Name: その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学ぶ金属酸化物ナノ粒子の単細胞定量法。蛍光顕微鏡と核マイクロプローブ分析を組み合わせ、ヒト細胞内のナノ粒子をその場で検出し、化学元素の空間分布と定量的な取り込み量を測定する革新的アプローチです。

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<ol><li>Krug, H. F., Wick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+An+Interdisciplinary+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).</li>
<li>Van Hove, M. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0920586105008783">From surface science to nanotechnology.</a> Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).</li>
<li>Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ntrev.2013.2.issue-2/ntrev-2012-0080/ntrev-2012-0080.xml">Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches.</a> Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).</li>
<li>Oberdorster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+assessment+for+nanotechnology+and+nanomedicine%3A+concepts+of+nanotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+Med%22%5BJournal%5D)">Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology.</a> J. Int. Med. , 89-105 (2009).</li>
<li>Savolainen, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925753510000767">Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review.</a> Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).</li>
<li>Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+assessment+of+engineered+nanomaterials+and+nanotechnologies+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol%22%5BJournal%5D)">Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review.</a> Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).</li>
<li>Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology+and+in+vitro+studies%3A+The+need+of+the+hour%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour.</a> Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).</li>
<li>Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+nanoparticles+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med%22%5BJournal%5D)">Resolving the nanoparticles paradox.</a> Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).</li>
<li>Schaumann, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969714014739">Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts.</a> Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).</li>
<li>Olesik, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlesik%2C+JW+%22Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometers.+Treatise+on+Geochemistry%22">Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry</a>. , Elsevier Ltd. (2014).</li>
<li>Krystek, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0026265X12000422">A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12154-015-0133-5">Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology.</a> J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).</li>
<li>Le Trequesser, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+in+situ+detection+and+quantification+of+metal+oxide+nanoparticles+using+multimodal+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy.</a> Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).</li>
<li>Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Methods+for+Imaging+Metals+in+Biology%3A+From+Transition+Metal+Metabolism+to+Transition+Metal+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling.</a> Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).</li>
<li>Legin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/sc/c3sc53426j#!divAbstract">NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs.</a> Chem. Sci. 5, 3135(2014).</li>
<li>Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and profiling of single cells.</a> J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).</li>
<li>Waypa, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+triggers+subcellular+compartmental+redox+signaling+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells.</a> Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Dynamic+Redox+Changes+in+Mammalian+Cells+with+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Hanson, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Mitochondrial+Redox+Potential+with+Redox-sensitive+Green+Fluorescent+Protein+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li>
<li>Chen, X., Mao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+dioxide+nanomaterials%3A+Synthesis%2C+properties%2C+modifications+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications.</a> Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).</li>
<li>Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21425910">Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity.</a> Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).</li>
<li>Sorieul, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X14002894">An ion beam facility for multidisciplinary research.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).</li>
<li>Barberet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X11002199">First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications.</a> Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).</li>
<li>Devès, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X15000373">An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).</li>
<li>Mayer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMayer%2C+M+%22SIMNRA+User%27s+Guide%2C+Report+IPP+9%2F113%22">SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113</a>. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).</li>
<li>Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168583X10006452">The Guelph PIXE software package IV.</a> Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).</li>
<li>Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+Dioxide+Nanoparticles+Induce+Endoplasmic+Reticulum+Stress-Mediated+Autophagic+Cell+Death+via+Mitochondria-+Associated+Endoplasmic+Reticulum+Membrane+Disruption+in+Normal+Lung+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells.</a> PLoS ONE. , 1-17 (2015).</li>
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特に細胞内のレベルで、他のイメージング技術で何ができるを超えて有用な情報を提供する手法を提案します。そのイメージングの能力に加えて、核マイクロ プローブ分析法は、生体試料の組成に入る化学要素の定量化の可能性を提供しています。本研究ではひと細胞集団と TiO2 NPs にさらされる単一のセルに基づいて選択した領域の解析に焦点を当てて.他の技術との組み合わせは、元素の組成形態細胞イメージングと正確な定量的データの両方を提供します。
核マイクロ プローブ分析を正常に適用するには、潜在的な落とし穴を避けるために次の点を考慮するは必須です。まず、その微細構造とその生化学的整合性を保持するために低温セル固定のプロトコルを使用することが不可欠です。第二に、厚さ 20 μ m 以下の薄膜試料の分析を実行する必要はも。必要な場合は、cryofixed のサンプルの断面が実行でした。サンプルは、絶対に冷凍保管すべき。第三に、それも核マイクロ プローブ分析が生体試料の二次元表現を明らかにすることを念頭に重要です。したがって、得られた元素分布は誤解を招く可能性があることができる二次元...

