細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング
September 1st, 2020
ここでは、核磁気共鳴(NMR)プローブを回転させる動的核分極(DNP)マジックアングル(DNP)に凍結したサンプルを極低温で伝達するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルには、実験前のローター保管の方向と、実験前後の生存率測定の方向が含まれます。
DNP支援MAS NMR分光法の感度により、無傷の細胞内のタンパク質をその内在性濃度で特性評価することができます。このアプリケーションでは、サンプルの取り扱いには慎重な対応が必要です。一部の形態は保存され、細胞は、このプロトコルを使用して極低温で分光計に移されると生存します。
コールドローターを導入すると、湿気や氷が蓄積し、サンプルの回転を機械的に防ぐことができます。このデモンストレーションでは、極低温トランスファーを自信を持って行うための実験をご案内します。まず、ティッシュまたはペーパータオルで作ったクッションを、蓋の下と極低温バイアルの底に置きます。
3.2ミリメートルのサファイアローターを、ティッシュペーパーでパッドを詰めた極低温バイアルに入れ、マークされた端がバイアルの底を向くようにします。バイアルを制御速度の冷却容器に入れてローターをゆっくりと凍結し、容器を摂氏80度の冷凍庫に最低3時間置きます。凍結したローターが入った極低温バイアルを、液体窒素で満たされた小さな真空フラスコに移します。
真空フラスコを使用して、サンプルを分光器施設に運びます。乾燥した断熱性広口フォーム魔法瓶に、500ミリリットルから1リットルの液体窒素を入れます。トランスファーフラスコから極低温バイアルを取り出し、液体窒素の表面のすぐ上に保持して、大気から保護します。
バイアルの口が少し下を向くように極低温バイアルを保持しながら、キャップを緩め、ローターを液体窒素浴にスライドさせます。1.5ミリリットルの微量遠心チューブを液体窒素に浸して予冷します。液体窒素浴の表面下で、ピンセットを使用して、ドライブチップがチューブの底を向き、マーキングが開口部を向くようにして、ローターをマイクロ遠心チューブに移します。
ピンセットを使用して、ローターを含むチューブを液体窒素の下に保持します。2組目のピンセットで、NMRサンプルキャッチャーを液体窒素の表面より上に保持し、微量遠心チューブに対して鋭角に傾斜させます。ローターをNMRサンプルキャッチャーからNMR分光計に移すには、イジェクトを押してクライオキャビネットをイジェクトモードにします。
NMRサンプルキャッチャーの開放端を、液体窒素の表面下に沈めたまま、微量遠心チューブに挿入します。微量遠心チューブとNMRサンプルキャッチャーの両方を持ち上げて、ローターがサンプルキャッチャーに落ちるようにします。ローターがリムに引っかかった場合は、サンプルキャッチャーとチューブを振ってください。
空の微量遠心チューブをNMRサンプルキャッチャーの上に置いて、ローターを空気から保護します。もう一方の空のサンプルキャッチャーをプローブから取り外し、床に置きます。ローターの入ったNMRサンプルキャッチャーをもう一方の手に移します。
次に、微量遠心チューブを取り外し、すぐにプローブに挿入します。クライオキャビネットを操作する人に、押し、停止、排出、挿入するように信号を送ります。ベアリングと駆動流圧を調整することにより、サンプルを希望の回転速度にスピンアップします。
広口泡真空フラスコに液体窒素1リットルに500ミリリットルを注ぎ、バスを分光計の下に置きます。ティッシュペーパーが入った空の極低温バイアルを液体窒素浴に浸します。駆動ガスとベアリングガスの流量を減少させて回転速度を0キロヘルツに下げ、排出モードに切り替えてローターを排出します。
排出モードをオンにしたまま、サンプルキャッチャーをプローブから取り外し、ローターを直接液体窒素の入った広口フォームフラスコに落とします。予め冷却されたピンセットを使用して、ローターを液体窒素の表面の下にある予め冷却された極低温バイアルに移します。極低温バイアルキャップを液体窒素に浸して事前に冷却します。
ローターと液体窒素が入ったバイアルをバスから取り出し、事前に冷やしたキャップでチューブをキャップします。極低温バイアルを液体窒素に再浸します。サンプルは、長期の液体窒素貯蔵に移すか、またはさらなる分析のためにすぐに開梱することができます。
哺乳類細胞の凍結済みサンプルを極低温でNMR分光計に挿入することで、NMR実験全体を通して生存率をサポートします。このプロトコルを使用すると、MAS NMR後の哺乳動物細胞のトリパンブルー透過性は、温度変化にさらされていない細胞の透過性と同様です。細胞を徐放しにし、挿入前に室温まで温めると、細胞の生存率は10%未満に低下します一方、哺乳類細胞の凍結サンプルを極低温で挿入すると、NMR実験全体を通して細胞の生存率がサポートされます。
プロトコルを実行しようとするときは、イジェクトを押してサンプルを回転させ、サンプルがウォームアップする前にプローブに導入できるようにし、プローブに水分が導入されないようにすることで、分光器が何週間も冷たくなることが保証されています。このプロトコールは、凍結急冷反応、トラップされた反応中間体の特性評価、酵素学、タンパク質のフォールディングなど、温度変動によってサンプルの完全性が損なわれる可能性のあるあらゆるシステムに適用できます。
概要
このプロトコルは、凍結サンプルの低温移動を魔法角度回転（MAS）核磁気共鳴（NMR）プローブに詳細に説明し、サンプルの完全性と生存率の維持に焦点を当てています。ローターを分光器に導入する際の水分の蓄積の課題に対処し、実験全体を通して細胞が機能的な特性を保持することを確保します。
主要な研究構成要素
研究分野
- ダイナミック核磁気偏極（DNP）NMR分光法
- 生物学研究におけるサンプル処理
- 実験手順中の細胞生存率
背景
- 完全な細胞内でタンパク質を研究するためのDNPの重要性
- 低温移動中の水分と氷の蓄積の課題
- プロトコルを通じて細胞生存率を維持することの重要性
使用方法
- 熱絶縁システムを使用した凍結サンプルの低温移動
- 生物学的システムとしての哺乳類細胞
- 核磁気共鳴（NMR）技術
主な結果
- NMR実験中の細胞生存率の成功的な維持
- トリパンブルー透過性は、冷却された細胞と非冷却細胞で同様の生存率を示します
- このプロトコルは、サンプル処理の低温方法の有効性を検証します
結論
- この研究は、NMRプローブへのサンプル挿入のための効果的な低温方法を示しています
- このプロトコルは、温度に敏感なサンプルを含む生物学的実験の信頼性を向上させます
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cryogenic sample handling enables preservation of cellular integrity for dynamic nuclear polarization NMR studies of intracellular proteins at endogenous concentrations. This approach supports target validation in native cellular environments by maintaining viability through low-temperature transfer. The protocol addresses a key bottleneck in applying high-sensitivity NMR to drug discovery workflows requiring mechanistic de-risking of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by characterizing proteins inside intact cells at physiological concentrations.
