Name: 急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶ急性マウス脳スライスを用いた海馬ネットワーク活動の調査法。水平海馬-内嗅皮質スライスの調製と電気生理学的記録により、自発的シャープウェーブリップル活動を観察し、神経ネットワークの振動動態を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者はスティーブ・ジーゲルバウムのサポートに感謝したいと思います。資金は5R01NS106983-02と1 F31 NS113466-01によって提供されます。

著者は開示するものは何もない。

組織の健康を促進し、自発的な自然主義的なネットワーク活動の出現を支持するように設計されたこのスライスプロトコルにはいくつかのステップがあります:マウスは、チルドショ糖切断溶液で経皮的に浸透しています。水平内膜皮質(HEC)スライスは、中間または腹側海馬から450μmの厚さで切断されます。スライスは、温めたACSFのインターフェースで回復し、加湿された、カルボゲンが豊富な空気。録音中にスライスは32 °Cに温められたACSFと過重され、水没した記録室の二重表面のスーパーフュージョンとの速い流量で提供される。
スライスの健康は、インビトロでのネットワーク振動の生成にとって最も重要です。若い動物はより健康的なスライスを生み出し、一般的に若年性マウスまたは思春期のマウスでは、心筋灌流ステップをスキップすることができる。動物が老化するにつれて、健康的なスライスを作ることはますます困難になりますが、一部の調査(疾患モデルや縦断研究など)は、成人または老化した動物の使用を必要とします。例えば、ピロカルピン処理慢性てんかん成体マウス50</su...

