細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

DNP支援MAS NMR分光法の感度により、無傷の細胞内のタンパク質をその内在性濃度で特性評価することができます。このアプリケーションでは、サンプルの取り扱いには慎重な対応が必要です。一部の形態は保存され、細胞は、このプロトコルを使用して極低温で分光計に移されると生存します。

コールドローターを導入すると、湿気や氷が蓄積し、サンプルの回転を機械的に防ぐことができます。このデモンストレーションでは、極低温トランスファーを自信を持って行うための実験をご案内します。まず、ティッシュまたはペーパータオルで作ったクッションを、蓋の下と極低温バイアルの底に置きます。

3.2ミリメートルのサファイアローターを、ティッシュペーパーでパッドを詰めた極低温バイアルに入れ、マークされた端がバイアルの底を向くようにします。バイアルを制御速度の冷却容器に入れてローターをゆっくりと凍結し、容器を摂氏80度の冷凍庫に最低3時間置きます。凍結したローターが入った極低温バイアルを、液体窒素で満たされた小さな真空フラスコに移します。

真空フラスコを使用して、サンプルを分光器施設に運びます。乾燥した断熱性広口フォーム魔法瓶に、500ミリリットルから1リットルの液体窒素を入れます。トランスファーフラスコから極低温バイアルを取り出し、液体窒素の表面のすぐ上に保持して、大気から保護します。

バイアルの口が少し下を向くように極低温バイアルを保持しながら、キャップを緩め、ローターを液体窒素浴にスライドさせます。1.5ミリリットルの微量遠心チューブを液体窒素に浸して予冷します。液体窒素浴の表面下で、ピンセットを使用して、ドライブチップがチューブの底を向き、マーキングが開口部を向くようにして、ローターをマイクロ遠心チューブに移します。

ピンセットを使用して、ローターを含むチューブを液体窒素の下に保持します。2組目のピンセットで、NMRサンプルキャッチャーを液体窒素の表面より上に保持し、微量遠心チューブに対して鋭角に傾斜させます。ローターをNMRサンプルキャッチャーからNMR分光計に移すには、イジェクトを押してクライオキャビネットをイジェクトモードにします。

NMRサンプルキャッチャーの開放端を、液体窒素の表面下に沈めたまま、微量遠心チューブに挿入します。微量遠心チューブとNMRサンプルキャッチャーの両方を持ち上げて、ローターがサンプルキャッチャーに落ちるようにします。ローターがリムに引っかかった場合は、サンプルキャッチャーとチューブを振ってください。

空の微量遠心チューブをNMRサンプルキャッチャーの上に置いて、ローターを空気から保護します。もう一方の空のサンプルキャッチャーをプローブから取り外し、床に置きます。ローターの入ったNMRサンプルキャッチャーをもう一方の手に移します。

次に、微量遠心チューブを取り外し、すぐにプローブに挿入します。クライオキャビネットを操作する人に、押し、停止、排出、挿入するように信号を送ります。ベアリングと駆動流圧を調整することにより、サンプルを希望の回転速度にスピンアップします。

広口泡真空フラスコに液体窒素1リットルに500ミリリットルを注ぎ、バスを分光計の下に置きます。ティッシュペーパーが入った空の極低温バイアルを液体窒素浴に浸します。駆動ガスとベアリングガスの流量を減少させて回転速度を0キロヘルツに下げ、排出モードに切り替えてローターを排出します。

排出モードをオンにしたまま、サンプルキャッチャーをプローブから取り外し、ローターを直接液体窒素の入った広口フォームフラスコに落とします。予め冷却されたピンセットを使用して、ローターを液体窒素の表面の下にある予め冷却された極低温バイアルに移します。極低温バイアルキャップを液体窒素に浸して事前に冷却します。

ローターと液体窒素が入ったバイアルをバスから取り出し、事前に冷やしたキャップでチューブをキャップします。極低温バイアルを液体窒素に再浸します。サンプルは、長期の液体窒素貯蔵に移すか、またはさらなる分析のためにすぐに開梱することができます。

哺乳類細胞の凍結済みサンプルを極低温でNMR分光計に挿入することで、NMR実験全体を通して生存率をサポートします。このプロトコルを使用すると、MAS NMR後の哺乳動物細胞のトリパンブルー透過性は、温度変化にさらされていない細胞の透過性と同様です。細胞を徐放しにし、挿入前に室温まで温めると、細胞の生存率は10%未満に低下します一方、哺乳類細胞の凍結サンプルを極低温で挿入すると、NMR実験全体を通して細胞の生存率がサポートされます。

プロトコルを実行しようとするときは、イジェクトを押してサンプルを回転させ、サンプルがウォームアップする前にプローブに導入できるようにし、プローブに水分が導入されないようにすることで、分光器が何週間も冷たくなることが保証されています。このプロトコールは、凍結急冷反応、トラップされた反応中間体の特性評価、酵素学、タンパク質のフォールディングなど、温度変動によってサンプルの完全性が損なわれる可能性のあるあらゆるシステムに適用できます。