生体のホメオスタシス、取り込みコントロール、同化、および別の微量元素 (外因性の無機化合物、金属イオン) の細胞内局在性によって決まります。これらのコンポーネントは、トレースの形では多くの場合がそれにもかかわらずシステム生理学に大きな影響を持つ可能性があります。したがって、正常と病理/強調した状況での細胞生化学的研究は、細胞の代謝機構の全体的な理解を目指してキー手順です。そのため、細胞内の化学的組成、構造とその関連代謝機能の調査を有効にするイメージング ・分析技術の開発が必要になります。非常にいくつかの方法がある特定のサンプルの全体的な化学的性質に関する情報の場で定量的な作品を提供することができます。別にバルク試料の分析の方法、その場で解析検討生体試料の整合性の質量や構造については、その成分の化学物質 (微量元素とイオン) は保持を失うことがなく、蛋白質。さらに、ナノサイエンスが発展するのにつれ、改良されたイメージングと細胞のスケールの環境モニタリングのための分析方法必要があります観察し、ナノ オブジェクトの動作との相互作用を定量化します。1
ナノ粒子 (NPs) は、範囲 1 から 100 nm の少なくとも 1 つの顔ディメンションを示すオブジェクトとして定義されています。2特定の物理化学的性質のため業界では広く NPs が使用します。NPs は、ナノメディシン、バイオ アプリケーションでを使用しています。3,4 NPs の多数の物理化学的特性、にもかかわらずに、彼らは人間の健康や環境に及ぼす悪影響のいくつかのリスクを生成可能性があります。これらのリスクを様々 な濃度で長期反復的な露出によって誘起すること、これがまだ確立されていない明確に。5,6,7,8特に、細胞と関連付けられている細胞の応答内の NPs の運命は、日付、完全には説明されています。これは検出を許可するメソッドの希少性と単一のセルに内面化された NPs の定量化のための一部です。9
ナノ粒子の細胞投与量が質量分析法 (MS) 系を推定する古典的な分析道具誘導結合プラズマ MS (ICP-MS)10,11と液体クロマトグラフィー MS (LC-MS)、しかし、彼らのみを提供マクロ スケールでの有用な情報。それらのどれもは、細胞内の NPs コンテンツも分別方法使用せず NPs 分布の正確な評価を提供できます。用量反応の体系的な評価は、こうして核マイクロ プローブ分析12,13, 放射光蛍光 x 線顕微鏡14 など原子の分光に基づく方法ではなく、これらのメソッドでは不可能です。と二次イオン質量分析 (SIMS)。15,16彼らは蛍光顕微鏡を用いて観察を補完するために、NPs 蛍光分子と分類することはできません、したがって、自然な状態で研究されている場合は特に、これらのメソッド、特に興味深いものです。ある程度としても、fluorophores が付いている NPs に接木される (i) 定量化は難しい NP あたりタグのレベルは知られている、(ii) NP 表面の化学修飾はその細胞の分布を変更可能性がありますので。
この記事では、形態と元素組成のメジャー、マイナー、生体試料のイメージングを目指して核プローブ技術の組み合わせに基づく方法に焦点を当てるし、濃度をトレースします。
核マイクロ プローブ分析特に生体内微量元素の測定に適していることを証明します。梁の横方向分解能 (1 に 0.3 μ m) と元素の検出感度 (10 µg.g 1 から-1乾燥質量) 細胞レベルでの研究に適しています。核プローブ技術は、放出後、サンプルで現在の原子と相互作用 (MeV エネルギー通常実行して) イオンビーム粒子検出 (光子、電子、イオン) に基づいています。細胞に生じる相互作用は、主に: 1) その基本的な状態に戻ってから原子光子の放出が続く原子の励起・ イオン化・ 2) 彼らのエネルギーおよび方向の変更につながる受信粒子の拡散。相互作用に関与する原子の放出粒子エネルギー簡便同定の測定。要素のマッピングを実行するには、イオン マイクロビーム繰り返しスキャンのサンプル表面上頻度が約 100 μ m2を含むいくつかの細胞で 100 部以上。生成された粒子が検出され、各ビームの位置に彼らのエネルギーが記録されます。粒子ビーム位置に従って並べ替え、データ処理の目的は、そのような粒子の排出を担当の構造を識別する方法します。ここで、正確に蛍光顕微鏡と検出し、生活と NP の相互作用の結果を調査するために細胞と細胞内のスケールで外因性の NPs を定量化する核マイクロ プローブ分析に基づくを説明します。システム。我々 は、細胞レベルで酸化チタン (TiO2 NPs) ナノ粒子集合体の場で数量の面でこのメソッドによって提供される機会に特に集中しなければなりません。

<table><tbody><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC、LGC 標準</td><td>ATCC HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>培地 MCCOY 5A w/o L-グルタミン</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>L0211-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>500105U</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;L-グルタミン 200 mM, 100 mL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin,&nbsp; 20 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10092772</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)&nbsp; 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Red</td><td>Lipocalyx</td><td>VR-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-roGFP