その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

ナノ粒子は、そのユニークな物理化学的特性により、産業や医療でますます使用されています。しかし、ナノ粒子への長期にわたる曝露に伴うヒトの健康に対する懸念は依然として残っています。これらのリスクは、細胞内のナノ粒子の挙動と、ナノ粒子に対する細胞の誘導代謝応答を研究することで定量化できます。

これは、シンクルセル内の内在化ナノ粒子の検出と定量を可能にする方法が不足していることが一因です。顕微鏡法や質量分析法など、数多くの分析ツールを使用してナノ粒子の細胞内への取り込みを推定できますが、これらは顕微鏡レベルでの定性的な情報しか提供しません。それどころか、原子分光法に基づくin situ法は、サンプル調製から生じるイメージングアーティファクトの量を減らすことができ、ナノ粒子の直接観察をもたらすことができます。

これを利用するために、私たちは、天然状態または蛍光タグ付きの実験室でナノ粒子を研究できる相関アプローチを提示します。ここでは、蛍光顕微鏡法と核マイクロプローブ分析の組み合わせに基づく方法について説明します。これにより、細胞密度、化学元素の特殊な分布、および細胞あたりのナノ粒子の量の画像が得られます。

そのデモンストレーションとして、二酸化チタンナノ粒子に曝露された細胞から、蛍光顕微鏡と核マイクロプローブ分析の両方を用いて24時間にわたって研究します。このプロトコールでは、ポリマーPEEKで作られたカスタムサンプルホルダーが必要です。細胞培養やin vitro観察に適している必要があります。

ホルダーを厚さ2ミクロンのポリカーボネートホイルで覆います。ポリカーボネートホイルは、Formvar溶液の薄層でPEEK皿に接着されます。取り付けたら、サンプルホルダーを滅菌する必要があります。

複数の滅菌サンプルホルダーは、使用に必要になるまで、ウェルごとに1つずつ滅菌12ウェルプレートに保存できます。マトリックス列GFPプラスミドをトランスフェクションした細胞は、トランスフェクションが成功したこと、および蛍光タンパク質を発現していることを蛍光顕微鏡でチェックします。細胞をトリプシンで採取し、摂氏37度で3分間インキュベートします。

トリプシンの作用を止めるには、新鮮な培地を加えます。細胞を遠心分離により、摂氏4度で毎分1200回転で5分間ペレット化します。上清を取り除き、適切な量の新鮮な培地を追加します。

細胞をカウントし、新鮮で熱添加された完全培養培地で希釈して、マイクロリットルあたり500細胞の細胞懸濁液を得ます。ポリカーボネートホイルの中央に40マイクロリットルの液滴をプレートします。サンプルをセルインキュベーターに2時間慎重に置きます。

2ミリリットルの新鮮な培地を静かに加え、24時間放置します。蛍光二修飾酸化チタンナノ粒子は、in vitroでナノ粒子を検出、追跡、および局在化するために、一般的に使用される蛍光色素で設計、合成、およびグラフトされました。このステップでは、超純水中の超純水中に1ミリグラム/ミリリットルの濃度の二酸化チタンナノ粒子懸濁液がすでに調製されているはずです。

室温で1分間の高強度超音波処理パルスを使用してナノ粒子を分散させる。ナノ粒子を適切な培地で希釈して、1平方センチメートルあたり4マイクログラムの曝露懸濁液を得る。以前の細胞培養培地をこの新しいナノ粒子含有培地に切り替え、穏やかに混合して均一なナノ粒子分布を実現します。

二酸化チタンナノ粒子を添加せずに、同じ方法で一連のコントロールセルを調製します。細胞集団を24時間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを使用して、これらのサンプルを固定し、蛍光顕微鏡を使用したin situおよびシングルセルイメージングのために処理することができます。

しかし、極低温物理的固定は、細胞の超微細構造と生化学的完全性を維持します。プランジ凍結固定は、細胞の活動をミリ秒単位で迅速に停止し、固定剤の使用を回避します。細胞を極低温固定するために、以下のことを行います。

アルミニウム製トランスファープレートを液体窒素で冷却して調製します。プレートは液体窒素で満たされた箱に保管し、プレート表面を冷たい窒素蒸気の液体の上に保ちます。十分な量の2-メチルブタンを摂氏150度に冷やします。

50ミリリットルのファルコン1個を培地で、2匹のファルコンを超純水で調製します。サンプルを凍結する前に、サンプルを乾燥させるために吸収紙が近くにあることを確認してください。細胞を培地で1回すすぎ、次に滅菌済みの超純水でさらに2回すすぎ、培地に残っている余分な塩分を取り除きます。

吸収紙でサンプルをすばやく乾燥させます。冷却した2-メチルブタン中の細胞を30秒間プランジ凍結し、冷却したアルミニウムトランスファープレートに置きます。コールドプレート表面に水蒸気が結露するのを防ぐために、ボックスをできるだけ閉じておくことが重要です。

すべてのサンプルを凍結した後、以下の方法で凍結乾燥を行い、水分を昇華させます。まず、低圧・低温で12時間から24時間、一次乾燥を行います。次に、圧力を低く保ち、プレート温度を摂氏40度に上げた状態で少なくとも24時間二次乾燥相を行います。

凍結固定後、サンプルは、ほこりや湿気から保護された無菌で乾燥した状態で、室温で数日間保存できます。核マイクロプローブ分析は、フランスのボルドーにあるイフェラの施設で行われました。3.5メガボルトのシングルトロン粒子加速器は、メガ電子ボルトのエネルギー範囲の光イオンビームを供給します。

