発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば クリプトコッカス・ネオフォルマン)の両方のタンパク質の存在量の変化を測定する。

私たちのプロトコルは、宿主と病原体の両方の観点から真菌感染症を調査し、病気にとって重要な生物学的システム間の相互作用を特定します。1回の実験で真菌タンパク質と宿主タンパク質の両方を検出し、感染時にのみ生成される真菌タンパク質、つまり新規感染関連タンパク質を同定できます。私たちは、治療のための新しい抗毒性戦略を明らかにすることにより、真菌感染症の治療に焦点を当てていますが、私たちのプロテオミクスとバイオインフォマティクスのパイプラインは普遍的であり、多くの生物学的システムに適用できる可能性があります。

私たちのアプローチは、さまざまな病原体と多数の免疫応答の研究の基礎を築き、クリプトコッカスと自然免疫系との関係に関する新たな洞察を提供するために使用できます。病原体に対するマクロファージの応答と、十分な真菌タンパク質の検出は重要です。したがって、各種のMOIと時点をテストして最適化することをお勧めします。

マクロファージと真菌細胞の培養は困難な場合があるため、共培養後に何を期待すべきかを知ることが重要です。視覚化により、研究者は手順の実装に自信を持つことができます。マクロファージ感染用の真菌細胞を調製するには、中長相培養からC neoformans細胞を採取して遠心分離し、続いて同じ遠心分離条件下で1ミリリットルの室温PBSで3回穏やかに洗浄します。

最後の洗浄後、真菌細胞を抗生物質を含まない細胞培養、中濃度の1ミリリットルあたり1.2倍10〜8番目の細胞で再懸濁し、70%〜80%コンフルエントの6ウェルマクロファージ培養プレートの4つのウェルのそれぞれに1ミリリットルの真菌細胞懸濁液を添加します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに3時間置きます。プレートを慎重に傾けて、各ウェルを1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで3回優しく洗浄できるようにします。

最後の洗浄後の感染能力を測定するには、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの抗生物質を含まない培地を追加し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。適切な実験時点で、各ウェルから上清を収集し、標準プロトコルに従って各ウェルのLDH量を測定します。同時に、感染していないマクロファージ細胞を溶解して、最大の細胞毒性の値を決定します。

その後、細胞毒性は、示されている式を使用して計算できます。未感染のマクロファージの収集と共培養のためには、未感染のマクロファージの各ウェルに1ミリリットルの冷たいPBSを添加します。1分後、プレートを軽くたたいてウェルの底から細胞を剥がし、細胞懸濁液を1本の15ミリリットルチューブにプールします。

遠心分離によって細胞を回収し、上清を完全に除去して、ペレットを液体窒素ですぐに瞬間凍結し、マイナス80度で保存できるようにします。データセットへのプロセスの主成分分析により、予想通り、データ間の分離の最大の要素は感染したサンプルと感染していないサンプルであることが明らかになりました。サンプルの2つ目の際立った特徴は、その生物学的多様性です。

ピアソン相関とユークリッド距離による階層クラスタリングを組み合わせると、感染サンプルと非感染サンプルの明確なクラスタリングが示され、再現再現性は95%から96%の範囲ですBenjamini-Hochberg False Discovery Rateを使用して複数の仮説検定を補正したStudents'Tテストは、非感染対照と比較して感染中の存在量に有意差があるタンパク質を特定するために実行できます。この解析では、感染時に発現に有意な変化を示す117の宿主タンパク質が同定されました。特に、感染中に予想されるように、真菌タンパク質の存在量の大幅な増加も観察されました。

マクロファージは、共培養、洗浄、サンプル採取の際に優しく取り扱うことが重要です。病原体が宿主にどのように適応し、宿主が感染からどのように防御するかを定義することで、微生物学と免疫学の分野に新たな知見がもたらされます。