Plasmid</td><td>AddGene</td><td>#49437</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3570</td><td>取り扱い</td></tr><tr><td><ストロング>NPs調製</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TiO2 P25 AEROXIDE</td><td>Degussa/Evonik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T3163</td><td>NPs</td></tr><tr><td><ストロング>サンプル調製</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート箔</td><td>Goodfellow</td><td>CT301020</td><td></td></tr><tr><td>Polyether エーテル ケトン支持体 (PEEK)</td><td>Matechplast</td><td>A-239-4047</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、ACS 絶対</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>02860-6x1L</td><td></td></tr><tr><td>クロルホルム、無水、99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>372978-1L&nbsp;</td><td>注意 有毒</td></tr><tr><td>Formvar 100 g</td><td>寒天科学</td><td>AGR1201</td><td>有害です。10 &microの濃度で使用します。クロロホルム</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sample fixation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powder、95%パラホルムアルデヒド</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500G</td><td>の1mLあたりのg注意は有毒です。PBS</td></tr><tr><td>PBS(pH 7.4、Ca2+およびMg2+なし)</td>の4%溶液として使用 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11503387</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>93443</td><td>有害</td></tr><tr><td><強>サンプル凍結固定</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>空気液体サンテ</td><td></td><td>有害な</td></tr><tr><td>メチルブタン>=99%</td><td>SIGMA-ALDRICH&</td><td>nbsp;M32631-1L</td><td>注意 有毒</td></tr><tr><td>アルミニウム トランスファー プレート</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸留水と脱イオン水</td><td>自家製</td><td></td><td>Barnstead Smart2Pure システムを使用して実験室で製造</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barnstead Smart2Pure</td><td>ThermoFisher科学</td><td>50129870</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティベンチ、クラスII</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MSC-Advantage</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>Biorad</td><td>145-0102SP</td><td></td></tr><tr><td>カウンティングスライド 2ウェル</td><td>Biorad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>PIPS検出器、25 mm2、12 keV エネルギー分解能 @5.5 MeV</td><td>キャンベラ&nbsp;</td><td>PD25-12-100AM</td><td></td></tr><tr><td>高分解能Si(Li)固体検出器、145-eVエネルギー分解能、@Mn-K&alpha;</td><td>オックスフォード・インストゥルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エバーハート・ソーンリー型二次電子検出器(SED)&nbsp;</td><td>オルセー物理学</td><td>1-SED</td><td></td></tr><tr><td>XRF 校正標準 ナトリウムまたは塩素 NACl</td><td>マイクロマター</td><td>34381</td><td></td></tr><tr><td>XRF 校正標準 マグネシウム MgF2</td><td>マイクロマター</td><td>34382</td><td></td></tr><tr><td>XRF 校正標準 アルミニウム AS アル金属</td><td>マイクロマター</td><td>34383</td><td></td></tr><tr><td>XRF 校正標準 シリコン SIO</td><td>マイクロマター</td><td>34384</td><td></td></tr><tr><td>XRF校正標準 硫黄 CuSx</td><td>マイクロマター</td><td>34385</td><td></td></tr><tr><td>XRF校正標準 CaF2</td>マイクロ<td>マ</td><td>ター34387</td><td></td></tr><tr><td>XRF校正標準 