化学元素イメージングは、相補型イオンビーム分析技術を使用してマイクロプローブビームラインで行われました。マイクロPIXE、粒子誘起X線放射、STIM、走査型透過イオン顕微鏡、およびマイクロRBS、ラザフォード後方散乱分光法を通じて使用される技術。サンプルは分析チャンバー内に配置され、真空下でさまざまな粒子を照射して、さまざまなイオンビーム分析を実行します。

STIMは、密度の異なる細胞の領域をゆるく通過するエネルギー粒子に基づいて、細胞の空中密度マップを記録するために使用されます。Micro-PIXEおよびmicro-RBS分析は、単一細胞レベルでの化学元素の空間分布と定量化を提供します。1.5メガ電子ボルトの陽子マイクロビームを直径約1マイクロメートルまで集束させ、目的の細胞を横切ってスキャンし、STIMによって同定します。

ナトリウムからチタンまでのサンプルに存在する原子から放出されるX線により、元素濃度を決定できます。後方散乱陽子は、X線強度を正規化するために必要な入射粒子の総数を測定するために収集されます。X線検出器の応答を校正するためには、元素濃度の定量化のための認証済み校正標準試料を用意することが重要です。

イオンビームのデータを解析するために、ImageJ用の新しいプラグインを開発しました。まず、STIM密度マップを計算しました。走査型透過鉄顕微鏡画像のコントラストは、密度の局所的な違いによるものであり、核や細胞質などの細胞構造の検出を可能にします。

複数のマップを一度に処理できます。各マップは、入射するパーティクルから伝達されるエネルギーの媒質に対応します。データ解析の2番目のステップは、個々の細胞スペクトルを計算することです。

粒子誘起X線発光分析により、サンプルの化学組成と化学元素の元素マップの両方が得られます。化学元素マップは、記録時のビーム位置に応じて光子をソートし、特定の元素を中心とするエネルギーウィンドウを選択した後に計算されます。マップは通常、ビーム位置で検出されたイベントの数を表し、定量的データが含まれています。

化学マップのスタック(選択した元素ごとに1つずつ)が計算されます。各細胞の関心領域は、リンのPIXEデータを使用して見つけられます。次に、各細胞全体に対応するスペクトルは、各細胞の関心領域全体の個々のスペクトルを合計することによって計算されます。

ここから、各細胞内の化学存在量に関する定量的データを、専用のPIXEおよびIBS分析ソフトウェアを使用して抽出できます。ここでは、パラホルムアルデヒド固定後の細胞の蛍光画像を示します。上の行は二酸化チタンナノ粒子に曝露されていない細胞を示し、下の行は曝露されています。

青のチャンネルは細胞の核、緑のチャンネルはミトコンドリア、赤のチャンネルはチタンを示しています。コントロールには二酸化チタンが存在しないことがはっきりとわかります。右側の合体したチャネルから、ナノ粒子は細胞質にのみ存在し、ミトコンドリアからは除外されていることがわかります。

しかし、この手法に欠けているのは、ナノ粒子の濃度に関する定量的な情報です。核マイクロプローブ分析は、これを提供することが期待できます。これらの画像はすべて、さまざまなマイクロプローブ分析技術を使用して撮影されています。

ここでも、上の行はコントロールセルを示し、下の行はチタンナノ粒子を含むセルを示しています。左端の画像は、極低温で固定された細胞の密度のSTIM測定値を示しています。次の3つのパネルは、PIXEによって得られた細胞に存在するカリウム、リン、チタンの存在量を示しています。

繰り返しになりますが、チタンはコントロールにも細胞核にも存在しません。チタンの取り込みを細胞ごとに定量化するために、右端のパネルに示されている細胞境界に基づいて関心領域を定義し、これらの領域の元素存在量を測定します。これらのPIXE測定から、コントロール集団と曝露集団の単一細胞レベルでの元素存在量の分布をプロットしました。

対照母集団は白でプロットされ、曝露された母集団は黄色でプロットされます。ここに存在するチタンの含有量の中央値は、1平方センチメートルあたり4マイクログラムの曝露量と比較して非常に低いです。チタンの摂取範囲は、0.2マイクログラム/平方センチメートルから1.8マイクログラム/平方センチメートルまで、人口全体で大きなばらつきを示しています。

また、ナノ粒子に曝露した試料では、カリウムやカルシウムなどの遊離細胞内イオンの増加が見られ、二酸化チタンナノ粒子の存在によって細胞の恒常性が変化することが示唆されました。核マイクロプローブ分析は、細胞内レベルで有用な情報を提供し、生物学的サンプルを構成する化学元素の定量化を提供します。これらの手法には多くの利点があります。

1つは、化学固定を必要としないサンプル調製において。2つ目は、関心のある追加の領域に焦点を当てる能力を備えた、より広い領域を研究する可能性です。3つ目は、グラムあたり数マイクログラムの感度で化学元素を定量化することです。

そして4つ目は、核、核小体、細胞質などの細胞コンパートメントの同定です。単一細胞におけるナノ粒子の内在化を研究する際には、これらの正確な測定が定量的なナノ粒子毒性学に不可欠です。ここで研究した事例が示すように、個々の細胞内のナノ粒子を観察および定量する能力により、金属酸化物ナノ粒子などの内因性および外因性の化学元素の価値の蓄積をよりよく理解することができます。

このプロトコルは、ナノ粒子と生細胞との相互作用の将来の研究に対する核マイクロプローブ分析の適合性を強調しています。定量的アプローチでは、これらのナノ粒子の影響に関する情報を、検出、同定、局在化、定量の観点から、および天然ナノ粒子と化学修飾ナノ粒子の両方についてシングルセルレベルで提供します。