Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

この手順の全体的な目標は、情報処理中に感覚皮質で発生する細胞型特異的な活動電位の急上昇を、記録されたニューロンの形態学的同一性に関連付けることです。これは、最初にラットを外科的に傍性ソマ録音の準備することによって達成されます。調製が完了すると、電極は自発的および感覚的に誘発されるスパイク活動を記録し、記録されたニューロンは電流と注射を使用して殺生物剤を充填されます。

その後、脳はビオチン染色のために処理されます。最後に、ビオチンを充填したニューロンは、細胞タイプ分類のために後続のセクションからデジタルで再構築されます。最終的に、個々のニューロンの並行体記録により、皮質ネットワーク内の感覚処理と構造情報の研究が可能になります。

この方法は、感覚処理中の個々の細胞タイプと層の役割など、神経科学の重要な質問に答えるのに役立ちます。一般的に、この方法は、充填手順中にニューロンを殺すのが非常に簡単であるため、個人が必要とするのは苦労します。最適な品質のピペットを調製することで、バイオシジンの充填が成功する可能性が高まり、さらに、狭帯域の電流注入を制御するために訓練された目が必要です。

したがって、十分に満たされたニューロンを回復する成功率を上げるには経験が必要です。まず、麻酔をかけたウィスターラットを、加熱パッドを備えた脳定位固定装置フレームに置きます。つま先のピンチ反射をテストして、鎮静の深さを確認します。

次に、正しい体温を維持するために直腸プローブを挿入します。動物の頭を固定し、手術部位から毛を取り除きます。乾燥を防ぐために目に軟膏を塗ります。

手術部位でリドカインを注射した後、3〜5分待ってから、頭蓋骨の表面を覆っている皮膚を取り除きます。.次に、残っている組織を取り除き、0.9%塩化ナトリウムライドで頭蓋骨を広範囲に洗浄します。左半球の一次体性感覚皮質の座標を決定し、外科用皮膚マーカーペンで頭蓋骨上の位置に印を付けます。

デンタルドリルを使用して、関心のある領域から骨をこすり落とします。骨が透明になり、血管がはっきりと見えるようになるまで、骨を削り続けます。次に、メスで細い頭蓋骨に小さな窓を切り込みます。

硬膜や血管を傷つけないように注意してください。外科用皮膚マーカーペンを使用して開頭術の端に印を付けます。視認性を向上させるには、乾燥した頭蓋骨に瞬間接着剤を薄く塗り、次に歯科用セメントを塗ってお風呂を作ります。

開頭術を閉じるときは、反対側のひげを正確に5ミリメートルにトリミングして、視認性を高めます。録音を開始する前に、ブラックマスカラでトリミングされたひげを強調し、ボロシリシックガラスからパッチピペットを作ります。理想的なピペットの形態は、緩やかな細いテーパー、低いコーン角、および約1ミクロンの内端直径です。

パッチピペットに通常のradリンガーをセットし、2%ビオチンを添加し、パッチピペットをピペットホルダーに取り付け、ヘッドステージに固定し、マイクロメートルマニピュレーターに接続します。ラットSのDの2列を具体的に狙うには、電極ホルダーの角度を矢状面に対して34度に設定します。次に、パッチピペットを開頭術に近接して配置します。

0.9%塩化ナトリウムで浴槽を満たします。アンプをブリッジモードにして、正の電流を注入した方形パルスを印加して、電極抵抗を決定します。最適な電極抵抗は3〜5メガの間にあります。

100〜150ミリバールの過圧を確立し、パッチピペットを1ミクロンステップで進め、矩形パルスの形で正電流を流します。硬膜との接触を確立したときの堅牢な抵抗変化を監視します。この時点で、マイクロマニピュレータの座標をゼロに設定して、正確な深度測定を可能にします。

パッチピペットが電極抵抗の突然の低下によって示される硬膜を貫通するまで、1ミクロンステップモードで前進します。ピペットの保持圧力を取り外します。次に、1ミクロン単位で進みながら1台のユニットを探します。

200ミリ秒のオンオフパルスを印加して電極抵抗を連続的に監視し、電極抵抗の増加は、通常、単一のニューロンの近接性が正の進行作用まで電極を前進させることを示します。約2ミリボルトの電位波形が記録されます。オプションで、自発的なスパイク活動を記録し、ピゾ電気デバイスを使用して個々のウィスカをこっそり偏向させることにより、ウィスカーの取り消されたスパイク活動を決定し、juxta somal充填の最適な条件を取得します。

抵抗が25〜35になるまで電極を進めます。メガオームとスパイクは、ジュクスタソム充填を開始するために3〜8ミリボルトの振幅を持っています。1ナノアンペアから始まる正の方形電流パルスを印加します。

APの波形と周波数を監視しながら、0.1ナノアンペアのステップで電流をゆっくりと徐々に増やします。ブロックパルスのオンフェーズ中にAP周波数の明らかな増加として膜の開口部を監視し、充填中のスパイク波形は幅が増加し、過分極後に減少し、安定したビオチン注入を維持するために充填中に電流を増加または減少させ、AP周波数の突然の増加時に電流パルスを減少または停止します。ナトリウムイオンなどの細胞外イオンの過剰流入による毒性を回避するため。

すべてのニューロンが充填手順に対して異なる反応を示すことに注意することが重要です。したがって、juxta somal ラベリング パラメータは、記録条件に応じて調整する必要があります。電流注入を停止した後は、信号を綿密に監視します。

充填セッション後のスパイク波形は通常、広がり、ニューロンの回復を待つ過分極後に強く減少し、スパイク波形が元の特性に戻り、細胞への機械的ストレスを軽減するときに明らかになります。スパイク振幅が減少するまでパッチピペットを1ミクロン刻みで引っ込め、ビオチンが細胞内に拡散するまで少なくとも1時間待ち、動物の体温と呼吸を注意深く監視します。最後に、脳サンプルが取得および処理され、juxta somal標識の品質が明らかになります。

これらの画像は、一次体性感覚皮質の並行性で満たされたニューロンの画像を示しています。このパラメタルニューロンの接線方向図は、樹状突起と軸索のサイズの違いを示しています。この並行ソマリア標識ニューロンのデジタル再構成では、ニューロン投影画像が高解像度で低倍率で示され、自動デジタル再構成が軸索を青、樹状突起を赤でそれぞれ重ねて表示されます。

ここでは、ボックス領域が拡張され、軸索の長さ全体に軸索ブートンが表示されます。この最終的なアニメーションでは、ラットの一次体性感覚皮質からの1つの層5の厚さの房状のパラメタルニューロンの再構築パイプラインを例示しています。このパイプラインは、樹枝状および軸索の形態を100倍の倍率で、バレルの等高線を4倍の倍率で再構築することを伴います。

その結果、完全な3D再構成が行われ、その後、標準化された参照フレームに登録されて、形態学的特性の定量的分析が行われます。したがって、in vivoでのjuxta somal標識は、完全な3D形態の信頼性の高い再構成のための優れた標識品質を可能にします。ここでは、ウレタン麻酔動物での方法を示しました。

しかし、Jux Somalの録音は、覚醒状態の頭を拘束された動物でも使用して、環境の活発な探索中に個々の細胞タイプや層の役割を研究することができます。このビデオを見れば、戦後の同定と形態学的再構築のために、個々のニューロンにBiocidin標識を行う方法について、より深く理解できるはずです。