ラット脳組織の疎水性組織除去法

ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/ NコントロールおよびHIV-1トランスジェニックラットについて検証されている。

この透明化技術の全体的な目標は、ラットの脳の組織透明化方法を確立することです。このプロトコルは、HIV-1トランスジェニックラットにも使用できます。この技術の主な利点は、ラットの脳組織を無傷のままにしてクリアリングできるため、完全な回路レベルの分析が可能になることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の候補者であるKristin Kirchnerと、私の研究室の研究員であるHailong Liです。3〜6週齢のラットで経心灌流を行った後、鉗子を使用して頭蓋骨から脳を取り出します。次に、矢状位置に置き、かみそりの刃とラットの脳マトリックスを使用して、幅3ミリメートルの4つの等しいセクションにスライスします。

各セクションを4%PFAで密閉された5ミリリットルのプラスチックチューブに、摂氏4度のシェーカーで一晩固定します。翌日、室温で1時間固定を続けます。各セクションをPBSで3回、1回の洗浄で約30分間洗浄します。

洗浄した切片を20、40、60、80、および100%メタノール溶液でそれぞれ1時間連続インキュベートします。100%メタノールで脱水を繰り返します。次に、サンプルを100%メタノールで摂氏4度で10分間冷却します。

66%DCMと33%メタノールを含む溶液を調製し、この溶液中の冷却切片を室温で一晩振とうしながらインキュベートします。翌日、サンプルをメタノールで30分間2回洗浄し、100%メタノールで摂氏4度で10分間冷却します。漂白するには、サンプルをメタノール中の新鮮な5%過酸化水素に入れ、摂氏4度で一晩インキュベートします。

一晩インキュベーションした後、サンプルを80%、60、40、および20%メタノール溶液に室温でそれぞれ1時間連続インキュベートします。次に、サンプルをPBSで1時間インキュベートし、溶液中で2回、1回の洗浄で1時間1回洗浄します。1ミリリットルの注射器に2.5マイクロリットルの1パーセントビオチン-CTBを入れ、20秒かけて側坐核部位にゆっくりと注入します。

針先を1分間そのままにし、漏れを防ぐために10秒かけてゆっくりと取り外します。サンプルを溶液3でインキュベートし、次に溶液4でそれぞれ2日間、摂氏37度のウォーターバスでインキュベートします。その後、一次抗体を添加し、7日間インキュベーションを続けます。

サンプルを溶液2で1回の洗浄につき1時間5回洗浄し、溶液2に室温で一晩保存します。サンプルを二次抗体と共生し、摂氏37度のウォーターバスで7日間インキュベートします。最後に、1回の洗浄につき1時間、溶液2で5回洗浄し、室温で2溶液に一晩、暗い場所で保管します。

サンプルを20、40、60、80、および100%メタノールで室温でそれぞれ1時間連続してインキュベートします。その後、新鮮な100%メタノールで一晩インキュベートします。翌日、新たに調製した66%DCM、33%メタノール溶液でサンプルを室温で3時間インキュベートします。

3時間後、サンプルが透明になるまで振とうせずにジベンジルエーテルでインキュベートします。その後、イメージングするまでジベンジルエーテルに保存します。3Dプリンターのチャンバーを入手し、エポキシを使用して顕微鏡スライドに固定します。

チャンバー中央の正方形のスペースにサンプルを置き、チャンバー内にジベンジルエーテルを完全に充填します。厚さ0.17mmのカバースリップをチャンバーにかぶせ、圧力を加えてチャンバーの壁に完全に接触するようにします。次に、エポキシを使用してエッジをシールします。

気泡が充填入口から逃げるように、チャンバーを回転させてください。チャンバーに追加のジベンジルエーテルを充填します。次に、充填入口をエポキシで密封し、硬化させます。

共焦点顕微鏡システムを使用して標本を観察し、4倍の倍率でz-スキャンを実行します。疎水性に透明化された組織サンプルを4倍倍に拡大した共焦点像は、黒質領域に密集したTH染色、黒質に隣接するまばらなTHニューロン、およびTHニューロンを欠く組織の暗い黒色の領域を示しています。20倍の拡大でTH陽性ニューロンの典型的な形態は、大きな体細胞といくつかの分岐プロセスを持っています。

一方、IBA1で染色されたミクログリアは、細胞体が小さく、延長プロセスが短いです。理想的な共焦点像は、黒質領域における正の高密度TH染色を示し、適切な蛍光ゲインを示します。共焦点画像が不十分な例としては、蛍光利得が大きすぎる不適切な焦点の画像、組織の他の部分と焦点が合っていない明るいスポットによる偽陽性染色、二次抗体と一致しないブロッキング血清を使用した結果としてバックグラウンド染色が高くなるなどがあります。

ラットの脳におけるCTB陽性染色がここに示されている。細長い線維は、ドーパミン作動性経路に沿った求心性突起です。THとCTBの共局在化により、側坐核領域の注入部位を、蛍光が密集した緑色の円として可視化することが可能になります。

ここでは、黒質におけるTHとCTBの共局在を示します。この手順を試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、サンプルがすべての抗体溶液でインキュベートするのに十分な時間を確保し、イメージング前に完全にクリアするのに十分な時間を確保することです。サンプルは、サンプルを損傷するため、空気への曝露を制限する必要があります。

この手法は非常に汎用性が高く、脳のさまざまな領域で関心のある多くの異なるタンパク質を調査するために使用できます。本技術は、神経科学者がラットの脳を回路レベルで調査する道を開くのに役立ち、これはシステム全体としての脳の研究に不可欠です。