発現します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="レーザー光学系、ダイクロイックミラー、CCDカメラ、およびスキャンセットアップを含むレーザー顕微鏡の概略図。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. 光刺激セットアップの模式図。 (A) レーザースキャン光刺激セットアップの概略図。レーザービームは、オープンビームシステムを介して順にシャッターと中性密度（N.D.）フィルターへと導かれる。カバーガラスがビームの一部をフォトダイオードに反射させ、これはレーザー出力測定用の増幅器に接続されている。ミラーガルバノメータを用いてレーザービームをスキャンレンズ経由で配置し、レンズが顕微鏡上部のサイドポートを通してビームを導く。その後、ビームはダイクロイックミラーを用いて対物レンズを通してスライス標本へと反射される。詳細は Lam and Sherman23 および Shepherd29 を参照のこと。(B) 図 3 に示す代表的な実験における光刺激グリッドパターンの例。16 x 16 の刺激グリッドがスライス標本の顕微鏡写真上に重ねられている。赤色の星印は、ホールセルパッチクランプ法を用いて記録されたニューロンの位置を示す。レーザービームの位置は、ミラーガルバノメータのコンピュータ制御によるポジショニングにより、刺激グリッド内の 256 箇所の各位置に導かれる。図には、最初の 5 つの刺激部位のレーザー位置が描かれている。各部位への光刺激に対する記録ニューロンの応答は 図 3 に示されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="神経イメージングマップ図；LGN、V1、V2視覚野の解析；神経接続研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図3"> 
図3. マウスにおける一次視覚野（V1）から二次視覚野（V2）への皮質間投射のレーザースキャン光刺激。 (A) V1からV2および外側膝状体（LGN）へのchannelrhodopsin-EYFP繊維を示す切片標本の蛍光顕微鏡像。興奮性グルタミン酸作動性ニューロンにおけるchannelrhodopsin-EYFPの特異的発現は、CaMKIIaプロモーターを含むウイルス構築物によって誘導されている。 (B) レーザースキャン光刺激後にV2のニューロンから誘発された興奮性突起後電流（EPSCs）。赤色の星印は記録部位を示す。スケールバー： (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="VP領域の解析を含む皮質層の図；微小電気活動をマッピング；電気生理学的データ。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 4"> 
図 4. マウスにおける一次体性感覚皮質（S1）から後腹側視床核（VP）への皮質視床投射のレーザースキャニング光刺激。 (A) S1内のchannelrhodopsin-EYFP線維を示す切片標本の蛍光画像。(B) VP内の標識線維の蛍光画像。(C) レーザースキャニング光刺激後にVPニューロンから誘発された興奮性ポストシナプス電流（EPSCs）。(D) 平均EPSCsのプロット。赤色の星印は記録部位を示す。(C)の枠囲みのトレースは(D)の枠囲みの値に対応する。スケールバー：(A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 msec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。
<img alt="緑色のマーカーで標識された神経構造を示す蛍光顕微鏡写真。比較図。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 5"> 
図 5. マウス一次体性感覚皮質 (S1) の channelrhodopsin-EYFP を発現する第6層ニューロンのイメージング。 (A-B) 第6層の標識ニューロンと、第4層および白質へ投射する繊維。スケールバー：(A) 250 µm, (B) 250 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">ここをクリックして拡大画像を表示</a>。

私たちは、光遺伝学的アプローチを使用して前脳回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性を特徴付ける方法を記述し、in vitroでニューロン集団を光刺激します。

