脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

この技術の全体的な目的は、コンピュータビジョンを用いて蛍光細胞を自動的に検出し、急性脳切片においてこれらの細胞の自動パッチクランプを行うことです。この手法は、蛍光標識された細胞の同定、ターゲット指定、およびパッチクランプといった、パッチクランプ電気生理学分野における主要な困難を克服するのに役立ちます。本手法の主な利点は、パッチピペットと蛍光細胞を自動的に検出し、それらのステップを自動パッチクランプと統合できることです。

この革新により、実験のスループットが大幅に向上します。高スループットの画像誘導自動パッチクランプ法は、より生理学的な神経細胞調製物を用いた薬理学的スクリーニングに活用できるため、この技術の意義は神経疾患の治療や診断にまで及びます。本手法は、神経オルガノイドやスライス培養、解離ニューロン、およびあらゆる非神経細胞などの他のin vitro調製物にも適用可能です。

この手順を開始するには、アンプ、顕微鏡コントローラー、およびマニピュレーターコントローラーの電源を入れます。次に、コマンドラインターミナルからAutopatcher IGがインストールされているディレクトリに移動し、pythonを使用してAutopatcher IGを実行します。続いて、「Python Autopatcher_IG」と入力してください。

コマンドラインターミナルでPYWを入力し、Enterキーを押します。その後、ガラスピペットに内部溶液を満たし、ヘッドステージに装着します。ピペットチップを顕微鏡の視野内に移動させ、焦点を合わせます。

ダイヤルパッドを使用して顕微鏡ステージ上のマニピュレーターを移動させた場合は、キーボードのZキーを押して座標を更新してください。一次キャリブレーションでは、マニピュレーターの移動角度と距離を顕微鏡の座標系に変換します。マニピュレーターがあらかじめ設定された距離の3方向へ移動し、ソフトウェアが顕微鏡の視野内におけるピペットチップの座標を検出します。

ピペットがロードされている該当するユニットについて、メインGUIの「start calibration」ボタンをクリックします。続いて、メインGUIの下部にある「save calibration」をクリックして、キャリブレーションを保存します。この一次キャリブレーションは、装置の物理的な構成が変更されない限り、一度だけ行えば十分です。

このステップでは、脳切片1枚を記録チャンバーの中央に配置します。スライスホルダーまたはハープを用いて脳切片を固定してください。蛍光細胞を検出するために、4倍の倍率で目的の領域を探します。

次に、「クリックで移動」モードをオンにして、関心領域の中心をクリックし、顕微鏡ステージを移動させます。あるいは、キーパッドを使用して顕微鏡ステージを移動することも可能です。続いて、高倍率レンズに切り替え、キーパッドのRFを使用して顕微鏡をZ軸方向に移動させ、焦点を調整します。

ソフトウェアが顕微鏡とカメラを制御し、異なる深さで一連の画像を撮影します。次に、これらの画像に対してコンピュータービジョン処理を行い、蛍光標識された細胞を検出します。最終的な出力として、検出された細胞の座標リストが得られます。

メインGUIのcolumn unit zeroにあるdetect cellボタンをクリックします。セットアップのLEDまたはレーザー光源をTTL信号で制御できない場合は、手動でLEDまたはレーザーをオンにします。必要に応じて、LEDまたはレーザーをオフにします。

メモリポジションGUIに細胞座標のリストが表示されます。座標の隣にあるXボタンをクリックして、不要な細胞をリストから削除してください。あるいは、標的細胞に蛍光標識がなされていない場合は、メインGUIのマウスモードをクリックしてください。

次に、目的のセルをクリックします。セル上に番号付きの黄色い点が表示され、セルの座標がメモリーポジションのGUIに表示されます。ピペットのオフセット座標を検出するための二次キャリブレーションを行うには、ガラスピペットの1/3を内部液で満たします。その後、ピペットをヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーに装着します。

低倍率で、キーパッドの1と2を使用してユニット1とユニット2を切り替えます。次に、ピペットを視野に入れ、キーパッドを使用してフォーカスを調整します。続いて、「load calibration」をクリックして一次校正を読み込みます。

顕微鏡のレンズを高倍率に切り替え、メインGUIで40回クリックします。ピペットチップを中央に移動させてください。次に、メインGUIで、使用中のユニットの下にある二次キャリブレーションボタンをクリックします。

ターゲット細胞をパッチする場合、パッチコントロールボタンをクリックしてパッチコントロールGUIを開きます。メモリポジションGUIの座標リストにある、目的の細胞の横にあるGo Toボタンをクリックしてください。続いて、メインGUIにあるユニットのCTMボタンをクリックし、移動を有効にします。

目的のセルをクリックして、ピペットチップをそのセルまで移動させます。マニピュレーターの機械的な制限により、500 µm以上の距離を移動する場合、わずかな位置決め誤差が生じることがあります。大きな機械的位置決め誤差を防ぐため、ターゲットとなるセルの近傍で二次校正を行う必要があります。

次に、「unit one selected」ボタンを使用して、2つのユニット間で入力信号を切り替えます。パッチコントロールGUIの「patch」ボタンをクリックしてください。自動パッチングが開始され、パッチコントロールGUIで圧力と抵抗をモニタリングできます。

自動パッチアルゴリズムは、抵抗を監視し、一連のロジックループを通じて圧力を制御することで、ギガシールを形成します。ギガシールが形成されると、ポップアップウィンドウで通知されます。このシステムは、抵抗値の変化を利用して細胞表面への接触を認識します。

細胞表面との接触が時間内に検出されない場合は、「次へ」ボタンを使用して、同一の自動パッチ試行を維持したままパッチ工程を進めてください。パッチコントロールGUI上の各ボタンをクリックすることで、自動プロセスをいつでも操作できます。その後、「はい」を選択し、Zapと吸引を組み合わせて介入（ブレークイン）してください。

または、「no」を選択して吸引のみでブレイクインを行います。次に、実験パッチログを保存します。この図は、コマンドシーケンスGUIにロードされた選択箇所の例です。

左側の列は座標のリストを、右側の列は各位置に対するTTL信号形式のコマンドリストを示しています。以下は、選択した3か所の位置に対応する、薬剤投与実験中のスクリーンショットです。可視化を目的として、KCL溶液に赤色蛍光色素を混合しました。

ユニット1はKCl含有ピペットであり、ユニット2はパッチピペットである。この図では、ステップ電流注入により規則的なスパイクを示すニューロンが示されている。ここでは、3箇所の部位に500 millimolar 塩化カリウム溶液を局所投与した際のボルテージクランプ記録トレースを示している。

内向き電流を示す赤色のトレースは、塩化カリウムの適用がパッチ細胞に近い位置で行われた試行から記録したものです。赤色の矢印は塩化カリウムを適用したタイミングを示しています。この手法を用いることで、手動でのパッチクランプと比較して、広範なトレーニングを受けなくとも4分以内にパッチクランプ試行を行うことが可能です。

この手順に続き、研究プロジェクトに関連する疑問を解決するために、光遺伝学、化学遺伝学、薬理学的操作などの他の手法を実施することができます。本技術の開発により、神経科学分野の研究者が、さまざまなin vitro調製におけるシナプス受容体やイオンチャネルの高スループット研究を探索するための道が開かれる可能性があります。このビデオを視聴することで、画像誘導下自動パッチクランプ実験の実施方法について十分に理解できたはずです。