Name: 脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ自動画像誘導パッチクランプ法を用いた脳スライス中の蛍光標識ニューロンの検出と電気生理学的記録の自動化。この革新的な手法により、実験のスループットが大幅に向上し、神経疾患の薬理学的スクリーニング研究に応用可能です。

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ホワイトホール財団の資金援助に感謝します。貴重なコメントをいただいたSamuel T. Kissinger氏に感謝します。

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
<li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630(2013).</li>
<li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

米国特許出願第15 / 353,719号（非特許文献2）は、2016年11月16日に出願された非暫定的特許出願である「バイロの自動イメージ誘導パッチクランプ電気生理学のためのシステムおよび方法」（Ref。番号：PRF 67270-02。

ここでは、インビトロで自動画像ガイドパッチクランプ記録のための方法を説明する。このプロセスの主要なステップを以下に要約します。まず、コンピュータビジョンを使用して、顕微鏡で取得した一連の画像を使用してピペットチップを自動的に認識させます。この情報は、次に、顕微鏡とマニピュレータ座標系との間の座標変換関数を計算するために使用される。コンピュータビジョンは、蛍光標識された細胞を自動的に検出し、それらの座標を同定するために使用される。これらのステップは、オープンソースのPythonプログラミング言語、PyQT、およびOpenCVライブラリを使用したピペットターゲティングと自動パッチ適用アルゴリズムと統合されています。 既存のインビトロパッチクランプ法と比較して、このシステムはいくつかの領域において顕著な改善を行う。人間の介入を最小限に抑えます。このシステムは、パッチクランプ実験のほとんどのステップを自動化し、req人間の介入のための欲求。低/高倍率顕微鏡レンズの切り替えを含む、残りの手動ステップの一部は、追加の電動ハードウェアを使用して自動化することが...

パッチクランプ技術は、興奮性膜のイオンチャンネルを研究するために1970年代にNeherとSakmannによって最初に開発されました1 。それ以来、パッチクランプは、ニューロン、心筋細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、人工リポソームを含む多くの異なる細胞タイプにおいて、細胞、シナプスおよび回路レベル（ インビトロおよびインビボの両方） で多くの異なる被験者の研究に適用されている2 。このプロセスは、細胞の正確な同定および標的化、細胞に近接してパッチピペットを動かすための複雑なマイクロマニピュレーター制御、適切な時間に陽圧および陰圧をピペットに適用して緊密なギガシールパッチを確立すること、セル全体のパッチ構成を確立するためのブレークインなどがあります。パッチクランプは、通常は手作業で行われ、マスタリングには大規模なトレーニングが必要です。パッチを経験した研究者であってもクランプ、成功率は比較的低いです。より最近では、パッチクランプ実験を自動化するためのいくつかの試みがなされている。自動化を達成するために2つの主要な戦略が進化しました。標準的なパッチクランプ装置を増強して、パッチ適用プロセスの自動制御と、新しい装置と技術の設計を根本から行いました。前者の戦略は、既存のハードウェアに適応可能であり、 インビボブラインドパッチクランプ3、4、5、急性脳切片のin vitroでのパッチクランプ、器官型スライス培養物を含め、パッチクランプ種々の用途に使用することができ、培養解離ニューロン6 。これは、複数のマイクロマニピュレータを同時に使用することにより、複雑なローカル回路の照会を可能にします7 。平面パッチ法は、新しい開発戦略の一例であり、高スループットの同時p薬物スクリーニング目的のための懸濁液中の細胞のクランプクランプ8 。しかしながら、平面パッチ法は、全ての細胞型、特に、長いプロセスを有するニューロンまたは広範な接続を含むインタクトな回路には適用できない。これは、従来のパッチクランプ技術の重要な利点である、神経系の複雑な回路をマッピングすることへのその適用を制限する。 我々は、標準的なパッチクランプハードウェアを増強することにより、手動パッチクランププロセスをインビトロで自動化するシステムを開発しました。当社のシステムであるオートパックャーIGは、自動ピペット校正、蛍光細胞標的同定、ピペット移動の自動制御、自動全細胞パッチ、およびデータロギングを提供します。このシステムは、異なる深さの脳スライスの複数の画像を自動的に獲得することができる。コンピュータビジョンを使ってそれらを分析する。蛍光標識された細胞の座標を含む情報を抽出する。この情報は、目的の細胞を標的とし、自動的にそれをパッチするために使用される。このソフトウェアは、いくつかのオープンソースライブラリを使用して、無料のオープンソースプログラミング言語であるPythonで書かれています。これにより、他の研究者へのアクセシビリティが確保され、電気生理学実験の再現性と厳しさが向上します。このシステムはモジュラー設計を採用しているため、追加のハードウェアをここで示した現在のシステムと容易にインターフェースすることができます。

