Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

本手順の全体的な目的は、情報処理中の感覚皮質における細胞型特異的な活動電位のスパイク発生を、記録されたニューロンの形態学的同一性と結びつけることです。これは、まず外科的にラットを準備して細胞体近傍記録（juxtasomal recording）を行うことで達成されます。準備が完了した後、電極を用いて自発的および感覚誘発的なスパイク活動を記録し、電流注入と注入法を用いて、記録したニューロンにbiocidinを充填します。

その後、脳をビオチン染色のために処理します。最終的に、連続切片からビオチンが充填されたニューロンをデジタル再構築し、細胞型の分類を行います。最終的には、個々のニューロンの細胞体近傍記録を行うことで、皮質ネットワーク内の感覚処理と構造情報の研究が可能になります。

この手法は、感覚処理における個々の細胞型や層の役割など、神経科学における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法を必要とする人は、充填操作中にニューロンを死滅させやすいため、習得に苦労します。最適な品質のピペットを準備することで、biocidin充填の成功率は高まりますが、さらに、狭い帯域の電流注入を制御するための熟練した技術も必要となります。

したがって、十分に充填されたニューロンを回収する成功率を高めるには経験が必要です。まず、加熱パッドを備えた脳定位固定装置に、麻酔をかけたWistarラットを配置します。足指揉み反射を確認し、鎮静の深さを検証してください。

次に、適切な体温を維持するために直腸プローブを挿入します。動物の頭部を固定し、手術部位の除毛を行います。また、乾燥を防ぐために眼に軟膏を塗布します。

手術部位にリドカインを注入した後、3〜5分間待ち、頭蓋骨表面を覆っている皮膚を除去します。次に、残っている組織を取り除き、0.9%塩化ナトリウム溶液で頭蓋骨を十分に洗浄します。左半球の一次体性感覚野の座標を決定し、外科用スキンマーカーペンで頭蓋骨上の位置をマークします。

歯科用ドリルを使用して、目的領域の骨を削り取ります。骨が透明になり、血管がはっきりと見えるまで削り取りを続けてください。次に、メスを用いて、薄くなった頭蓋骨に小さな窓を開けます。

硬膜や血管を損傷しないように注意します。外科用皮膚マーカーペンを用いて、開頭部位の端を標記します。視認性を高めるため、乾燥した頭蓋骨にスーパーグルーを薄く塗布し、続いて歯科用セメントを用いてバスを構築します。

開頭処置を終える際、視認性を高めるために、対側にあるウィスカー（ひげ）を正確に5 mmにトリミングします。記録を開始する前に、トリミングしたウィスカーに黒のマスカラを塗って強調します。ホウケイ酸ガラスを用いてパッチピペットを作製してください。理想的なピペットの形態は、緩やかに細くなるテーパー、低いコーン角、および約1 µmの内径を持つチップです。

パッチピペットに2%ビオチンを添加した通常ラットリンガー液を充填し、ヘッドステージに固定されマイクロマニピュレーターに接続されたピペットホルダーにパッチピペットを取り付けます。ラットS1のD2カラムを特異的にターゲットにするため、電極ホルダーの角度を正中面に対して34度に設定します。次に、パッチピペットを開頭部位の近傍に配置します。

バスに0.9%塩化ナトリウムを満たします。アンプをブリッジモードに設定し、正電流注入による方形パルスを印加して電極抵抗を測定します。最適な電極抵抗は3〜5 MΩの間です。

100から150 millibarの過圧をかけ、方形パルス状の正電流を印加しながら、パッチピペットを1 micronステップで前進させます。硬膜に接触した際に生じる急峻な抵抗変化をモニターしてください。この時点で、正確な深度測定を可能にするため、マイクロマニピュレーターの座標をゼロに設定します。

電極抵抗の急激な低下によって示される硬膜の貫通が確認されるまで、1µmステップモードで前進させます。ピペットの保持圧を解除します。次に、1µmステップで前進しながら、シングルユニットを探索します。

200ミリ秒のオンオフパルスを印加して電極抵抗を継続的にモニタリングします。電極抵抗の上昇は、通常、単一ニューロンへの接近を示します。正方向のアクションポテンシャル波形（約2 mV）が記録されるまで電極を前進させます。オプションとして、自発的なスパイク活動を記録し、ピエゾ電気デバイスを用いて個々のひげを慎重に偏向させ、ひげの刺激によって誘発されるスパイク活動を特定することで、細胞体近傍充填に最適な条件を得ます。

抵抗値が25〜35 MΩになり、スパイクの振幅が3〜8 mVになるまで電極を前進させ、細胞体近傍への充填（juxtasomal filling）を開始します。1 nAから始めて正方波の正電流パルスを印加します。

APの波形と頻度をモニターしながら、電流を0.1 nano amps刻みでゆっくりと段階的に増加させます。ブロックパルスのオンフェーズ中にAP頻度が明らかに増加したことを膜の開口としてモニターします。充填中のスパイク波形において、幅の増大と後超分極の減少が見られる場合は、安定したビオチン注入を維持するために充填中の電流を増減させてください。AP頻度が急激に増加した場合は、電流パルスを減少させるか停止してください。これは、ナトリウムイオンなどの細胞外イオンの過剰な流入による毒性を避けるためです。

すべてのニューロンは充填の手順に対して異なる反応を示すことに注意してください。そのため、細胞体近傍標識（juxtasomal labeling）のパラメータは、記録条件に応じて調整する必要があります。電流注入を停止した後の信号を注意深く監視してください。

充填後のスパイク波形は通常、幅が広くなり、後超分極が著しく減少します。ニューロンが回復し、スパイク波形が元の特性に戻るまで待機することで、細胞への機械的なストレスを軽減します。スパイク振幅が減少するまで、パッチピペットを1 µmずつ段階的に引き抜きます。動物の体温と呼吸を注意深く監視しながら、ビオチンが細胞内に拡散するまで少なくとも1時間待ちます。最後に、脳サンプルを採取および処理し、細胞体近傍のラベル化の品質を確認します。

これらの画像は、一次体性感覚皮質における細胞体周囲充填（juxtasomatic filling）されたニューロンを示しています。この頂頂葉ニューロンの接線方向からの像は、樹状突起と軸索のサイズの差を示しています。この細胞体周囲標識ニューロンのデジタル再構築画像では、ニューロンの投影像が高解像度かつ低倍率で示されており、自動デジタル再構築による軸索が青色で、樹状突起が赤色でそれぞれ重ね合わせて表示されています。

ここでは、軸索の全長にわたって軸索ボタンを表示するために、ボックス領域を拡大しています。この最後のアニメーションでは、ラット一次体性感覚皮質の第5層にある厚いタフトを持つパラメタールニューロン1つの再構築パイプラインを例示します。このパイプラインには、100倍の倍率での樹状突起および軸索形態の再構築と、4倍の倍率でのバレル輪郭の再構築が含まれます。

その結果、完全な3D再構築が可能となり、その後、標準化された参照フレームにレジストレーションすることで、形態学的特性の定量解析が行えます。したがって、生体内での細胞体近傍ラベリング（juxta somal labeling）により、極めて質の高いラベリングが可能となり、完全な3D形態の信頼性の高い再構築が実現します。本研究では、ウレタン麻酔下にある動物を用いてこの手法を実証しました。

しかしながら、Jux Somal記録は、覚醒状態で頭部を固定した動物でも使用可能であり、環境の能動的な探索中における個々の細胞型や層の役割を研究することができます。このビデオを視聴することで、事後の同定および形態学的再構築のために、個々のニューロンに対してBiocidin標識を行う方法について、より深く理解できるはずです。