Name: 癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ 液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化法。がん細胞培養培地からトリプトファン代謝物を正確に測定し、免疫応答調節の研究とより効果的な治療法開発に貢献する信頼性の高いプロトコルです。

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この研究は、東ポーランド2007-2013(POPW.01.03.00-06-003/09-00)、ルブリンのジョン・ポール2世カトリック大学(イロナ・サドクのための若い科学者助成金)のバイオテクノロジーと環境科学の学部によって、東ポーランドの運用プログラム開発の下で欧州地域開発基金から欧州連合によって支援されました OPUS13(2017/25/B/NZ4/01198マグダレーナ・スタニシェフスカ、原則調査官)。 著者らは、細胞培養およびタンパク質定量のための装置を共有してくれたJPII CULの学際研究センター、酸化ストレス研究所のアニエスカ・シシビオール教授に感謝する。

<ol><li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDO1%3A+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li>
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<li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2%2B+increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li>
<li>Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Hydroxykynurenine%3A+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li>
<li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).</li>
<li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li>
<li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine-2%2C3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li>
<li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li>
<li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites%2C+tryptophan%2C+monoamines+and+neopterin+in+plasma%2C+cerebrospinal+fluid+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li>
<li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li>
<li>Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan%2C+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+Life+Science%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li>
<li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li>
<li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li>
<li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li>
<li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).</li>
<li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan%2C+kynurenine%2C+kynurenic+acid%2C+and+quinolinic+acid+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li>
<li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+LC-MS%2FMS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li>
<li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum%2C+urine%2C+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li>
<li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li>
<li>Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li>
<li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+suppression+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li>
<li>Houée-Lévin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine%3A+An+update+on+mechanisms+of+formation%2C+advances+in+analysis+and+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2%2C+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416(2009).</li>
<li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine+2%2C3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins%2C+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

本論文では、 インビトロ 培養ヒト癌細胞から培地で測定される4つの主要Trp代謝物(3HKyn、Kyn、3HAA、XA)の同時定量化のための詳細なLC-SQプロトコルを提示する。分析の中で最も重要な点であるサンプル調製、クロマトグラフィー/質量分析法、データ解釈に特に注意が払われます。
一般に、LC-MS分析は、高感度のため、使用材料のプロトコルの厳密さと純度の最高水準を必要とします。これは、きれいに洗浄され、適切に洗浄されたガラス製品だけでなく、標準的な手順を通じて高級化学物質のアプリケーションを指します。この敏感なアプローチでは分析に大きな影響を与える可能性がある微生物汚染を避けるために、移動相の淡水ベースの溶媒を使用することは非常に重要です。LCシステムに注入する前に、分析されたサンプルは、不溶性粒子の存在を注意深く調べる必要があります。サンプル分析の前に列を十分に平衡にする必要があることに注意することが重要です。これらの規則に従わないと、サンプル、LCシステム、分析カラムの汚染やMSソースでのサンプルイオン化不足が発生し、最終的に信号のシフトが発生する可能...