チタン金属</td><td>マイクロマ</td><td>ター34388</td><td></td></tr><tr><td>XRF校正標準 鉄アズフェ金属</td><td>マイクロマ</td><td>ター34389</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター750W</td><td>ソニックス材料</td><td>11743619</td><td></td></tr><tr><td>3MMマイクロプローブ</td><td>バイオブロック 科学</td><td>220-05</td><td></td></tr><tr><td>真空凍結乾燥機</td><td>Elexience</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡 Zeiss AxioObserver Z1</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>431006-9901</td><td></td></tr><tr><td>電動ステージ xy</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>432031-9902</td><td></td></tr><tr><td>EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 対物レンズ</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420351-9910</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 対物レンズ</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>420781-9910</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss filterset 02</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>488002-9901</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス フィルターセット 38HE</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>489038-9901</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス フィルターセット 31</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, GmbH</td><td>000000-1031-350</td><td></td></tr><tr><td>化学ヒュームフード</td><td>Erlab</td><td>Captair SD321</td><td></td></tr><tr><td>粒子加速器</td><td>HVEE</td><td>singletron</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of health, USA</td><td>ImageJ 1.51</td><td></td></tr><tr><td>SimNRA software</td><td>Max-Planck-Institut f&uuml;r Plasmaphysik, ドイツ</td><td>SIMNRA 6.06</td><td></td></tr><tr><td>Gupix software</td><td>グエルフ大学, カナダ</td><td>GUPIXWIN 2.2.4</td><td></td></tr></tbody></table>

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

化学元素イメージングに基づく微量分析の手法では、ローカリゼーションと細胞レベルで化学組成の定量を有効にします。彼らは生きているシステムの特性評価のための新しい可能性を提供、検出、ローカライズおよび金属酸化物ナノ粒子の生物的標本と環境の両方の存在を定量化に特に適して。確かに、これらの技術すべては (1 から 10 µg.g-1乾燥質量の最大) 感度 (i)、(ii) マイクロ メートルの範囲の空間分解能は、および (iii) 複数要素の抽出で関連する要件を満たします。これらの特徴を考えると、マイクロビーム化学元素イメージング力強く補完できるルーチンのイメージング技術など光と蛍光顕微鏡。このプロトコルでは、二酸化チタンのナノ粒子にさらされる培養細胞 (U2OS) の核マイクロ プローブ分析を実行する方法について説明します。細胞に成長する必要があり、光学顕微鏡で使用される特別に設計されたサンプル ホルダーに直接および核マイクロ プローブ分析段階で公開されます。思い切って凍結サンプルの低温固定細胞組織と元素分布の両方を保持します。同時核マイクロ プローブ分析 (走査型イオン顕微鏡、ラザフォード後方散乱分光法と粒子励起 x 線放射) サンプルに対して細胞密度のローカルの配布に関する情報を提供しますナノ粒子の細胞の内容と同様、化学要素。生物学、特に乗り越えるとをナノ粒子と生体試料間の相互作用の私達の理解を深める必要がありますナノメディシンの新興のコンテキスト内でこのような分析ツールの成長の必要性があります。特に、核マイクロ プローブ分析ナノ粒子ラベルを必要としない、ナノ粒子組成、表面の状態とは関係なく、細胞集団の個々 のセル レベルまで定量。

細胞培養と蛍光に分類されたティオの蛍光イメージング2NPs
マルチ モーダル分析と同様、細胞培養、細胞処理に適したサンプル ホルダーを考案しました。具体的には、ホルダーがよく原子マイクロ プローブ分析法とイメージング ルーチンの光学顕微鏡検査を許可することが重要だった。このサンプル ホルダーは、ピーク フレーム上に堆積 2 μ m 厚のポリカーボネート製箔に基づいています。セルがポリカーボネート、数日間培養条件の上に直接成長させたし、NPs 露出など、さまざまな実験的設定の使用します。
(TRITC) fluorophores が付いている化学的表面改質は、生活またはパラホルムアルデヒド固定蛍光顕微鏡を用いた細...