- Operational Value: Preserves cellular viability during NMR experiments, reducing false negatives from sample degradation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through structural data obtained under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, atom-level readouts of protein-ligand interactions in cryopreserved cellular systems.
- Operational Value: Standardizes sample introduction to minimize variability from ice accumulation or moisture interference.
- Assay Readiness: Enables reproducible preparation of frozen rotor samples for high-sensitivity DNP-MAS NMR screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural biology with preclinical validation by maintaining sample integrity across workflows.
- Disease-Relevant System: Applicable to mammalian cell models used in target validation and pathway elucidation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on structural data from viable, endogenous-state samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling structural characterization after target identification and before lead optimization, particularly for intracellular targets requiring native-cell context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing atomic-resolution data on proteins in viable cells.
- Screening: Ensures assay reproducibility through controlled cryogenic transfer that prevents moisture-related spinning failures.
- Analytics: Generates quantitative structural and dynamic measurements that inform target confidence and ligand-binding assessments.
- Translational Research: Maintains continuity from cellular target validation to preclinical models by preserving sample integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for cryogenic handling of temperature-sensitive biological samples across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via structural data from intact, viable cells.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in sample transfer, reducing experimental failure from moisture or ice buildup.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable mechanistic data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility in native cellular environments.
Implementation Considerations
- Expertise in cryogenic sample handling and NMR probe operation.
- Access to controlled-rate cooling equipment, liquid nitrogen dewars, and thermally insulated transfer flasks.
- Standardization of transfer procedures across teams to ensure consistent sample integrity.
- Adaptation considerations for different rotor types or cell lines while maintaining low-temperature chain.
- Practical limitation: Requires rapid execution to prevent warming during transfer, necessitating trained personnel coordination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Cryopreservation of Mammalian Cells in an NMR Rotor
1:25
Cryogenic Transfer of a Frozen Sample into the NMR Spectrometer
3:48
Cryogenic Removal of the Sample from the NMR Spectrometer
5:02
Results: Cryogenic Insertion of a Pre-frozen Sample of Mammalian Cells Results in Cellular Intactness Similar to Never-frozen Mammalian Cell Samples
5:47
Conclusion
