サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリー ナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量
2017年10月5日
このプロトコルは、サンプル抽出の効率的かつ便利な分析プロセスと心肺毒性 DOX 代謝物、生物学的に doxorubicinol (DOXol)、マイトマイシン C (MMC)、ドキソルビシン (DOX) 複数の薬の同時定量法について説明します。相乗効果薬の組み合わせのナノ粒子製剤の前臨床乳房腫瘍モデルからサンプルが扱われます。
この分析プロトコルの全体的な目標は、ポリマー-脂質ハイブリッドナノ粒子によって共送される2つの抗がん剤ドキソルビシンとマイトマイシンC、およびドキソルビシンの代謝物であるドキソルビシノールを、シンプルで堅牢な逆相高速液体クロマトグラフィー法を使用して、生物学的マトリックス中に同時に抽出および定量することです。この方法は、薬物の組み合わせのナノ薬物動態に基づいて効果的なナノキャリーシステムをどのように設計するかなど、ナノメディシンの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、HPLCの移動相を変更することなく、同じ生体マトリックス中の3つの薬物化合物を同時に定量できることです。
したがって、この方法は、原発性乳房腫瘍におけるドキソルビシン、マイトマイシンC、およびドキソルビシノールの生物学的挙動についての洞察を提供することができます。また、同様の薬で治療される他の種類のがんにも適用できます。効率的なサンプル調製ステップを学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。
この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、全血、主要な臓器、および乳房腫瘍を収集して凍結します。凍結した組織をすばやく計量し、その重量をラボノートに記録します。次に、それらを13ミリリットルの丸底円錐管に移します。
次に、1〜5ミリリットルの氷冷セル溶解バッファーを追加します。電動ハンドホモジナイザーを使用して、18, 000 rpmで氷上で上下のストローク運動で組織を均質化します。この後、ホモジナイザーの10ミリメートルのこぎり歯発生器プローブを蒸留脱イオン水で洗浄します。
プローブを70%エタノールで洗浄し、次に蒸留脱イオン水で再度洗浄します。50マイクロリットルの組織ホモジネートまたは全血を1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移します。次に、ミリリットルあたり2、000ナノグラムの内部標準4-メチルアンベリフェロンの5マイクロリットルでスパイクします。
150マイクロリットルのアセトニトリルと100マイクロリットルの5ミリモル酢酸アンモニウムを含む氷冷抽出溶媒を追加します。混合物を2分間激しく渦巻きます。3, 000 g、摂氏4度で10分間遠心分離します。
この後、200マイクロリットルの上清を、あらかじめ冷やした新鮮な微量遠心チューブに移します。窒素ガスのゆっくりとした流れを使用して、光から保護しながら摂氏60度で上澄みを蒸発させます。次に、乾燥した残留物を100マイクロリットルの氷冷メタノールで再構成します。
30秒間激しく渦を巻きます。3, 000 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清をHPLCバイアルインサートに移します。
サンプルバイアルをオートサンプラートレイに入れて注入します。まず、テキストプロトコールに記載されているように、HPLC移動相を調製します。移動相組成の初期条件を 16.5%H2O、アセトニトリル 83.5% に設定します。
アイソクラティック流量を毎分1.0ミリリットルに設定します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、グラジエント移動相条件を使用して薬物を分離します。次に、2つのチャネルに紫外線検出器を置きます:1つは内部標準4-MethylUmbelliferoneのための310ナノメートルで、もう1つはMitomycin C.Afterのための360ナノメートルで、蛍光の探知器の最初のチャネルを365ナノメートルの励起波長に、そして4-MethylUmbelliferoneのための445ナノメートルの放出波長に置きなさい。
2 番目のチャネルを励起波長 480 ナノメートルに設定し、ドキソルビシンとドキソルビシノールの発光波長を 560 ナノメートルに設定します。まず、オートサンプラーを使用して15マイクロリットルのサンプルを注入します。プログラムされたグラジエント移動相の組成は、アセトニトリルの組成をゼロから18分にわたって増加させることにより自動的に変化します。
18 分後、移動相の条件は初期状態に再確立され、次の注入のために再平衡化されます。各サンプルを分析した後、薬物化合物のピークとその保持時間に注意してください。次に、HPLCソフトウェアを使用して、薬物化合物の曲線下ピーク面積を波形解析します。
テキストプロトコルに概説されているように、薬物回収率と、各薬物化合物と内部標準との間の曲線下面積比を計算します。この手順では、2つの抗がん剤、ドキソルビシンとマイトマイシンC、およびドキソルビシン代謝物であるドキソルビシノールが生物学的干渉なしに検出されます。HPLC分析では、各薬剤は他の薬剤から十分に分離されていることが示されています。
開発されたHPLC法では、全血およびさまざまな生物学的マトリックスの両方で、研究した各薬剤の日中および日中の精度と精度の変動が15%未満であり、優れた再現性を示しています。次に、ドキソルビシンとマイトマイシンCの長期循環またはペグ化ナノ粒子ベースの同時送達の薬物動態および生体分布が決定されます。血液中では、ポリマー-脂質ハイブリッドナノ粒子によって送達される薬物濃度は、同等の遊離薬物溶液よりも少なくとも6倍高いことが見られます。
同所性乳房腫瘍では、ポリマー-脂質ハイブリッドナノ粒子は、ドキソルビシンとマイトマイシンCを相乗的な薬物比で共送達できます。遊離薬物溶液と比較して、ナノ粒子は腫瘍の蓄積が増加していることが見られます。これは、ナノ粒子が腫瘍の強化された透過性と保持効果を利用することを可能にする、長期にわたる系統循環によるものです。
さらに定量的に決定された 24時間にわたる乳房腫瘍におけるドキソルビシノールの形成、および腫瘍アポトーシスの増強は、薬物のバイオアベイラビリティが効果的なナノ粒子製剤の設計に重要であることを示しています。このHPLC法を用いて、ポリマー-脂質ハイブリッドナノ粒子がin vivoでがん細胞に相乗的な薬物の組み合わせを精密に送達し、化学療法の改善につながることに成功しました。この手法は、適切に実行すれば約2時間で実行できます。
薬物の略奪の可能性を最小限に抑えるために、この手順を試みるときは、直射日光を避け、サンプルを氷の上に置いておくことを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、ナノメディシンの分野の研究者が薬物の組み合わせのナノ薬物動態を探求し、癌治療のための効果的なナノ粒子製剤をより適切に設計するための道を開きました。このビデオを見た後、ドキソルビシン、マイトマイシンC、およびドキソルビシンの代謝物であるドキソルビシノールを、薬物の組み合わせをロードしたナノ粒子を含む幅広い生体サンプルで同時に抽出および検出する方法を理解する必要があります。
抗がん剤や酸の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、このプロトコルを実行する際には、手袋、ゴーグル、白衣の着用などの安全対策を常に適用する必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、生体サンプルからのドキソルビシン、ミトマイシンC、およびドキソルビシノールの同時抽出と定量化のための堅牢な方法を概説しています。逆相高速液体クロマトグラフィーを利用し、この技術はナノメディシンでの応用のために設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ナノメディシン
