脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

この技術の全体的な目標は、コンピュータービジョンを使用して蛍光細胞を自動的に検出し、急性脳スライスでこれらの細胞の自動パッチクランプを実行することです。この方法は、蛍光標識細胞の同定、ターゲティング、パッチクランプなど、パッチクランプ電気生理学分野における主要な困難を克服するのに役立ちます。この技術の主な利点は、パッチピペット、蛍光細胞を自動的に検出し、ステップを自動パッチクランプと統合できることです。

この革新により、実験スループットが大幅に向上します。この技術の意味は、ハイスループットの画像誘導自動パッチクランプを、より生理学的な神経細胞調製物の薬理学的スクリーニングに使用できるため、神経疾患の治療または診断にまで及びます。この方法は、ニューロンオルガネラタイプ、スライス培養、ニューロンおよび非ニューロン細胞の解離などの他のin vitro調製物にも適用できます。

この手順を開始するには、アンプ、顕微鏡コントローラー、およびマニピュレーターコントローラーの電源を入れます。次に、Autopatcher IGがインストールされているディレクトリを最初に変更して、コマンドラインターミナルからPythonでAutopatcher IGを実行します。次に、「Python Autopatcher_IG」と入力します。

コマンドラインターミナルでPYWを実行し、Enterキーを押します。その後、すべてのガラスピペットに内部溶液を充填し、ヘッドステージにロードします。ピペットチップを顕微鏡の視野に移動し、ピントを合わせます。

顕微鏡ステージでダイヤルパッドを使用してマニピュレーターを動かす場合は、キーボードのZを押して座標を更新します。プライマリキャリブレーションでは、マニピュレータによる移動の角度と距離を顕微鏡座標系に変換します。マニピュレーターは事前に設定された距離で3方向に移動し、ソフトウェアは顕微鏡の視野内のピペットチップの座標を検出します。

メインGUIで、ピペットがロードされている対応するユニットのキャリブレーション開始ボタンをクリックします。その後、メインGUIの下部にある[Save Calibration]をクリックして、キャリブレーションを保存します。この一次キャリブレーションは、リグの物理的な構成が変更されない限り、一度だけ実行する必要があります。

このステップでは、記録チャンバーの中央に1つの脳スライスを置きます。スライスホールドダウンまたはハープで脳スライスを安定させます。蛍光細胞を検出するには、4倍の倍率で対象領域を見つけます。

次に、Click to moveモードをオンにして顕微鏡ステージを移動し、関心領域の中心をクリックします。または、キーパッドを使用して顕微鏡ステージを移動します。次に、高倍率レンズに切り替えて、キーパッドのRFを使用して顕微鏡をZ軸に動かしてピントを調整します。

このソフトウェアは、顕微鏡とカメラに、さまざまな深度で一連の画像を撮影するように指示します。次に、これらの画像をコンピュータービジョン処理にかけ、蛍光標識された細胞を見つけます。最終的な出力は、検出されたセル座標のリストです。

メイン GUI の列単位 0 の [セルの検出] ボタンをクリックします。セットアップのLEDまたはレーザー光源がTTL信号で制御できない場合は、LEDまたはレーザーを手動でオンにしてください。必要に応じて、LEDまたはレーザーをオフにしてください。

セル座標のリストがメモリ位置GUIに表示されます。リストから不要なセルを削除するには、座標の横にある[X]ボタンをクリックします。または、標的細胞が蛍光標識されていない場合は、メインGUIでマウスモードをクリックします。

次に、目的のセルをクリックすると、番号の付いた黄色のドットがセルに表示され、セルの座標がメモリ位置GUIに表示されます。ピペットのオフセット座標を検出するために二次キャリブレーションを行うには、ガラスピペットの1/3に内部溶液を充填します。次に、ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーにピペットをロードします。

低倍率では、キーパッドの1と2を使用して、ユニット1とユニット2を切り替えます。次に、ピペットを視野に持ってきて、キーパッドを使用してピントを調整します。次に、load calibrationをクリックして一次キャリブレーションをロードします。

顕微鏡レンズを高倍率に切り替え、メインGUIで40回クリックします。ピペットの先端を中央に持ってきます。次に、メインGUIで使用されているユニットの下にあるセカンダリキャリブレーションボタンをクリックします。

ターゲットセルにパッチを適用するには、パッチ制御ボタンをクリックしてパッチ制御GUIを開きます。メモリ位置GUIの座標リスト上の目的のセルの横にある[移動]ボタンをクリックします。次に、メインGUIでユニットのCTMボタンをクリックして、移動を有効にします。

目的のセルをクリックして、ピペットチップをセルに移動します。マニピュレーターの機械的な制限により、500マイクロメートルを超える距離を移動すると、わずかな位置決め誤差が生じる場合があります。大きな機械的位置決め誤差を防ぐために、二次キャリブレーションはターゲットセルの近くで実行する必要があります。

次に、ユニットの1つの選択ボタンを使用して、2つのユニット間で入力信号を切り替えます。パッチ コントロール GUI の [パッチ] ボタンをクリックします。自動パッチ適用が開始され、圧力と抵抗をパッチ制御GUIで監視できます。

自動パッチングアルゴリズムは、抵抗を監視し、一連のロジックループを通じて圧力を制御してギガシールを形成します。ポップアップウィンドウは、ギガシールの形成を通知します。このシステムは、抵抗変化を利用して細胞と表面の接触を認識します。

細胞と表面の接触が時間内に検出されない場合は、同じ自動パッチ試行に留まりながら、次へボタンを使用してパッチングステージを進めます。パッチコントロールGUIのそれぞれのボタンをクリックして、任意の時点で自動プロセスを操作します。次に、[はい]を選択して、Zapと吸引を組み合わせて侵入します。

または、吸引のみでブレークインするには、[いいえ]を選択します。次に、実験パッチログを保存します。この図は、コマンド・シーケンス GUI にロードされた選択されたロケーションを示しています。

左の列は座標のリストを示し、右の列は各場所のTTL信号の形式でコマンドのリストを示しています。これは、選択した 3 つの場所に対応する、薬物適用実験中のスクリーンショットです。KCL溶液を赤色蛍光色素と混合し、可視化した。

ユニット1はKCL入りピペットで、ユニット2はパッチピペットでした。この図では、ステップ電流注入は規則的なスパイクニューロンを示しています。ここに示されているのは、500ミリモルの塩化カリウム溶液を3か所に局所的に適用したときの電圧クランプ記録トレースです。

内向きの電流が流れた赤色のトレースは、塩化カリウムの適用がパッチセルに近かったときの試験から記録されました。赤い矢印は塩化カリウムの施用タイミングを示しています。この方法を使用すると、手動パッチ適用と比較して、広範なトレーニングなしで4分以内にパッチクランプの試行を実行できます。

この手順に続いて、オプトジェネティクス、ケモジェネティクス、薬理学的操作などの他の方法を実行して、研究プロジェクトに関連する質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が、さまざまなin vitro調製物中のシナプス受容体とイオンチャネルのハイスループット研究を探求する道を開く可能性があります。このビデオを見れば、画像誘導自動パッチクランプ実験の実施方法について十分に理解できるはずです。