キヌレニン経路(KP)は、ヒト細胞におけるトリプトファン(Trp)の変性の主要な経路である。インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO-1)は、KPの第1及び制限酵素であり、TrpをN-フォルミルカヌレニン1に変換する。KP内のさらなるステップは、他の二次代謝産物、すなわち種々の生物学的特性を示すキヌレニンを生成する。キヌレニン(Kyn)は、アリル炭化水素受容体(AhR)2に結合した後に、毒性特性および細胞イベントを調節する第1の安定したTrpカタボライトである。その後、Kynは自発的にまたは酵素媒介プロセス内のいくつかの分子に変換され、3-ヒドロキシキヌレニン(3HKyn)、アントラニル酸(AA)、3-ヒドロキシアントラニル酸(3-HAA)、キヌレン酸(Kyna)、キナンテレン酸(XA)などの代謝産物を生成する。別の下流代謝産物は、2-アミノ-3-カルボキシムコン酸-6-セミアルデヒド(ACMS)、キノリン酸(QA)またはピコリン酸(PA)1に非酵素的なサイクライゼーションを行う。最後に、QAは、さらにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)3、重要な酵素補因子であるKP終点代謝産物に変換される。キヌレニンには、キナやPAなどの神経保護特性があるものもあれば、3HAAや3HKynの他の人は有毒である4.3HKynから形成されるキサンスレン酸は抗酸化作用と血管弛緩性5を提示する。XAは、老化したレンズに蓄積し、上皮細胞のアポトーシスを導く6.KPは、20世紀半ばに記述され、様々な障害への関与が実証されたときに、より注目を集めました。この代謝経路の活性の増加およびいくつかのキヌレニンの蓄積は、免疫応答を調節し、うつ病、統合失調症、脳症、HIV、認知症、筋萎縮性側索硬化症、マラリア、アルツハイマー病、ハンチントン病、癌4、7などの異なる病理学的状態に関連している。Trp代謝のいくつかの変化は、腫瘍微小環境および癌細胞2,8で観察される。また、キヌレニンは有望な疾患マーカー9と考えられている。がん研究において、in vitro細胞培養モデルは、抗癌剤10に対する応答の前臨床評価のために十分に確立され、広く使用されている。Trp代謝産物は、細胞によって培養培地中に分泌され、キヌレニン経路の状態を評価するために測定することができる。そのため、容易で柔軟で信頼性の高いプロトコルを備えた様々な生物学的標本において、できるだけ多くのKP代謝産物を同時に検出するための適切な方法を開発する必要があります。
本論文では、がん細胞から採取した培養後の培地において、キヌレニン経路代謝産物であるKyn,3HKyn,3HAA,XAをLC-SQで同時に決定するためのプロトコルについて述べた。現代の分析的アプローチにおいて、液体クロマトグラフィー13、14、15、16は、個々のトリプトファン・カマボリトの同時検出および定量化に好ましく、エーリッヒ試薬11,12を利用した生化学的非特異的アッセイとは対照的である。現在のところ、ヒト検体におけるキヌレニンの測定には、主に紫外線または蛍光検出器13、17、18、19による液体クロマトグラフィーに基づく多くの方法がある。液体クロマトグラフィーと質量分析検出器(LC-MS)を組み合わせると、感度が高く(検出の下限)、選択性、再現性が高いため、このタイプの分析に適しているようです。
Trp代謝産物は、ヒト血清、血漿および尿13、20、21、22、23において既に決定されているが、細胞培養培地のような他の生物学的標本に対する方法も望まれている。以前、LC-MSは、ヒトグリオーマ細胞の培養後に採取した培地中のTrp由来化合物、単球、樹状細胞、またはインターフェロンガンマ(IFN-γ)24、25、26で処理されたアストロサイトに使用した。現在、がんモデルで使用される異なる培養培地、細胞、および治療における複数の代謝産物の評価を可能にする新しい検証済みプロトコルが必要です。
開発された方法の目的は、KPの異常を示すことができる4つの主要なキヌレニンを(1つの分析実行内で)定量することです。ここに提示される、 インビトロ 培養ヒト癌細胞27から採取した培地において、1つの内部標準(3-ニトロチロシン、3NT)を用いて選択された有意義なキヌレニンの定量的LC-SQ分析のための我々の最近発表されたプロトコルの重要なステップが示される。我々の知る限りでは、 インビトロ で増殖した細胞から得られた培養培地中で3HKyn、3HAA、KynおよびXAを同時に定量する初のLC-SQプロトコルです。いくつかの変更では、この方法は、より広い範囲の細胞培養モデルにおけるTrp代謝の変化を研究するためにさらに適用される可能性がある。