<table><tbody><tr><td>CCDカメラ</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>電気生理学リグ</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>顕微鏡とマニピュレーターが含まれています。この原稿で示されているメーカー提供のマニピュレータ制御ソフトウェアは、「Linlab2"です。</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>分子デバイス</td><td>MultiClamp 700B</td><td>コンピュータ制御微小電極増幅器</td></tr><tr><td>デジタイザ</td><td>分子デバイス</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED光源</td><td>クールLED</td><td>pE-100</td><td>488nm波長</td></tr><tr><td>データ収集ボード</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ. マニュアルを参照してください。http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>ソレノイドバルブ</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>エアポンプ</td><td>バーチャルインダストリー</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>空気圧センサ</td><td>フリースケール セミコンダクター</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>スライスホールドダウン</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>スライス・アンカー・キット、RC-40 チャンバー用フラット、2.0 mm、19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>バージョン 2.7 (Windows 用 32 ビット)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>ネジ端子</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>ネジ端子 3.5 mm ピッチ (2 ピン)</td></tr> <tr><td>(2 ピン)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N チャネル MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP ソケット はんだテール - 8 ピン</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - ベーシック レッド 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - ベーシック グリーン 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC バレル電源ジャック/コネクタ (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>ウォール アダプター電源 - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>フックアップ ワイヤー - 品揃え (ソリッド コア、22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>ロッキング オス x メス x メス ストップコック</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドタイゴンS3 E-3603フレキシブルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-171-129</td><td>外径:1/8インチ 内径:1/16インチ。</td></tr><tr><td>BNC オス - BNC オス同軸ケーブル</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ω 抵抗器 (許容誤差 5%)</td> ラジオ<td>シャック</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>ピコスプリッツァー</td><td>汎用バルブ</td><td>ピコスプリッツァー II</td><td></td></tr></tbody></table>

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

全細胞パッチクランプは、単細胞の電気的特性を測定する金標準的な方法です。しかし、 インビトロパッチクランプは、その複雑さおよびユーザの操作および制御への高い依存性のために、依然として困難で低スループットの技術である。この原稿は、急性脳スライスにおけるin vitro全細胞パッチクランプ実験のための画像ガイド自動パッチクランプシステムを実証しています。我々のシステムは、蛍光標識された細胞を検出し、マイクロマニピュレーターおよび内部のピペット圧力制御を用いた完全自動パッチングのためにそれらを標的にするコンピュータビジョンベースのアルゴリズムを実施する。プロセス全体は高度に自動化されており、人間の介入に対する必要条件は最小限に抑えられています。電気抵抗および内部ピペット圧力を含むリアルタイムの実験情報は、将来の分析および異なる細胞タイプへの最適化のために電子的に文書化されている。我々のシステムは、急性のbraiの文脈で記述されているn個のスライスレコーディングのために、解離ニューロン、器官型スライス培養物、および他の非ニューロン細胞タイプの自動画像誘導パッチクランプにも適用することができる。

<html>我々のシステムは、急性脳スライス、ニューロンに分化したマウス誘発多能性幹細胞（iPSC）、および関心のあるチャネルを人工的に発現するHEK293細胞に細胞をパッチする能力に関して試験されている。 図3は、視覚野における蛍光標識層5ピラミッドニューロンを標的とするThy1-ChR2-YFPトランスジェニックマウス（B6.Cg-Tg（Thy1-COP4 / EYFP）18Gfng / J）を用いた実験を示す。標的細胞は、自動的に同定された緑色蛍光陽性細胞の1つであった（ 図3b ）。 図3aは、パッチされたニューロンの差分干渉コントラスト（DIC）画像である。全細胞構成は、ステップ2.5〜2.6での自動パッチ適用プロトコルによって達成され、ステップ電流注入誘発活動電位によって検証された（ 図3c ） 1 &quot;&g...