我々 は元素存在原体外数量化と同様に、人間の細胞を検出するための手順について説明します。メソッドは、任意のセル型に適してし、単一細胞の in vitro金属酸化物ナノ粒子曝露における定量的化学分析に特に役立ちます。

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

ナノ粒子はその独自の物理化学的特性から、産業および医療分野での利用がますます拡大しています。しかし、ナノ粒子への長期的な曝露に伴う人体への健康への懸念は依然として存在します。これらのリスクは、細胞内におけるナノ粒子の挙動および、ナノ粒子によって誘導される細胞の代謝応答を研究することで定量化できます。これは、単一細胞内に取り込まれたナノ粒子の検出および定量化を可能にする手法が不足していることに一部起因しています。顕微鏡法や質量分析法を含む数多くの分析ツールを用いてナノ粒子の細胞内取り込み量を推定できますが、これらは顕微鏡レベルでの定性的な情報しか提供しません。対照的に、原子分光法に基づくin situ法は、試料調製から生じるイメージングアーティファクトの量を減らし、ナノ粒子の直接的な観察を可能にします。これを活用するため、ナノ粒子を天然状態または蛍光タグを付けた状態で研究できる相関アプローチを提案します。ここでは、蛍光顕微鏡法と核マイクロプローブ分析の組み合わせに基づいた手法について説明します。これにより、細胞密度、化学元素の空間分布、および細胞あたりのナノ粒子量の画像を得ることが可能になります。デモンストレーションとして、二酸化チタンナノ粒子に24時間曝露させた細胞について、蛍光顕微鏡観察と核マイクロプローブ分析の両方を用いて研究します。このプロトコルでは、ポリマーPEEK製のカスタムサンプルホルダーが必要です。このホルダーは、細胞培養およびin vitro観察に適している必要があります。ホルダーを厚さ2 µmのポリカーボネートフィルムで覆います。ポリカーボネートフィルムは、薄いFormvar溶液の層を用いてPEEKディッシュに接着させます。装着後、サンプルホルダーを滅菌する必要があります。滅菌済みのサンプルホルダーを複数、使用するまで滅菌済みの12ウェルプレートに1ウェルあたり1つずつ保存しておくことができます。matrix row GFPプラスミドをトランスフェクションした細胞を蛍光顕微鏡で観察し、トランスフェクションが正常に行われ、蛍光タンパク質が発現していることを確認します。トリプシンを用いて細胞を回収し、37 °Cで3分間インキュベートします。新鮮な培地を加えてトリプシンの作用を停止させます。4°C、1200 rpmで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を除去し、適切な量の新鮮な培地を加えます。細胞数を計測し、恒温状態で保持した新鮮な完全培地を用いて希釈を行い、1 µLあたり500個の細胞懸濁液を調製します。ポリカーボネートフィルムの中央に40 µLの液滴を滴下します。サンプルを注意深く細胞インキュベーターに入れ、2時間静置します。新鮮な培地を2 mL緩やかに加え、24時間静置します。in vitroでナノ粒子の検出、追跡、および局在化を行うため、蛍光修飾チタン酸化物ナノ粒子を設計・合成し、汎用的な蛍光色素でグラフト化しました。このステップでは、超純水を用いて濃度1 mg/mLの二酸化チタンナノ粒子懸濁液をあらかじめ調製しておく必要があります。室温で1分間の強力な超音波処理パルスを用いて、ナノ粒子を分散させます。ナノ粒子を適切な培養液で希釈し、1平方センチメートルあたり4マイクログラムの曝露懸濁液を調製します。前述の細胞培養液をこの新しいナノ粒子含有培地に交換し、ナノ粒子が均一に分布するように穏やかに混合します。二酸化チタンナノ粒子を添加せずに、同様の手順でコントロール細胞群を準備します。細胞集団を24時間インキュベートします。これらのサンプルは、パラホルムアルデヒドを用いて固定し、蛍光顕微鏡によるin situおよびシングルセルイメージングに供することが可能です。