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

この手順の全体的な目的は、最新の光遺伝学的手法を適用し、in vitroのスライス標本において標的となる神経経路を光刺激することです。これは、まず目的の神経細胞株にchannel rhodopsinを発現させることで達成されます。手順の第2段階では、研究対象となる ilgiliな脳構造の急性スライス標本を作成します。次のステップでは、チャネルロドプシンを発現している線維への光刺激に対する、スライス標本内のニューロンからの応答を記録します。最終ステップでは、チャネルロドプシンを発現しているニューロンおよび線維の分布をイメージングします。最終的に、この手法により、オプトジェネティクスで標的とした神経成分へのレーザースキャニング光刺激を用いて、神経回路の機能的なトポグラフィーおよびシナプス特性の評価が可能になります。従来の電気刺激法に対する本手法の主な利点は、特定のニューロン細胞種を特異的に標的として刺激し、それらの長距離投射をin vitroで検討できることです。この手法は、複雑な神経回路の機能的組織化など、システム神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。トランスフェクション効率を高めるためのpolyを4 µg/mL含有するウイルス溶液を注入するため、注射器と針を準備してください。その後、シリンジポンプを用いて溶液200 nanolitersを圧注します。2～3週間後には、チャネルロドプシンがスライス内で十分に発現します。作製は可能な限り迅速に行う必要があります。注入済みの脳を取り出した後、清潔なカミソリを用いて脳を希望の方向でブロック状に切り出します。次に、脳の切り出し面を瞬間接着剤を用いて切断ステージに固定します。次に、ステージを冷却されたバイブラトム切断チャンバーへ移し、氷冷したA CSFをチャンバー内に注ぎます。脳切片をバイブラトムを用いて4〜500 µmの厚さの切片にスライスします。脳切片を酸素供給された保持チャンバーに移し、実験に進む前に30 °Cで少なくとも1時間インキュベートします。実験の準備が整ったら、脳切片を電気生理学的記録装置のステージに移動させます。標準的なホールセルパッチクランプ法を用いてニューロンの記録を行います。ピペットに正圧をかけながら、記録用ピペットをニューロンの近傍に配置します。細胞との接触が完了した後、圧力を解放し、吸引をかけてギガシールを形成します。次に、短時間の吸引を行い、細胞膜を破砕してホールセル構成にした後、電圧クランプまたは電流クランプモードで記録を行います。レーザースキャナーは、tidal waveまたはEFAsデータ収集ソフトウェアのいずれかを使用して操作してください。レーザーの出力を制御するため、使用前にソフトウェアをフォトダイオードで校正する必要があります。光路上に可変ニュートラル密度ホイールを設置します。ホイールを回転させ、後焦点面で測定を行うことでレーザーの出力を調整します。出力は通常、25からD milliwattsの間に設定します。シャッターのパルスパラメータによって、ソフトウェア内での刺激の長さとタイミングを制御します。刺激する領域の画像は、ビデオキャプチャ機能を用いて作成できます。次に、間隔 80 micron の 16 × 16 グリッドなどの刺激グリッドを設定します。その後、取得した画像にグリッドを重ね合わせ、XY座標とオフセット角度を調整して、刺激を開始するための最適な向きに設定します。マップ機能を有効にします。データは保存され、tidal waveのオフライン解析プログラムを用いて解析するか、あるいはEFAsソフトウェアのマップ解析プログラムを用いて解析することができます。スライスでの生理学的記録を完了した後、YFPタグ付きチャネルオプシンの発現パターンを記録できます。まず、4°Cにて0.01 M PBS中の4% PFAでスライスを一晩固定します。翌日、スライスを30% sucrose 4% PFA溶液に移し、一晩かけて凍結保護を行います。その翌日、クライオスタットを用いてスライスを50 micronの厚さに切片化します。切片をPBSで洗浄し、抗退色剤を用いて共焦点顕微鏡でのイメージングのために封入します。白色光で関心領域を特定した後、励起波長に514 nm、蛍光波長に527 nmを使用します。これは、興奮性グルタミン酸作動性ニューロンにおいてchannel rod Dobsonを発現させるYFPAウイルス構築物（EYFP）をイメージングするためであり、BSYマウスの一次視覚皮質に注入されました。ウイルス発現は、一次視覚野と二次視覚野の間の経路、およびLGNの皮質視床繊維において確認された。星印で示した二次視覚野のニューロンからのホールセルパッチクランプ記録により、ePSCが検出された。チャネルロドプシンの発現繊維のレーザースキャン光刺激の結果、V2の下層および一次体性感覚野の第6層からの皮質視床投射が認められた。腹側後核は、第6層の皮質視床ニューロンおよびその投射にチャネルロドプシンを発現させるためのCre-Loxアプローチを用いて解析された。期待通り、CreトランスジェニックマウスへのFlocked AAV構築物の導入により、標的とした第6層ニューロンおよび第4層まで延びるその繊維においてチャネルロドプシンが発現した。Channelrhodopsin-EYFPの発現は、VPに投射する線維においても認められ、VPニューロンから生理学的記録を行った。ホールセルパッチクランプ法を用いた解析により、星印で示された記録ニューロン近傍への光刺激に続き、ePSCを誘発できることが明らかになった。オフライン解析では、VPにおける光刺激に対する平均応答振幅を示している。Channelrhodopsin-EYFPを発現する第6層皮質視床ニューロンの50 micron厚切片を再切断して解析した結果、第6層から第4層へと走行し、そこで終末して広範に樹状分枝する標識線維の微細なパターンが認められた。さらに、皮質視床線維が白質に入り、視床に向かって走行していることが観察されました。このビデオを視聴することで、in vitro スライス標本において、標的となる神経経路を光刺激するために現代的な光遺伝学的手法を適用する方法について、十分に理解できたはずです。なお、本手順に関連する校正ステップにおいて、レーザーの使用は極めて危険であることに十分注意してください。保護メガネを着用してください。

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ここで説明する方法は、ラットの行動関連回路におけるコカイン誘発可塑性を光遺伝学的に逆転させるために使用される手順を概説する。視床-扁桃体シナプスの持続的な低周波光刺激は、長期うつ病(LTD)を誘発します。コカインを経験したラットにおける in vivo 光遺伝学的に誘導されたLTDは、その後の手がかり動機による薬物探索の減弱をもたらした。...

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。...

げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

学ぶ光遺伝学的レーザー走査光刺激法を用いた前脳回路の機能解析。Channelrhodopsin発現ニューロンを標的に、in vitro脳切片でシナプス特性と神経回路の機能トポグラフィーを評価する。

光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

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