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

この技術の全体的な目的は、コンピュータビジョンを用いて蛍光細胞を自動的に検出し、急性脳切片においてこれらの細胞の自動パッチクランプを行うことです。この手法は、蛍光標識された細胞の同定、ターゲット指定、およびパッチクランプといった、パッチクランプ電気生理学分野における主要な困難を克服するのに役立ちます。本手法の主な利点は、パッチピペットと蛍光細胞を自動的に検出し、それらのステップを自動パッチクランプと統合できることです。この革新により、実験のスループットが大幅に向上します。高スループットの画像誘導自動パッチクランプ法は、より生理学的な神経細胞調製物を用いた薬理学的スクリーニングに活用できるため、この技術の意義は神経疾患の治療や診断にまで及びます。本手法は、神経オルガノイドやスライス培養、解離ニューロン、およびあらゆる非神経細胞などの他のin vitro調製物にも適用可能です。この手順を開始するには、アンプ、顕微鏡コントローラー、およびマニピュレーターコントローラーの電源を入れます。次に、コマンドラインターミナルからAutopatcher IGがインストールされているディレクトリに移動し、pythonを使用してAutopatcher IGを実行します。続いて、「Python Autopatcher_IG」と入力してください。コマンドラインターミナルでPYWを入力し、Enterキーを押します。その後、ガラスピペットに内部溶液を満たし、ヘッドステージに装着します。ピペットチップを顕微鏡の視野内に移動させ、焦点を合わせます。ダイヤルパッドを使用して顕微鏡ステージ上のマニピュレーターを移動させた場合は、キーボードのZキーを押して座標を更新してください。一次キャリブレーションでは、マニピュレーターの移動角度と距離を顕微鏡の座標系に変換します。マニピュレーターがあらかじめ設定された距離の3方向へ移動し、ソフトウェアが顕微鏡の視野内におけるピペットチップの座標を検出します。ピペットがロードされている該当するユニットについて、メインGUIの「start calibration」ボタンをクリックします。続いて、メインGUIの下部にある「save calibration」をクリックして、キャリブレーションを保存します。この一次キャリブレーションは、装置の物理的な構成が変更されない限り、一度だけ行えば十分です。このステップでは、脳切片1枚を記録チャンバーの中央に配置します。スライスホルダーまたはハープを用いて脳切片を固定してください。蛍光細胞を検出するために、4倍の倍率で目的の領域を探します。次に、「クリックで移動」モードをオンにして、関心領域の中心をクリックし、顕微鏡ステージを移動させます。あるいは、キーパッドを使用して顕微鏡ステージを移動することも可能です。続いて、高倍率レンズに

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

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神経科学

このビデオでは、樹状膜表面からのパッチクランプ記録の手法を示しています。これは、ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起とその下にある電位依存性イオンチャネルの電気的特性を直接調べるのに役立ちます。...

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

このビデオでは、細い先の尖ったピペットを脳スライスの近くに配置して、ニューロン細胞とシールを形成する方法を示します。吸引により細胞膜が破壊されるため、電気生理学実験の電流測定を可能にする全細胞パッチクランプが形成されます。...

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。...

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

このビデオでは、脳のスライスが記録室に固定され、関心のある細胞がコンピューター制御の顕微鏡を使用して特定され、焦点が当てられます。次に、自動画像処理システムがパッチピペットを正確に配置して、細胞膜を密閉し、電気信号を監視します。...

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

このビデオでは、脳スライスを固定し、ピペットを配置して全細胞構成を実現し、シナプス前ニューロンを刺激してシナプス後応答を記録することで、ニューロンの接続性を解明する手順を示しています。...

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。...

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。...

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々...

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

学ぶ自動画像誘導パッチクランプ法を用いた脳スライス中の蛍光標識ニューロンの検出と電気生理学的記録の自動化。この革新的な手法により、実験のスループットが大幅に向上し、神経疾患の薬理学的スクリーニング研究に応用可能です。

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

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