しかしながら、凍結物理固定は細胞の超微細構造と生化学的な完全性を保持します。プランジ凍結固定は、ミリ秒単位で細胞活性を急速に停止させ、固定剤の使用を回避することができます。細胞を凍結固定するために、以下の手順を行います。アルミニウム製トランスファープレートを液体窒素で冷却して準備します。プレートを液体窒素で満たしたボックスに入れ、プレート表面が液体の上で冷たい窒素蒸気にさらされるように保持します。十分な量の2-methylbutaneを-150°Cまで冷却します。培地を入れた50 mLのFalconチューブを1本と、超純水を入れたFalconチューブを2本用意します。凍結前にサンプルを乾燥させるため、吸水紙を近くに準備しておきます。細胞を培地で1回、その後、滅菌済みの超純水でさらに2回洗浄し、培地に残留している過剰な塩類を除去します。吸収紙でサンプルの水分を速やかに拭き取ります。冷却した2-methylbutaneに細胞を30秒間プランジ凍結させ、冷却したアルミニウム転写プレート上に配置します。冷たいプレート表面への水蒸気の凝結を防ぐため、ボックスは可能な限り閉じたままにしておくことが極めて重要です。すべてのサンプルを凍結させた後、以下の方法で凍結乾燥を行い、水分を昇華させます。まず、低圧・低温条件下で12～24時間の一次乾燥を行います。次に、低圧を維持したまま、プレート温度を40 °Cに上げて、少なくとも24時間の二次乾燥工程を行います。クライオ固定後、試料は、塵埃や湿気から保護された無菌かつ乾燥した状態で、室温で数日間保存することが可能です。核マイクロプローブ分析は、フランスのボルドーにあるIfera施設にて実施されました。3.5 megavoltのシングルトロン粒子加速器を用いて、megaelectron voltのエネルギー領域の軽イオンビームを照射します。元素イメージングは、相補的なイオンビーム分析手法を用いてマイクロプローブ・ビームラインで実施されました。使用した手法は、micro-PIXE（粒子誘起X線放出）、STIM（走査透過イオン顕微鏡）、およびmicro-RBS（ラザフォード後方散乱分光法）です。試料を分析チャンバー内に配置し、真空状態で異なる粒子を照射することで、各種イオンビーム分析を行います。STIMは、密度の異なる細胞領域を通過するエネルギー粒子の散乱に基づき、細胞の空中密度マップを記録するために使用されます。Micro-PIXEおよびmicro-RBS分析により、単一細胞レベルでの化学元素の空間分布と定量化が可能になります。1.5 megaelectron voltの陽子マイクロビームを直径約1 micrometerまで集光させ、STIMによって特定された目的の細胞にわたって走査します。ナトリウムからチタンまでのサンプル中に存在する原子から放出されるX線により、元素濃度の決定が可能になります。X線強度を正規化するために必要な入射粒子の総数を測定するため、後方散乱陽子が収集されます。X線検出器の応答を校正し、元素濃度を定量化するためには、認証標準物質を用いることが極めて重要です。イオンビームデータを解析するため、ImageJ用の新しいプラグインを開発しました。まず、STIM密度マップを算出しました。走査透過イオン顕微鏡画像のコントラストは、局所的な密度の差によるものであり、これにより核や細胞質などの細胞構造を検出することが可能になります。複数のマップを一度に処理することが可能です。各マップは、入射粒子から伝達された平均エネルギーに対応しています。データ解析の第2ステップでは、個々の細胞スペクトルの算出を行います。粒子線誘起X線放出分析により、試料の化学組成と化学元素の元素マップの両方を得ることができます。化学元素マップは、記録時のビーム位置に従って光子を分類し、特定の元素を中心としたエネルギーウィンドウを選択することで算出されます。マップは通常、ビーム位置で検出されたイベント数を示し、定量的なデータが含まれます。選択した各元素について、化学マップのスタックを算出します。各細胞の関心領域は、リンのPIXEデータを用いて特定します。