<table><tbody><tr><td>3-hydroksy-DL-kynurenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1771</td><td></td></tr><tr><td>3-ヒドロキシアントラニル酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>148776</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-ニトロ-L-チロシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7389</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Supelco</td><td>1.00029</td><td>LC-MS LiChrosolv</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Supelco</td><td>05105</td><td>粉末</td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析カラム</td><td>Agilent Technologies</td><td>959764-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus C18 急速分解能 HT (2.1 x 100 mm, 1.8 & micro;m)</td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>Supelco</td><td>7022</td><td>溶離液添加剤、LC-MS、LiChropur、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグ</td>マ <td>クロマトグラフィー</td>バイアル用1001887398<td></td></tr><tr><td>キャップ</td><td>Agilent Technologies</td><td>5185-5820</td><td>ブルースクリューキャップ、PTFE/レッドシルセパ</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>ネスト</td><td>704004</td><td>ポリスチレン、非発熱性、滅菌</td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td>12ウェル、非発熱性、非細胞毒性、滅菌</td></tr><tr><td>セルインキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>HERAcell 150i Cu</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td></td><td>モデル5415R</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>モデル5428</td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>Bionovo</td><td>B-2278</td><td>エッペンドルフタイプ、1.5 mL</td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>Bionovo</td><td>B-3693</td><td>ファルコンタイプ、50 mL、PP</td></tr><tr><td>クロマトグラフィーデータ買収および分析ソフトウェア</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td></tr><tr><td>クロマトグラフィーインサートバイアル</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-1387</td><td>100 &micro;L</td></tr><tr><td>クロマトグラフィー バイアル</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0714</td><td>2 mL、透明ガラス</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Supelco</td><td>1.02950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Dubelcco'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41450</td><td></td></tr><tr><td>デュアルメーター pH/導電率</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td>セブンマルチ</td></tr><tr><td>エバポレーター</td><td>Genevac</td><td></td><td>モデル EZ-2.3 エリート</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Supelco</td><td>5.33002</td><td>LC-MS LiChropur</td></tr><tr><td>試薬保管</td><td>用ガラス瓶Bionovo</td><td>S-2070</td><td>50 mL、透明ガラス</td></tr><tr><td>ガードカラム</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus-C18 ナローボアガードカラム (2.1 x 12.5 mm、5 & micro;m)</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>メルク</td><td>1.00317.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-キヌレニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K8625</td><td>&ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>Wigo</td><td></td><td>ES 21 H</td></tr><tr><td>マイクロバランス</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td>モデル XP6</td></tr><tr><td>Milli-Q システム</td><td>Millipore</td><td>ZRQSVPO30</td><td>Direct-Q 3 UV ポンプ付き</td></tr><tr><td>四重極質量分析計</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1948B</td><td>モデル 6120</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Adrich</td><td>048M4874V</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Bio Tek</td><td></td><td>Synergy 2 Gen5 によって操作</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>1.05108.0500</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質アッセイ 染料試薬濃縮</td><td>BioRad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>シーソーロッカー</td><td>スチュアート</td><td>SSL4</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット</td><td>Nest</td><td>326001</td><td>5 mL、ポリスチレン、非発熱性、滅菌塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性</td>ナトリウム <td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>溶剤入口フィルター</td><td>Agilent Technologies</td><td>5041-2168</td><td>ガラスフィルター、20 &mu;m孔径</td></tr><tr><td>溶媒リザーバー(LC-MS用)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6524</td><td>1 L、透明ガラス</td></tr><tr><td>溶媒リザーバー(LC-MS用)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6526</td><td>1 L、琥珀色ガラス</td></tr><tr><td>スプレッドシートプログラム</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>Microsoft Office Excel</td></tr><tr><td>攪拌棒</td><td>Bionovo</td><td>6-2003</td><td>テフロンコーティング</td></tr><tr><td>シリンジフィルター 培養用中型ろ過</td><td>Bionovo</td><td>7-8803</td>再生<td>セルロース、およびOslash; 30 mm、0,45 & micro;m</td></tr><tr><td>移動相コンポーネントろ過用シリンジフィルター</td><td>Bionovo</td><td>6-0018</td><td>ナイロン、 &Oslash; 30 mm、0,22 &micro;m</td></tr><tr><td>組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>96ウェル、滅菌</td></tr><tr><td>済み トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>T4049-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>超高速液体クロマトグラフィーシステム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367D、G1379B、G1312B、G1316C</td><td>1200 Infinityシステムは、オートサンプラー(G1367D)、デガッサー(G1379B)、バイナリポンプ(G1312B)、カラムサーモスタット(G1316C)で構成されています</td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>Polsonic</td><td>104533</td><td>model 6D</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Biosan</td><td></td><td>model V-1 plus</td></tr><tr><td>Xanthuren acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td>96%</td></tr></tbody></table>

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

キヌレニン経路とキヌレニンと呼ばれるトリプトファンのカマボリテは、免疫調節と癌生物学への関与に対する注目度が高まっています。 インビトロ 細胞培養アッセイは、疾患メカニズムにおける異なるトリプトファンカマボリテの寄与について学び、治療戦略をテストするためにしばしば使用される。分泌代謝物およびシグナル伝達分子が豊富な細胞培養培地は、トリプトファン代謝および他の細胞事象の状況を反映する。複雑な細胞培養培地における複数のキヌレニンの信頼性の高い定量のための新しいプロトコルは、複数のサンプルの信頼性と迅速な分析を可能にするために望まれる。これは、質量分析と結合された液体クロマトグラフィーで達成することができる。この強力な技術は、代謝産物の定量のために多くの臨床および研究機関で使用され、キヌレニンの測定に使用することができます。
ここでは、4つのキヌレニン、すなわちキヌレニン、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシキヌレニン、3-ヒドロキシアントラニル、およびキサンスレン酸を 、インビトロ 培養癌細胞から採取した培地において、単四重極質量分析(LC-SQ)と結合した液体クロマトグラフィーの使用を示す。SQ検出器は、他の質量分析計に比べて使いやすく、安価です。SQ-MS分析では、サンプルから複数のイオンが生成され、特定の質量電荷比(m/z)に従って分離され、その後に単一イオン監視(SIM)モードを使用して検出されます。
本稿では、報告された方法の利点を取り上げ、いくつかの弱点を示す。これは、クロマトグラフィーおよび質量分析と共にサンプル調製を含むLC-SQ分析の重要な要素に焦点を当てています。品質管理、方法キャリブレーション条件、マトリックス効果の問題についても説明します。我々は、すべての標的検体のための1つのアナログ標準として3-ニトロチロシンの簡単な適用を記述した。ヒト卵巣および乳癌細胞の実験によって確認されるように、提案されたLC-SQ法は信頼できる結果を生成し、さらに他 のインビトロ 細胞モデルに適用することができる。

