発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー
October 20th, 2020
ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば クリプトコッカス・ネオフォルマン)の両方のタンパク質の存在量の変化を測定する。
私たちのプロトコルは、宿主と病原体の両方の観点から真菌感染症を調査し、病気にとって重要な生物学的システム間の相互作用を特定します。1回の実験で真菌タンパク質と宿主タンパク質の両方を検出し、感染時にのみ生成される真菌タンパク質、つまり新規感染関連タンパク質を同定できます。私たちは、治療のための新しい抗毒性戦略を明らかにすることにより、真菌感染症の治療に焦点を当てていますが、私たちのプロテオミクスとバイオインフォマティクスのパイプラインは普遍的であり、多くの生物学的システムに適用できる可能性があります。
私たちのアプローチは、さまざまな病原体と多数の免疫応答の研究の基礎を築き、クリプトコッカスと自然免疫系との関係に関する新たな洞察を提供するために使用できます。病原体に対するマクロファージの応答と、十分な真菌タンパク質の検出は重要です。したがって、各種のMOIと時点をテストして最適化することをお勧めします。
マクロファージと真菌細胞の培養は困難な場合があるため、共培養後に何を期待すべきかを知ることが重要です。視覚化により、研究者は手順の実装に自信を持つことができます。マクロファージ感染用の真菌細胞を調製するには、中長相培養からC neoformans細胞を採取して遠心分離し、続いて同じ遠心分離条件下で1ミリリットルの室温PBSで3回穏やかに洗浄します。
最後の洗浄後、真菌細胞を抗生物質を含まない細胞培養、中濃度の1ミリリットルあたり1.2倍10〜8番目の細胞で再懸濁し、70%〜80%コンフルエントの6ウェルマクロファージ培養プレートの4つのウェルのそれぞれに1ミリリットルの真菌細胞懸濁液を添加します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに3時間置きます。プレートを慎重に傾けて、各ウェルを1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで3回優しく洗浄できるようにします。
最後の洗浄後の感染能力を測定するには、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの抗生物質を含まない培地を追加し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。適切な実験時点で、各ウェルから上清を収集し、標準プロトコルに従って各ウェルのLDH量を測定します。同時に、感染していないマクロファージ細胞を溶解して、最大の細胞毒性の値を決定します。
その後、細胞毒性は、示されている式を使用して計算できます。未感染のマクロファージの収集と共培養のためには、未感染のマクロファージの各ウェルに1ミリリットルの冷たいPBSを添加します。1分後、プレートを軽くたたいてウェルの底から細胞を剥がし、細胞懸濁液を1本の15ミリリットルチューブにプールします。
遠心分離によって細胞を回収し、上清を完全に除去して、ペレットを液体窒素ですぐに瞬間凍結し、マイナス80度で保存できるようにします。データセットへのプロセスの主成分分析により、予想通り、データ間の分離の最大の要素は感染したサンプルと感染していないサンプルであることが明らかになりました。サンプルの2つ目の際立った特徴は、その生物学的多様性です。
ピアソン相関とユークリッド距離による階層クラスタリングを組み合わせると、感染サンプルと非感染サンプルの明確なクラスタリングが示され、再現再現性は95%から96%の範囲ですBenjamini-Hochberg False Discovery Rateを使用して複数の仮説検定を補正したStudents'Tテストは、非感染対照と比較して感染中の存在量に有意差があるタンパク質を特定するために実行できます。この解析では、感染時に発現に有意な変化を示す117の宿主タンパク質が同定されました。特に、感染中に予想されるように、真菌タンパク質の存在量の大幅な増加も観察されました。
マクロファージは、共培養、洗浄、サンプル採取の際に優しく取り扱うことが重要です。病原体が宿主にどのように適応し、宿主が感染からどのように防御するかを定義することで、微生物学と免疫学の分野に新たな知見がもたらされます。
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概要
このプロトコルは、質量分析ベースのプロテオミクスを用いて真菌感染時の宿主と病原体間の相互作用を調査します。1回の実験で宿主と病原体の両方のタンパク質を検出し、感染に関連するタンパク質についての洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 感染症
- プロテオミクス
背景
- 宿主-病原体相互作用の理解は病気研究にとって重要です。
- 真菌感染は重大な健康リスクをもたらし、新しい治療戦略が必要とされます。
- プロテオミクスは感染時のタンパク質量の変化を明らかにすることができます。
- マクロファージは病原体に対する免疫応答において重要な役割を果たします。
研究目的
- 宿主マクロファージと病原体Cryptococcus neoformansの相互作用をプロファイリングすること。
- 真菌感染時に生成される新しい感染関連タンパク質を特定すること。
- 様々な生物学的システムに適用可能な普遍的なプロテオミクスおよびバイオインフォマティクスパイプラインを確立すること。
使用方法
- タンパク質検出のための質量分析ベースのプロテオミクス。
- タンパク質量変化を測定するためのラベルフリー定量。
- 正確な結果を得るための感染多重度（MOI）と時間点の最適化。
- プロテオミクスデータを解釈するためのバイオインフォマティクス分析。
主な結果
- 感染時に特異的に生産される真菌タンパク質の同定。
- Cryptococcus neoformansに対するマクロファージ応答に関する洞察。
- 様々な病原体と免疫応答を研究するためのフレームワークの確立。
- このプロトコルの異なる生物学的システムへの適用性の実証。
結論
- このプロトコルは宿主-病原体相互作用の研究に包括的なアプローチを提供します。
- 真菌感染と免疫応答に関する将来の研究の基礎を築きます。
- 異なる種に対して実験条件のさらなる最適化が推奨されます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
