急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

このプロトコルを使用して、研究者は急性マウス脳スライス調製における海馬ネットワーク振動の根底にあるメカニズムを調査できます。この調製では、自発的なネットワーク振動を生じるスライス内の水中条件下で記録を行い、薬理学的および光遺伝学的手法を実行し、シングルセル記録を視覚化することができます。経心筋灌流の場合、マウスをイソフルランチャンバーから取り出す直前に、ペトリ皿の蓋に3〜5ミリメートルの冷やしたショ糖溶液を入れ、ペトリ皿の底に約1cmの冷やしたショ糖溶液を入れます。

麻酔をかけたマウスを左の吸収パッドにすばやく移し、3枚のテープを使用して前肢と尾を固定します。大きな組織鉗子と外科用ハサミを使用して、皮膚をテントで覆い、胸骨の下部から胸の上部まで縦に切開します。鉗子を使って胸骨を引き上げ、ハサミを使って横隔膜を切断します。

ハサミを使って、前肢が体と出会う点に向かって両側の胸郭を1回の大きな動きで切り込み、鉗子を使用して胸郭の前面を頭に向けて位置します。ハサミを使って水平に切り込みを入れて肋骨を完全に取り除き、鉗子を使って心臓を固定しながら、20ゲージの灌流針を左心室に挿入します。針が所定の位置にあるときは、小さな解剖ハサミを使用して右心房を切開し、血液が循環器系から洗い流されるようにします。

脳を抽出するには、斬首後、小さなボンドハサミを使用して、目に近い頭蓋骨の正面の正中線に向かって頭蓋骨を横方向に2回切り込み、頭蓋骨の基部の両側にさらに2つの切り込みを入れます。頭をガラスのペトリ皿に浸し、ハサミを使用して頭蓋骨の全長にわたって正中線に沿って切り込み、ハサミで引き上げて下にある脳組織への損傷を最小限に抑えます。小さな組織鉗子を使用して頭蓋骨の両側をしっかりとつかみ、骨を持ち上げて脳から離して頭蓋骨を本のように開きます。

左手の指を使って頭蓋骨のフラップを開いたままにし、微小ヘラを嗅球近くの脳の下に挿入し、脳を頭蓋骨からショ糖に反転させます。マイクロスパチュラを使用して脳幹を切断し、脳を洗って残っている血液、毛皮、または組織を取り除きます。大きなヘラを使って脳をガラスのペトリ皿の蓋に移し、両刃のカミソリの刃の半分を使って、嗅球を含む脳の最も前部に冠状動脈の切り込み

次に、冠状切開を行って小脳を切除し、寒天ランプにシアノアクリレート接着剤を塗布します。鉗子を使用して、濾紙で脳を短時間乾燥させてから、組織を寒天ランプの腹側を下にして接着剤に入れます。スライスプラットフォームをミクロトームのスライスチャンバーに置き、冷却したショ糖溶液でセットアップを完全に覆います。

大きなヘラを使用して、スクローススラリーをチャンバーに攪拌し、凍結したスクロースを溶かし、混合物の温度を摂氏1〜2度に急速に下げます。0.07mm/秒のスライス速度で450ミクロンの厚さにスライスします。各スライスが解放されたら、小組織鉗子と鋭利なメスを使用して2つの半球を分離し、スライスが主に海馬と海馬周囲領域で構成されるまで組織を切り取ります。

プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、スライスを温めたaCSFを含む界面回収チャンバーに個別に移します。スライスはaCSFと空気の界面に配置され、aCSFの薄いメニスカスのみがスライスを覆っています。すべてのスライスを取得したら、チャンバーをしっかりと閉じて、スライスが摂氏32度で30分間回復

回収期間の終わりに、チャンバーを低速に設定されたスターラーにチャンバーを置き、チャンバー内のaCSF循環を促進します。局所電界電位を記録するには、400 ミリリットルのビーカーにカルボゲンバブル aCSF を充填し、ポンプ チューブの一端をビーカーに配置します。毎分8〜10ミリリットルの蠕動ポンプをオンにして、aCSFを400ミリリットルのビーカーから加熱されたリザーバーに、リザーバーから32°Cの記録チャンバーに向けます。

次に、チューブを短くクランプし、ポンプをオフにして流れを一時停止します。細い鉗子を使用して、脳組織スライスを、組織が静止しているレンズペーパーの角にある記録チャンバーに移し、スライスダウンします。記録室に浮かび上がったスライスを残してレンズペーパーをはがし、ハープで固定します。

手動マイクロマニピュレータを使用して、塩化ナトリウム充填刺激ピペットの先端を30〜45度の角度でスライスの表面にゆっくりと進め、次に第2のマイクロマニピュレータを使用して、aCSfで満たされた局所磁場電位ピペットの先端を30〜45度の角度で関心領域にゆっくりと前進させます。 そして、標準プロトコルに従ってサンプルのローカルフィールド電位を記録します。この図では、実証されたプロトコルに従って調製された海馬嗅内皮質スライスからの代表的な記録を観察することができる。健康なスライスでは、電気刺激は、小さなシナプス前線維ボレーと急速な初期降下を伴う大きなシナプス後電位を伴うシナプス後電位を生じさせるはずである。

自発的な鋭い波紋は、地層ピラミッドの局所場電位の正の偏向としても見えるはずです。最適でないスライスでは、誘発されたシナプス後電位は大きな繊維ボレーを示し、シナプス後電位は比較的小さく、そのようなスライスは自発的な鋭い波紋を示さない。In vitroの鋭い波紋は、地層ピラミッド層で正の電位を示し、層ラジアタム層では重なり合った高周波振動と負の電位がペアになっています。

図に示すように、海馬の嗅内皮質切片の鋭い波紋は、CA2/CA3の再発回路内で発生し、CA1に伝播します。手順全体を通してカルボゲンを溶液に泡立て、ショ糖溶液が冷えていることを確認し、各ステップをできるだけ早く実行することが不可欠です。これらのスライスを調製した後、細胞外または細胞内の記録を、光遺伝学的または薬理学的実験とともに実行して、さまざまな細胞タイプがニューラルネットワークの機能にどのように寄与しているかを判断できます。