LC-MSは、複雑な標本の一部の成分がいわゆるマトリックス効果を引き起こし、分析物のイオン化を損なうにもかかわらず、生物学的に活性な分子の定量化において紛れもない利点を提示する。それはイオン抑制またはイオン増強をもたらし、精度を強く低下させ、LC-MSの検出/定量の限界に影響を及ぼし、これは方法の「弱い」点と考えられる。我々のプロトコルでは、イオンは正のモードでエレクトロスプレーイオン化(ESI)によって生成され、これはTrp代謝物決定13に関する他の研究にも用いられた。しかし、ESIは、大気圧化学イオン化(APCI)28よりもマトリックス効果を起こしやすい。したがって、細胞培養培地中のTrp代謝物を正確に定量するために、内部標準およびマトリックスマッチキャリブレーションを使用して、検体シグナルに対するマトリックス依存効果を補償し、サンプル調製工程中の標的化合物の損失を補正した。全ての調査対象(3HKyn、Kyn、3HAA、XA)に同じ内部標準(3NT)を適用しました。3NTは、細胞培養に使用される元の新鮮な培地には見つからず、適用された分析...

ここで説明するキヌレニン経路で生成される4種類のトリプトファン代謝産物(キヌレニン、3−ヒドロキシキヌレニン、キサンチュレン酸、3−ヒドロキシアントラニル酸)を、液体クロマトグラフィーによって分析した培養液から採取した培地中の単一の四重極質量分析法を用いて説明する。