その後、各細胞の関心領域内の個々のスペクトルを合算することにより、細胞全体のスペクトルを算出します。ここから、専用のPIXEおよびIBS解析ソフトウェアを用いて、各細胞内の化学組成に関する定量データを抽出できます。ここでは、パラホルムアルデヒド固定後の細胞の蛍光画像を示します。上段は二酸化チタンナノ粒子に曝露させていない細胞を、下段は曝露させた細胞を示しています。青色チャンネルは細胞核を、緑色チャンネルはミトコンドリアを、赤色チャンネルはチタンを示しています。対照群には二酸化チタンが存在しないことが明確に見て取れます。右側のマージチャンネルからは、ナノ粒子が細胞質にのみ存在し、ミトコンドリアからは排除されていることがわかります。しかしながら、この手法に欠けているのは、ナノ粒子濃度に関する定量的な情報です。核マイクロプローブ分析によって、この情報の提供が期待できます。これらの画像はすべて、さまざまなマイクロプローブ分析手法を用いて撮影されたものです。同様に、上段はコントロール細胞を、下段はチタンナノ粒子を含む細胞を示しています。一番左の画像は、極低温固定された細胞の密度をSTIMで測定した結果です。続く3つのパネルは、PIXEによって得られた細胞内に存在するカリウム、リン、およびチタンの存在量を示しています。同様に、コントロールおよび細胞核においてチタンは検出されませんでした。チタンの取り込み量を細胞ごとに定量化するため、右端のパネルに示されている細胞境界に基づいて関心領域（ROI）を定義し、これらの領域における元素含有量を測定しました。これらのPIXE測定に基づき、コントロール群および曝露群における単一細胞レベルでの元素含有量の分布をプロットしました。対照群を白で、曝露群を黄色でプロットしています。ここでのチタン含有量の中央値は、曝露用量の4 µg/cm²と比較してかなり低くなっています。チタンの取り込み範囲は、0.2 µg/cm²から1.8 µg/cm²まで、個体群間で大きなばらつきが見られます。また、ナノ粒子に曝露したサンプルにおいて、カリウムやカルシウムなどの遊離細胞内イオンの増加が認められ、二酸化チタンナノ粒子の存在によって細胞のホメオスタシスが変化したことが示唆されました。核マイクロプローブ分析は、サブ細胞レベルでの有用な情報を提供し、生物学的サンプルを構成する化学元素の定量化を可能にします。これらの手法には多くの利点があります。1つ目は、化学固定を必要としない試料調製であること。2つ目は、より広い領域を観察でき、かつ追加の関心領域に焦点を合わせられる可能性があること。3つ目は、1gあたり数µgの感度で化学元素を定量できることである。そして4つ目は、核、核小体、細胞質などの細胞内コンパートメントの同定です。単一細胞におけるナノ粒子の取り込みを研究する場合、これらを正確に判定することは、定量的なナノ粒子毒性学にとって不可欠です。本研究で検討した事例で示されているように、個々の細胞内のナノ粒子を観察および定量できる能力により、金属酸化物ナノ粒子などの内因性および外因性化学元素の蓄積値をより深く理解することが可能になります。本プロトコルでは、ナノ粒子と生細胞との相互作用に関する今後の研究において、核マイクロプローブ分析が適していることを強調します。この定量的なアプローチにより、未修飾および化学修飾されたナノ粒子の両方について、検出、同定、局在化、および定量化の観点から、単一細胞レベルでのナノ粒子の影響に関する情報を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶ金属酸化物ナノ粒子の単細胞定量法。蛍光顕微鏡と核マイクロプローブ分析を組み合わせ、ヒト細胞内のナノ粒子をその場で検出し、化学元素の空間分布と定量的な取り込み量を測定する革新的アプローチです。

その場で検出および核マイクロプローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

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