光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激
December 27th, 2013
私たちは、光遺伝学的アプローチを使用して前脳回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性を特徴付ける方法を記述し、in vitroでニューロン集団を光刺激します。
この手順の全体的な目標は、最新の光遺伝学的手法を適用して、in vitroスライス調製物で標的ニューロン経路を光刺激することです。これは、まず目的のニューロン細胞株にチャネルロッドDossinを発現させることによって達成されます。手順の 2 番目のステップは、研究対象の関連する脳構造の急性スライス調製を作成することです。
次のステップは、チャネルの光刺激に応答してスライス調製中のニューロンからの応答を記録することであり、ロッドドッシンは繊維を発現します。最後のステップは、ニューロンとファイバーを発現するチャネルオプシンの分布を画像化することです。最終的に、このアプローチにより、光遺伝学的に標的化された神経成分のレーザー走査型光刺激を使用して、神経回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性の評価が可能になります。
従来の電気刺激法に対するこの技術の主な利点は、特定のニューロン細胞タイプを特異的に標的にして刺激し、in vitroでそれらの長距離投射を調べる能力です。この方法は、複雑なウォーソケットの機能的組織化など、システム神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。トランスフェクションを強化するために、ポリリットルあたり4マイクログラムを含むウイルス溶液を注入するための注射器と針を準備します。
次に、シリンジポンプを使用して200ナノリットルの溶液を圧力注入すると、2〜3週間後にチャネルロッドドッシンスライスが十分に発現します。準備はできるだけ早く行う必要があります 注射された脳を取り除いた後、きれいなかみそりの刃を使用して脳のブロックを希望の向きに作ります。次に、脳のブロックされた表面を瞬間接着剤を使用して切断ステージに貼り付けます。
次に、ステージを冷凍庫で冷やしたビブラムカッティングチャンバーに移し、氷冷したCSFをカッティングチャンバーに注ぎます。バイオムを使用して脳の切片を4〜500ミクロンの厚さの切片にスライスします。脳スライスを酸素化された保持チャンバーに移し、実験を進める前に少なくとも1時間摂氏30度でインキュベー
トします。実験を開始する準備ができたら、脳のスライスを電気生理学的記録装置のステージに移します。標準的な全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンを記録。ピペットに陽圧を加えながら、記録ピペットをニューロンのそばに短時間配置します。
セルに接触した後、圧力を解放し、吸引を加えてギガシールを形成します。次に、短時間の吸引を適用してメンブレンを壊し、全細胞構成にし、電圧または電流クランプモードで録音します。レーザースキャナーは、潮波またはEFAデータ収集ソフトウェアで操作します。
レーザーの出力を制御するために、使用前にソフトウェアをフォトダイオードにキャリブレーションする必要があります。可変NDホイールがその経路に配置されます。ホイールを回転させると、後焦点面で測定することにより、レーザーの出力が調整されます。
通常、電力は 25 から D ミリワットの間に設定されています。シャッターのパルスパラメータは、ソフトウェアでの刺激の長さとタイミングを制御します。グラブビデオ機能から刺激する領域のイメージを作ることができます。
次に、80ミクロンの間隔で16×16のグリッドなどの刺激グリッドを設定します。次に、取得した画像にグリッドを重ね合わせ、XY座標とオフセットの度数を調整して、刺激を開始するための向きを最適化します。マップ機能を有効にします。
データは保持され、潮汐波のオフライン分析プログラムを使用して分析するか、EFAソフトウェアのマップ分析プログラムを使用して分析できます。スライス上での生理学的記録が完了した後、YFPタグ付きチャネルオプシンの発現パターンを文書化することができます。まず、スライスを摂氏4度で0.01モルPBS中の4%PFAで一晩固定します。
翌日、スライスを30%スクロース4%PFA溶液に移し、一晩凍結保護します。翌日、クライオスタットでスライスの50ミクロン切片を切断します。スライスをPBSですすぎ、共焦点顕微鏡で退色防止培地でイメージングするためにマウントします。
白色光の関心領域を見つけたら、514ナノメートルの興奮波長と527ナノメートルの発光波長を使用します。チャネルロッドDobson、EYFPの発現を促進するYFPAウイルスコンストラクトをイメージングする。興奮性グルタミン酸作動性ニューロンをBSYマウスの一次視覚野に注入した。
ウイルス発現は、一次視覚野と二次視覚野の間のトラック、および星によってマークされた二次視覚野のニューロンからのLGN全細胞パッチクランプ記録の皮質視床線維で見出された。チャネルのレーザー走査光刺激に続いて、一次体性感覚皮質の第6層からのV2つの皮質視床突起の下層で繊維を発現するロッドドッシン。腹側後核は、CRE LAXアプローチを使用してチャネルロッドドッシンを第6層皮質視床ニューロンで発現するために研究され、それらの投射では、群れのAおよびVコンストラクトによるCREトランスジェニックマウスへのトランスフェクションにより、標的の第6層ニューロンとその繊維が第4層に伸びるチャネルロッドドシンが発現しました。
チャネルロッドドブソン、EYFPの発現は、VPニューロンからVPに突出する生理学的記録に突出する線維でも認められました。全細胞パッチクランプを用いたところ、星でマークされた記録されたニューロンの近くで光刺激を受けた後、e PSCが誘発されることが明らかになりました。オフライン解析は、VPの光刺激に対する平均応答振幅を示しています チャネルを発現する第6層皮質視床ニューロンの50ミクロンスライスを再切除した ロダンEYFPは、第6層から第4層まで横断する標識線維の微細なパターンを明らかにしました。
さらに、皮質視床線維が白質に入り込み、視床に向かって横切っていることが観察されました。このビデオを見れば、最新のオプトジェネティクス技術をin vitroスライス調製物の光刺激標的ニューロン経路にどのように適用するかについて十分に理解できるはずです。レーザーでの作業は、この手順に関連するキャリブレーション手順を実行するときに非常に危険であることを忘れないでください。
保護メガネを着用してください。
概要
この記事では、in vitroでニューロン集団を光刺激するためにオプトジェネティクスを使用する脳前葉回路の特徴づけ方法を紹介します。この技術により、神経回路の機能的地形とシナプス特性の評価が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- オプトジェネティクス
- 電気生理学
背景
- オプトジェネティクスにより、ニューロン活動の精密な制御が可能になります。
- in vitroのスライス準備を用いて脳回路を研究します。
- チャネルロドプシンは光刺激の主要なツールです。
- この方法は神経回路の組織化に関する洞察を提供します。
研究の目的