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

キヌレニンは、がんを含むいくつかの疾患における免疫応答調節に関連しています。複数のキヌレニンを同定するための信頼性と検証済みの方法は、より効果的な治療法の開発に役立ちます。私たちのプロトコルは、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィーを使用して、がん細胞培養物から収集された培地中のキヌレニン経路によって生成されるさまざまなトリプトファン代謝物を特定します。経験の浅いユーザーは、サンプル調製やデータ取得および解釈のステップで困難を感じる場合があります。当社のプロトコルと推奨事項に従うことで、間違いを回避し、信頼性の高いデータを取得できます。試薬の原液を調製するには、バイアル中の各試薬0.3ミリグラムを最高精度で秤量し、各試薬を適切な溶媒の300マイクロリットルに溶解して、各試薬の1リットルあたり1グラムの原液を得ます。木炭処理培地を調製するには、円錐管に280ミリグラムの活性炭を秤量し、目的の細胞を培養するために調製した液体培地を5ミリリットル加えます。シーソーロッカーでメディウムと木炭を入れたチューブを室温で2時間、毎分50回の振動で振とうします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって木炭を沈殿させ、木炭を乱さずに上清を慎重に収集し、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して培地をろ過します。キャリブレーション溶液を調製するには、木炭処理した培地に0.75マイクロリットルの0.1グラム/リットルの3NT溶液をスパイクし、3-Hキヌレニン、3-HAAキヌレニン、およびキサンツレン酸を少なくとも6つの異なる濃度で追加して、サンプルあたり150マイクロリットルの最終容量まですべてのキャリブレーション範囲をカバーします。ボルテックス後、サンプルの除タンパクのために各チューブに1%ギ酸を添加したマイナス20°Cの冷メタノールを150マイクロリットル加え、チューブをしっかりとキャップして再びボルテックスします。マイナス20°Cで40分間インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、自動ピペットを使用して各上清の270マイクロリットルを個々の平底ガラスバイアルに移します。バイアルを蒸発器に入れ、水メタノール画分の適切なプログラムを使用して、揮発性成分を約30分間穏やかに蒸発させます。チューブが乾いたら、各サンプルを水中の0.1%ギ酸60マイクロリットルに再構成し、サンプルをボルテックスしてから、各溶液を遠心分離のために個々の1.5ミリリットルのチューブに移します。沈殿物を乱さずに、上清を円錐形のガラスインサートを備えたクロマトグラフィーバイアルに移し、バイアルをLC-MSオートサンプラーに入れます。サンプルを分析する前に、移動相でLCシステムをパージして気泡を除去し、すべての溶媒チャネルをプライミングします。次に、ガードカラムと分析カラムを 100% アセトニトリルで約 30 分間フラッシュした後、カラム内で安定した圧力が観察されるまで 100% ソルベント A でシステムをフラッシュし、データ収集ソフトウェアで適切な LC パラメーターを設定し、LC システムでサンプルを実行するためのワークリストを作成します。検量線を作成するには、データ取得ソフトウェアで、キャリブレーション標準をワークリストに追加し、標準を3回で分析した後、3-ヒドロキシキヌレニン、キヌレニン、3-ヒドロキシアントラニル酸、3-ニトロチロシン、キサンツレン酸に対応するピーク面積をそれぞれ約4.4分、10分、16分、21分、30分で積分して測定します。in vitro細胞培養から上清サンプルを採取するには、目的の細胞の標準細胞培養を48時間行った後、各ウェルから500マイクロリットルの上清を個々の1.5ミリリットルのチューブに移し、遠心分離により細胞破片を除去し、その後、培地の上清を新しいチューブに移してマイナス80°Cで保存し、分析まで細胞ペレットをマイナス20°Cに維持します。LC-MS 分析用のサンプルを調製するには、解凍した各培地サンプルの 149.25 マイクロリットルを新しい 1.5 マイクロリットルのチューブに移し、各チューブに 0.1 グラム/リットルの 3NT 溶液を 0.75 マイクロリットル加えます。示されているようにサンプルを調製した後、1%ギ酸を添加したマイナス20°Cメタノールを各チューブに150マイクロリットル加え、示されているようにLC-MS分析用のサンプルを調製します。作業リストが完成したら、各分析種のピーク面積を測定し、各分析種専用の個別の線形キャリブレーション方程式を使用して、各実験サンプル内に存在する分析種の濃度を計算します。培地のサンプルに対応する細胞タンパク質含有量を評価するには、各細胞ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、サンプルをマイナス20°Cで1時間凍結してから氷上で解凍します。サンプルを3回凍結融解した後、遠心分離により細胞溶解物を回収し、ペレットを乱さずに上清を新しいチューブに移します。サンプルを新鮮なPBSで10倍に希釈し、適切な量のウシ血清アルブミン標準溶液を96ウェルプレートの適切なウェルに二重に加えます。各細胞ライセートサンプル上清10〜15マイクロリットルを96ウェルプレートの適切なウェルにロードし、標準ウェルとサンプルウェルの両方をウェルあたり50マイクロリットルのPBSの最終容量まで充填します。次に、超純水で5倍に希釈したBradford試薬200マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを室温で少なくとも5分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、プレートをマイクロプレートリーダーにロードし、595ナノメートルで吸光度を測定し、各サンプル中のタンパク質量を計算できるように検量線を作成し、各キヌレニンの濃度を総タンパク質含有量で割って、タンパク質1マイクログラムあたりの各サンプル中のキヌレニン量を正規化します。これは、1リットルあたり4.5グラムのD-グルコースと10%ウシ胎児血清を含む培地の分析中に得られたシングル四重極質量分析の結果です。サンプル内のキヌレニンの存在を示す小さなピークに注意してください。LCシグナルのシフトやミスマッチが観察される可能性があるため、実際のサンプルデータで分析種の適切な保持時間を確認する前に、品質管理サンプルを実行します。共溶出するマトリックス成分は、ターゲット分析種に対して選択されたマスターチャージ比でイオンを生成できます。例えば、この分析では、マスターチャージ比206のイオンをモニターしたスキャン期間に、未知の化合物からのピークが現れました。保持時間の非互換性により、シグナルは分析種に対応していませんでした。トリプトファン同位体はマスターチャージ比206と同じイオンを共有していたが、クロマトグラフィー分析により、トリプトファンシグナルはキサンツレン酸シグナルから十分に分離されていることが明らかになり、試験したがん細胞培地中に存在するトリプトファンのレベルはキサンツレン酸の定量に影響を与えなかったことが示された。2種類のがん細胞株の培地のこの分析は、評価されたヒト上皮性乳がん細胞が異なる量のトリプトファン代謝物を放出したのに対し、試験されたヒト卵巣がん細胞は有意に高いレベルのキヌレニンを産生したことを示しています。サンプル調製時に内部標準を使用すると、信頼性の高いデータ取得に役立ちます。データをタンパク質含有量に正規化することで、個々のウェル内の細胞数のばらつきが補正されます。私たちのプロトコルは、追加の分析種を決定するためにさらに拡張することができますが、異なる実験条件下で培地に蓄積する可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

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