新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法

この手順の全体的な目標は、哺乳類の血液脳関門の分子特性を理解することを目的とした生化学的研究のために、ラットの脳から脳の微小血管を分離することです。この方法は、健康や疾患におけるタイトジャンクションタンパク質や内因性トランスポーターの調節、局在化、発現など、血液脳関門生理学や神経薬理学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、個々の動物間のタンパク質発現の自然な変動性を考慮しながら、個々の動物から十分な数の高品質の微小血管を分離できることです。

この手法を実演するのは、私の研究室の優秀な学部生であるビアンカ・ライリーです。テキストプロトコルに従ってSprague-Dawleyラットを安楽死させ、首を切った後、外科用ハサミを使用して、横方向の切り傷を1回作成してラットの頭蓋骨から皮膚を切除します。ロンゲールを使用して、頭蓋骨プレートを慎重に取り外し、脳を露出させます。

次に、へらで臓器を取り除きます。大脳を剥離し、分離された脳組織を5ミリリットルのBMBと5.0マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50ミリリットルの円錐管に入れます。組織を処理するには、清潔なペトリ皿に移します。

次に、鉗子を使用して、直径12.5cmの濾紙で脳をそっと転がし、大脳皮質にゆるく付着している外側の髄膜を取り除きます。このステップでは、脳組織標本からすべての髄膜組織が除去されていることを確認するように注意する必要があります。髄膜は、脳組織から簡単に引き離すことができる透明な膜組織として視覚化できます。

脳組織を濾紙にそっと押し付け、このステップで濾紙を頻繁に回しながら、組織を再度転がします。次に、鉗子を使用して、脈絡叢を大脳半球から分離します。次に、脳組織を再び穏やかに平らにし、鉗子を使用して白質に隣接する嗅球を取り除きます。

皮質脳組織を冷やしたガラス乳鉢に入れます。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むBMBを5ミリリットル追加します。オーバーヘッドパワーホモジナイザーを使用して、乳棒を乳鉢に挿入し、3, 700rpmで15回の上下ストロークを使用して脳組織を均質化します。

次に、ホモジネートを標識された遠心分離チューブに注ぎます。サンプル間で、70%エタノールを使用して乳棒を洗浄します。遠心分離を行うには、脳ホモジネートを含む各標識遠心チューブに8.0ミリリットルの26%デキストラン溶液を加えます。

チューブを2回反転させてから、サンプルを完全にボルテックスします。複数の角度を使用して各サンプルのボルテックスを行い、脳のホモジネート溶液と26%デキストラン溶液が完全に混合されるようにします。サンプルを5, 000 g、摂氏4度で15分間遠心分離します。

上清を吸引し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む5.0ミリリットルのBMBにペレットを再懸濁します。.次に、ペレットをボルテックスして、完全に混合します。次に、各遠心分離管に8.0ミリリットルの26%デキストランを加え、先ほど示したようにボルテックスします。

その後、サンプルを再度遠心分離します。真空フラスコとガラスピペットを使用して、上清を吸引し、脳の微小血管を含むペレットが破壊されないようにします。ペレットをプロテアーゼ阻害剤を使用してBMBに再懸濁し、次に26%デキストランをさらに2回懸濁します。

最終遠心分離後、各ペレットとボルテックスに5.0ミリリットルのBMBを加えて、サンプルを再懸濁します。このビデオで示したプロトコルを使用して、ラットの脳から無傷の微小血管を成功裏に分離しました。この画像では、脳の微小血管内皮細胞の原形質膜で高発現するトランスポーターであるOatp1a4に対する抗体を用いて微小血管を染色しています。

ウェスタンブロットで示されたように、雌のSprague-Dawleyラットから採取した微小血管からの膜調製物は、脳微小血管系のマーカータンパク質であるPECAM-1(CD31としても知られる)に濃縮されていました。このプロトコールの最適化中に、2 つおよび 4 つのデキストラン遠心分離ステップを使用して調製したメンブレンサンプルで PECAM 濃縮が観察されました。Bradfordタンパク質アッセイによって決定され、この表に記載されているように、メンブレン調製物は通常、5.0ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルから10.0ミリグラム/ミリリットルの範囲のタンパク質濃度をもたらします。

タンパク質値は、BSAを標準として生成された標準曲線に基づいて決定しました。ここに示されているのは、BBB輸送タンパク質Glut1のウェスタンブロットです。この高発現BBBタンパク質について、各メンブレンサンプルで54キロダルトンの明確な単一バンドが検出されました。

このグラフは、雌のラットと比較して、BBBでのGlut1の発現が高いことを示しています。ナトリウム/カリウムATPaseの発現に雄と雌の動物間で差は観察されませんでした。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、2時間から2時間半で行うことができます。

この手順を試行する際は、プロトコル全体を通してすべてのサンプルを氷上に保つこと、および遠心分離ステップ後にマイクロ血管ペレットから上清を吸引する際に注意することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、共免疫沈降分析などの他の方法を微小血管サンプルに対して実行し、血液脳関門での同じタンパク質複合体内の異なるタンパク質の会合など、追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、血液脳関門生理学および神経薬理学の分野の研究者が、健康および神経疾患のげっ歯類モデルにおける血液脳関門の分子特性を調査する道を開きました。

このビデオを見た後、健康と病気における血液脳関門生物学の独自の研究のために、ラットの脳から高品質の微小血管を分離する方法を十分に理解しているはずです。