生体外の生きた海馬スライスからの電気生理学的測定は、多くの利点を有する強力な実験的アプローチである。実験者は顕微鏡、マイクロマニピュレーター、および記録システムを使用して、組織内の個々のニューロンから測定値を直接可視化し、収集することができます。組織スライスは光遺伝学的、化学遺伝学的、または薬理学的実験のための光刺激または薬物送達にも非常にアクセス可能である。
海馬ネットワークは、生体内で高度に同期的な集団活動を生成し、細胞外局所的なフィールドポテンシャル1、2、3、4、5の振動として見える。脳スライス法は、これらの神経ネットワーク振動の根底にある細胞および回路メカニズムに関する洞察を得るために活用されてきた。Maierらの基礎的な研究は、鋭波波波紋成(SRS)が腹側海馬6,7のスライスに自発的に出現できることを実証した。複数の研究者からのその後の研究は、海馬8、9、10のネットワーク状態を調節する神経調節因子の役割およびvivo11での行動の間に以前に活動していた神経アンサンブルのインビトロ再活性化を促進するシナプス機構を含む、SDRの多くの側面を徐々に解明してきた。脳スライス実験はまた、ガンマ範囲振動(30〜100Hz)、記憶符号化とリコール12、13をサポートすると考えられている明確な海馬ネットワーク状態への洞察を提供している。最後に、側頭葉てんかん14,15の病態生理学における海馬および関連する構造の中心的役割を認識し、研究者は海馬スライス製剤を使用しててんかん活動の発生および伝播を調査した。Carterららは、慢性てんかん動物から調製された海馬-内皮質スライスを組み合わせることで、vitro16で自発的にてんかん放電を発生させることができることを実証した。その後、Karlócaiらは、改変されたイオン濃度(Mg2+または上昇K+)または薬物(4APまたはガバジン)17を有する改変された人工脳脊髄液(ACSF)を用いて海馬スライス中のてんかん分泌物の基礎となるメカニズムを探った。
研究者は、重要な方法で異なる多数の海馬スライスアプローチを開発しました:(1)スライスに含まれる海馬の領域(側線、中間体、または腹側);(2)内皮質などの海馬外組織の有無。(3)スライス(コロナ、矢状、水平、または斜め)をカットするために使用される方向。(4)スライス後に組織が維持される条件(ACSFに完全に沈水するか、ACSFのインターフェースで保持され、加湿された、カルボゲンが豊富な空気)。
どのスライスアプローチを使用するかを選択することは、実験目的によって決定されるべきである。例えば、水没条件下で維持された眼海馬の横方向またはコロナスライスは、海馬内回路およびシナプス可塑性18、19、20の調査に非常に有効に使用されてきた。しかし、このような調製物は、腹側海馬21、22、23からのスライスほど容易にネットワーク振動を発生させるものではない。持続的なSWR活性の状態は、背側および腹側海馬24からの横切りスライスにおけるテタニック刺激によって誘発され得るが、腹側スライス7,25において自発的なSWRがより容易に観察される。
側方海馬と腹側海馬の間に固有の生理学的および解剖学的な区別は、生体内およびインビトロ26の両方で行われる研究によって支えられている。ラットにおける記録は、側腹および中間海馬全体にわたって強く一貫したシータリズムを明らかにしたが、腹側領域と海馬27の残りの部分との間の一貫性が悪い。生体内のSRSは、裏側海馬と中間海馬の間で容易に伝播し、腹側海馬に由来するSDRはしばしば局所的な28のままである。海馬の縦軸に沿って、裏側および中間海馬に存在するCA3錐体ニューロンに由来する関連投影法。腹側領域から発生するCA3投影は比較的局所的であり、したがって、スライスプロセス29、30の間に切断される可能性が低い。したがって、腹側スライスは、人口同期を生成するために必要な繰り返しネットワークをよりよく保存する可能性があります。vitroで自発的なネットワーク活動を発生させる腹側スライスの傾向は、より多くの側側領域31と比較して、錐体ニューロンの高い固有興奮性または腹側海馬におけるGABAergic阻害の高い固有の興奮性を反映してもよい。確かに、腹側海馬のスライスは、てんかん活動32、33に対してより敏感である。したがって、自発的な生理学的8、9、11、24または病理学的16、34、35、36ネットワーク振動の多くの研究は、伝統的に、時には腹側海馬の横面に平行な組織スライスを生み出す前頭後頭方向にわずかな角度で、水平スライスアプローチを使用してきました。