- がん治療
- 分析化学
背景
- ドキソルビシンとミトマイシンCは主要な抗がん薬です。
- ドキソルビシノールはドキソルビシンの心毒性代謝物です。
- ナノ粒子製剤は薬物送達を強化できます。
- 薬物相互作用の理解は効果的な治療に不可欠です。
研究の目的
- 複数の薬物の同時定量化の方法を開発すること。
- ナノ薬物動態研究を促進すること。
- 乳がん腫瘍における薬物挙動に関する洞察を提供すること。
使用された方法
- 逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）。
- 生体マトリックスからのサンプル抽出。
- 3つの薬物化合物の同時分析。
- 分析中に移動相の変更は必要ありません。
主要な結果
- ドキソルビシン、ミトマイシンC、およびドキソルビシノールの成功的な定量化。
- サンプル調製における方法の効率性を実証。
- 原発性乳がん腫瘍における薬物相互作用に関する洞察。
- 他のがん種への潜在的な適用可能性。
結論
- この方法は薬物組合せの分析に効果的です。
- 視覚的なデモンストレーションはサンプル調製の学習を強化します。
- このアプローチはナノキャリアシステムの設計に情報を提供できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This analytical method enables precise quantification of doxorubicin, mitomycin C, and doxorubicinol in biological matrices, supporting preclinical evaluation of nanoparticle-based drug combinations. By providing synchronized pharmacokinetic data, it informs the design of nanocarrier systems that enhance tumor accumulation and reduce systemic toxicity. The method addresses a critical gap in nanomedicine R&D by allowing direct comparison of free versus nanoparticle-delivered drug combinations in vivo.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying drug metabolites and parent compounds in tumor tissue.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking through simultaneous detection of efficacy and toxicity markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for compound screening in complex biological matrices.
- Operational Value: Eliminates mobile phase changes during HPLC analysis, increasing throughput and reducing method variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by measuring drug exposure in tumors and cardiotoxic metabolites in heart tissue.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions via comparative pharmacokinetic profiling of nanoparticle versus free drug formulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through preclinical validation, providing quantitative bioanalytical support for nanopharmacokinetic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying drug accumulation and metabolite formation in orthotopic tumor models.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible extraction and quantitation across whole blood, tumor, and heart tissues.
- Analytics: Generates chromatographic peak area ratios relative to internal standard, enabling cross-condition comparison of drug exposure.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating tumor drug levels with enhanced apoptosis and reduced cardiotoxicity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple nanocarrier formulations in oncology pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in nanocarrier design through simultaneous quantitation of drug combinations and metabolites.
- Operational Value: Standardized sample preparation and HPLC conditions ensure reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing synergistic drug ratios and tumor-specific accumulation profiles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanoparticle formulations based on pharmacokinetic and biodistribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, HPLC operation, and fluorescent/UV detection.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, nitrogen evaporators, and autosampler-equipped HPLC systems.
- Necessitates standardization of extraction solvents and internal standard spiking across sample types.
- Must account for light sensitivity of doxorubicin and doxorubicinol during sample processing.
- Limited to analytes with compatible chromatographic behavior under isocratic and gradient conditions.