- 標的ニューロン刺激のためのオプトジェネティック技術を適用する。
- 特定のニューロン経路のシナプス特性を調査する。
- 脳の機能的組織化の理解を深める。
使用した方法
- ニューロン細胞株におけるチャネルロドプシンの発現。
- 実験用急性脳スライスの調製。
- 全細胞パッチクランプ技術を用いた電気生理学的記録。
- 特定のニューロン集団を活性化するためのレーザー走査光刺激。
主な結果
- チャネルロドプシン発現繊維の成功的な光刺激。
- 標的ニューロンでのシナプス反応の記録。
- ニューロン経路とその投射の可視化。
- 脳前葉回路の機能的接続性に関する洞察。
結論
- この方法は神経回路を研究するための強力なツールを提供します。
- オプトジェネティクスにより、特定のニューロンタイプを標的化し刺激することができます。
- このアプローチはシステム神経科学における重要な質問に答えることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Laser-scanning photostimulation of optogenetically targeted forebrain circuits enables precise interrogation of neuronal connectivity and synaptic function in complex brain regions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing targeted hypothesis testing of circuit-level mechanisms. The method supports portfolio decisions by clarifying functional organization and de-risking biological targets in neuropsychiatric and neurodegenerative research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables targeted interrogation of neuronal pathways to clarify circuit-level mechanisms.
- Supports functional target validation by isolating specific cell types and projections.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses for CNS disorders.
- Provides data to triage targets based on synaptic and connectivity profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain slice systems for downstream electrophysiological assays.
- Standardizes stimulation and recording conditions for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable mapping of synaptic responses across defined neuronal populations.
- Supports reliable evaluation of compound effects on circuit function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional circuit mapping with disease-relevant brain regions and pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of neural targets.
- De-risks translational advancement by linking synaptic properties to in vivo function.
- Supports biomarker development through quantifiable electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mapping of neuronal circuits, supporting both target validation and assay development for CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective stimulation and recording from defined neuronal populations.
- Screening: Provides reproducible, quantitative electrophysiological outputs for compound screening in validated slice systems.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic responses and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Links in vitro circuit function to disease-relevant models and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mapping diverse brain circuits and evaluating multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes optogenetic stimulation and electrophysiological recording for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying circuit-level mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral transfection, and electrophysiology.
- Needs specialized instrumentation for laser-scanning, patch clamp, and confocal imaging.
- Demands cross-team standardization of stimulation and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or transgenic models.
- Safety protocols for laser use and viral handling are essential.