スライス処理によって、スライスの多くのセルが切断されることで、ネットワーク接続が不可避的に影響を受けます。目的の回路の接続性を最適化するために、準備中に保持されるスライスと組織の角度と厚さを考慮する必要があります。多くの研究は、生理学的または病理学的ネットワーク振動の文脈で2つの構造間の相互作用を探求するために水平結合海馬-内皮質スライス(HEC)を利用しています。Rothらは、海馬のCA1サブフィールドと内側の内皮質の層Vから二重記録を行い、HECスライス37を通してSWR活性の伝播を実証した。てんかんの活動の多くの研究は、てんかんの排出がコルチコヒッポカンネットワーク16、35、36、38を介して伝播する方法を調査するためにHECスライス調製を使用しています。無傷のコルチコヒッポカンピカルループの保存は、自発的なSVR、てんかんの排出、またはガンマ振動の前提条件ではないことを注意することが重要です。ネットワーク振動は、付着した海馬組織21、22、23、25、39、40、41を伴わない、側側または腹側海馬の横切れスライスで生成することができる。海馬スライスにおけるネットワーク振動の自発的発生のためのより重要な要因は、厚いスライス(400〜550 μm)がCA2/CA3の再発ネットワーク21、22、25でより多くの接続を維持するので、各スライスの厚さである可能性があります。
角度付き水平HECスライス(前頭部後頭部方向に約12°の角度でカット)は、コルチコヒッポカンピカルループ11、16、34、35、42の機能的接続性を研究するために使用されてきたが、そのような斜めの準備は、自発的なネットワーク活動43、44、45のために必要とされない。しかし、斜めのスライス平面を使用すると、下向きまたは上向きの角度が適用されるかに応じて、研究者が腹側または中間海馬の横方向の層板を最もよく保存するスライスを選択的に作成することができます(図1)。このアプローチは、パパテオドロプロスら、2002年に使用される方法と概念的に似ており、各海馬を自由に解剖し、組織チョッパーを使用して、側腹側全軸21に沿って横切りスライスを作成した。腹側と側側中海馬の機能的な区別に照らして、研究者は実験を設計したり結果を解釈したりする際に、スライスの解剖学的起源を考慮する必要があります。スライス手順中に寒天ランプを使用することは、中間海馬または腹側海馬のいずれかからスライスを優先的に生成する簡単な方法です。
海馬スライスは、水没したチャンバー(組織がACSFに完全に浸漬された)またはインターフェイススタイルのチャンバー(例えば、オスロまたはハースチャンバー、流れる媒体の薄膜のみで覆われたスライス)のいずれかで維持することができます。インターフェースの維持は、組織の酸素化を促進し、神経細胞の生存を促進し、ニューロン間活動の持続的な高レベルを可能にする。従来、沈められた記録条件は、ネットワークレベル振動の安定した発現のために十分な組織酸素化を提供しない、より遅いACSF流量を使用する。水没した海馬スライスでは、カルバコール誘発ガンマ振動は一過性に観察されるだけであるが、それらは界面記録室10、48、49で安定的に維持することができる。このように、vitroの複雑な自発的活動の多くの研究は、鋭波波波の複合体6、7、8、9、10、25、37、ガンマ振動10、38、45、47を調査するためにインターフェース記録室に依存してきました。
水没式記録室では、浸漬顕微鏡の目的を使用して個々の細胞を可視化し、記録のために健康的な細胞を選択的にターゲットにすることができます。水没した製剤はまた、水没が組織への薬物または他の化合物の急速な拡散を促進するので、細胞ミリューを細かく制御することを可能にする。したがって、水没条件下で安定したネットワーク振動が維持される修正方法論は、強力な実験アプローチを表す。このアプローチは、組織12、48、49への酸素供給を増強するためにACSF(〜6 mL/min)の高い流量を有する改変された水没記録室に移る前に、海馬スライスが簡略化されたインターフェーススタイルの保持室で数時間回復するハホスらの働きによって例示される。これらの条件下では、高レベルのニューロン間活動と安定した自発的ネットワーク振動を、水中記録室に維持することができる。この変更アプローチにより、研究者は視覚的に誘導された全細胞パッチクランプ記録を行い、形態学的に同定された細胞タイプがカルバコール誘導ガンマ振動12に寄与することを特徴付けることを可能にする。SRS は、ACSF11、48、49の速い流量を持つ水没した海馬スライスでも自然発生する可能性があります。Maierら et al. 水没した記録室に移る前にインターフェース室で回収された海馬スライスが確実に自発的なSWRを示したのに対し、水没した記録室に移る前にビーカーに沈んだスライスは、より小さな呼び起動場応答を示し、自発的なシナプス電流のレベルが低く、自発的なSWR43を示すことはほとんどありませんでした。Schlingloffらは、この改良された方法論を用いて、自発的なSRS44の生成におけるパルブアルブミン発現バスケット細胞の役割を実証した。
次のプロトコルは、水平海馬スライス中の自発的に活動するニューロンを界面条件下で回収し、その後、薬理学的または光遺伝学的操作および視覚的に導かれた記録に適した水没記録室で維持することができるスライス法を提示する。

<table><tbody><tr><td>3Dプリンター</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>急性脳スライスインキュベーションホルダー</td><td>NIH 3Dプリント交換</td><td>3DPX-001623</td><td>ChiaMing Leeによって設計され、https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623</td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-三リン酸マグネシウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl 粉砕ペレット</td><td>ワーナー</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td>ベ<td>クトン、ディキンソン</td><td>214530-500g</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>アルファエー</td><td>ザー36237</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー(250 mL)</td><td>キマックス</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー(400 mL)</td><td>キマックス</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>バイオシチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>ブレンダー</td><td>オ</td><td>スターBRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>ボンはさみ、小さな</td><td>ベクトン、ディキンソン</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>フィラメント(外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ10 cm)とホウケイ酸ガラス毛細管(外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ10 cm)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td><td>ファイヤーポリッシュキャピラリーが好ましいです。</td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液 (1 M)</td><td>G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>オリンパス</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>圧縮カルボゲンガス (95% 酸素 / 5% 二酸化炭素)</td><td>エアガス</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>圧縮酸素</td><td>エアガス</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td>定電圧絶縁刺激装置</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>coverslips (22x50 mm)</td><td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td> 理想的には、精密データ収集ソフトウェアAxograph N/A<td>のブラシオンフォームを使用してください</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>同等のソフトウェア(pClampなど)が機能します。</td></tr><tr><td>Dell Precision T1500 Tower Workstation デスクトップ</td><td>Dell</td><td>N/A</td><td>カタログ番号は、特定のコンピュータによって異なります。電気生理学取得ソフトウェアを実行できる限り、どのコンピュータでも動作します。</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>分子デバイス</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>デジタル タイマー</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>4 チャンネル トレーサブル タイマー</td></tr><tr><td>使い捨て吸収剤パッド</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>両刃 カミソリの刃</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>デュアル オートマチック温度コントローラー</td><td>ワーナー・インスツルメント・コーポレーション</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>二重表面または層流最適化記録チャンバー</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>このプロトコルで提示されるチャンバーはカスタムメイドです。商用の同等品は、ワーナーインストゥルメンツのRC-27Lです。</td></tr><tr><td>機器ラック</td><td>Automate Scientific</td><td>FR-EQ70 "</td><td>ラックは厳密には必要ではありませんが、電気生理学を整理するのに役立ちます</td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチエーテル) - N、N、N'、N'-teetraacetic acid (EGTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman</td><td>1004 070</td><td></td></tr><tr><td>細かいスケール</td><td>メトラー・トレド</td><td>XS204DR</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ (100 x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&prime;-triphosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>ice buckets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>一般麻酔サービス</td><td>Tec 3</td><td></td></tr><tr><td>ラボ テープ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>レンズ ペーパー</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>オリンパス</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液 (1 M)</td><td>品質 生物学的</td><td>351-033-721EA</td><td></td></tr><tr><td>磁気攪拌子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-513-56</td><td>カタログ番号は、攪拌子のサイズによって異なります。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Luigs &ノイマン</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター (手動)</td><td>Scientifica</td><td>LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>モニター</td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B マイクロ電極増幅器</td><td>分子デバイス</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>MultiClamp 700Bには、ヘッドステージ、ピペットホルダー、モデルセルが含まれている必要があります。</td></tr><tr><td>N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N&prime;-(2-エタンスルホン酸)、(HEPES)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>針(20ゲージ、長さ1.5)</td><td>ベクトン、ディキンソン</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンフィラメント</td><td>YLIワンダーインビジブルスレッド</td><td>212-15-004</td><td>サイズ0.004。この猫。#は Amazon.com</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td>から <td>ワーナーインスツルメンツコーポレーション</td><td>64-0198</td><td></td></tr><tr><td>パースタルティックポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>ホスホクレアチンジ(トリス)塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>ピペットホルダー</td><td>分子デバイス</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>プラチナ線</td><td>ワールドプレシジョン</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>ポリ乳酸(PLA)フィラメント</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td></td><td>VWR55411-050</td><td></td></tr><tr><td>ローラークランプ</td><td>ワールド精密機器</td><td>14041</td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>メトラー・トレド</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>スライスハープ</td><td>ワーナー</td><td>SHD-26GH/2</td><td></td></tr><tr><td>重曹</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性無水</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S369-500</td><td></td></tr>ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>ヘラ</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>ラ/スプーン、大型</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>メスブレードフェ</td><td>ザー72044-10</td><td></td><td></td></tr>スター<tr><td>ラー/ホットプレート</td><td>コーニング</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>ストップコックバルブ、1ウェイ</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>ストップコックバルブ、3ウェイ</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス<td>アクロスオーガニックス</td><td></td>AC177142500<td></td></tr><tr><td>スイベルクランプのサポートフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ、シャープ/ブラント</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (1 mL)</td><td>Becton, Dickinson 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (60 mL Luer-Lokチップ付き)</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>3 ピンクランプ</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子、大型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子、小型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>移送用ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>タイゴン</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 インチ, 外径 3/16 インチ</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>タイゴン</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 インチ, 外径 1/4 インチ</td></tr><tr><td>真空グリース</td><td>ダウ コーニング</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>振動ブレード ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ付き振動減衰テーブル</td><td>Micro-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>容積フラスコ (1 L)</td><td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>容積フラスコ (2 L)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>温水バス</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

急性げっ歯類の脳スライスは、電気生理学、顕微鏡法、薬理学を用いた単細胞分解能を用いた神経回路の組織と機能に関する洞察を得るための、難解な実験的アプローチを提供します。しかし、 インビトロ 実験の設計における大きな考慮事項は、異なるスライス調製物が 、生体内で 観察される神経活動の自然主義的パターンをどの程度再現するかを示す。無傷の脳では、海馬ネットワークは、覚めの完了状態または非レム睡眠中に起こる鋭波波性複合体(SRS)によって例示されるように、動物の行動状態を反映する高度に同期した集団活動を生成する。SRSおよび他の形態のネットワーク活動は、適切な条件下で孤立した海馬スライス中に自発的に出現する可能性がある。強力な脳スライスツールキットを海馬ネットワーク活動の調査に適用するためには、組織の健康と海馬ネットワーク内の機能的な接続性の維持を最適化するアプローチを利用する必要があります。マウスは、経皮的に冷たいショ糖ベースの人工脳脊髄液と浸透する。海馬を含む水平スライスは、シナプス接続性を維持するために450 μmの厚さで切断されます。スライスはインターフェイススタイルのチャンバで回復し、記録のために水没した部屋に移される。記録室はスライスの酸素化を改善するために高流量の人工脳脊髄液の二重表面の重ね合たちのために設計されている。このプロトコルは、複雑で自発的なネットワーク活動の調査に適した健康な組織 をvitroで生成します。

ここでは、このプロトコルで説明したように準備されたHECスライスからの代表的な録音を示します。インターフェース保持室(図1C)での回復後、スライスは水没した記録室に個別に移される(図2B)。記録チャンバには、蠕動ポンプを用いてカルボゲン飽和ACSFが供給される(図2A)。ポンプは最初に保持ビーカーから熱い貯蔵所にACSFを引き出す。カルボーゲンラインは、メディアの連続酸素化を提供するために、保持ビーカーと加熱された貯蔵所の両方に配置されます。一連の空気充填シリンジからなる脈動ダンパーは、蠕動ポンプと記録室の間に位置し、急速な蠕動によって生成される流量の変動を最小限に抑える。各シリンジ中のエアポケットは、ポンプの各サイクルによって引き起こされる圧力の変化を吸収し、記録チャンバーがACSF52,53のスムーズで一貫した流れを受け取るようにする。脈動...

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

このプロトコルを使用して、研究者は急性マウス脳スライス調製における海馬ネットワーク振動の根底にあるメカニズムを調査できます。この調製では、自発的なネットワーク振動を生じるスライス内の水中条件下で記録を行い、薬理学的および光遺伝学的手法を実行し、シングルセル記録を視覚化することができます。経心筋灌流の場合、マウスをイソフルランチャンバーから取り出す直前に、ペトリ皿の蓋に3〜5ミリメートルの冷やしたショ糖溶液を入れ、ペトリ皿の底に約1cmの冷やしたショ糖溶液を入れます。麻酔をかけたマウスを左の吸収パッドにすばやく移し、3枚のテープを使用して前肢と尾を固定します。大きな組織鉗子と外科用ハサミを使用して、皮膚をテントで覆い、胸骨の下部から胸の上部まで縦に切開します。鉗子を使って胸骨を引き上げ、ハサミを使って横隔膜を切断します。ハサミを使って、前肢が体と出会う点に向かって両側の胸郭を1回の大きな動きで切り込み、鉗子を使用して胸郭の前面を頭に向けて位置します。ハサミを使って水平に切り込みを入れて肋骨を完全に取り除き、鉗子を使って心臓を固定しながら、20ゲージの灌流針を左心室に挿入します。針が所定の位置にあるときは、小さな解剖ハサミを使用して右心房を切開し、血液が循環器系から洗い流されるようにします。脳を抽出するには、斬首後、小さなボンドハサミを使用して、目に近い頭蓋骨の正面の正中線に向かって頭蓋骨を横方向に2回切り込み、頭蓋骨の基部の両側にさらに2つの切り込みを入れます。頭をガラスのペトリ皿に浸し、ハサミを使用して頭蓋骨の全長にわたって正中線に沿って切り込み、ハサミで引き上げて下にある脳組織への損傷を最小限に抑えます。小さな組織鉗子を使用して頭蓋骨の両側をしっかりとつかみ、骨を持ち上げて脳から離して頭蓋骨を本のように開きます。左手の指を使って頭蓋骨のフラップを開いたままにし、微小ヘラを嗅球近くの脳の下に挿入し、脳を頭蓋骨からショ糖に反転させます。マイクロスパチュラを使用して脳幹を切断し、脳を洗って残っている血液、毛皮、または組織を取り除きます。大きなヘラを使って脳をガラスのペトリ皿の蓋に移し、両刃のカミソリの刃の半分を使って、嗅球を含む脳の最も前部に冠状動脈の切り込みを入れます。次に、冠状切開を行って小脳を切除し、寒天ランプにシアノアクリレート接着剤を塗布します。鉗子を使用して、濾紙で脳を短時間乾燥させてから、組織を寒天ランプの腹側を下にして接着剤に入れます。スライスプラットフォームをミクロトームのスライスチャンバーに置き、冷却したショ糖溶液でセットアップを完全に覆います。大きなヘラを使用して、スクローススラリーをチャンバーに攪拌し、凍結したスクロースを溶かし、混合物の温度を摂氏1〜2度に急速に下げます。0.07mm/秒のスライス速度で450ミクロンの厚さにスライスしま

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この記事では、ラットと脳の老化とアルツハイマー病などの加齢に伴う神経変性疾患、関連付けられているシナプスの変化の研究のためのトランスジェニックマウスから海馬切片を調製するための手順の概要を説明します。...

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

このビデオでは、海馬線維経路の完全性を維持することに焦点を当てた、マウスからの水平海馬脳スライスを準備するための詳細なプロトコルを示しています。このプロセスでは、脳を慎重に二等分して固定し、ビブラトームを使用してスライスし、カルボゲン化液体で最適な組織状態を維持し、海馬の脳スライスをさらに実験する準備が整います。...

水平マウス海馬脳スライスの取得

このビデオは、マウスの海馬-嗅内皮質スライスの局所電界電位(LFP)を記録する手順を示しています。海馬のCA3橈骨層で電気刺激が与えられ、CA1錐体層のシナプス後電位に変化を引き起こします。CA1ニューロンの膜電位の複合変化(局所電界電位と呼ばれる)が記録されています。...

マウス海馬-内膜皮質スライスにおける局所電界電位の記録

私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。...

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

微小電極アレイを用いたげっ歯類脳スライス 4 アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調を実行する方法を示します。カスタム記録室は、長期の実験的セッションを通して組織実行可能性を維持します。電極マッピングをライブ、刺激的なペアの選択は、カスタム グラフィカル ユーザー...

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

我々は、長手方向海馬脳スライスの記録と刺激電極を使用し、生体内の背中海馬における縦方向に位置決めされた記録および刺激電極を用いて、細胞外のポストシナプスの可能性を呼び起こし、実証した。縦方向の中間ラメラCA1に沿った長期シナプス可塑性。...

電気生理学的フィールド記録によるインターラメラ海馬CA1における長期シナプス可塑性の調査

これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。...

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

学ぶ急性マウス脳スライスを用いた海馬ネットワーク活動の調査法。水平海馬-内嗅皮質スライスの調製と電気生理学的記録により、自発的シャープウェーブリップル活動を観察し、神経ネットワークの振動動態を解明する。

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

さらに動画を探す