発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー
2020年10月20日
ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば クリプトコッカス・ネオフォルマン)の両方のタンパク質の存在量の変化を測定する。
私たちのプロトコルは、宿主と病原体の両方の観点から真菌感染症を調査し、病気にとって重要な生物学的システム間の相互作用を特定します。1回の実験で真菌タンパク質と宿主タンパク質の両方を検出し、感染時にのみ生成される真菌タンパク質、つまり新規感染関連タンパク質を同定できます。私たちは、治療のための新しい抗毒性戦略を明らかにすることにより、真菌感染症の治療に焦点を当てていますが、私たちのプロテオミクスとバイオインフォマティクスのパイプラインは普遍的であり、多くの生物学的システムに適用できる可能性があります。
私たちのアプローチは、さまざまな病原体と多数の免疫応答の研究の基礎を築き、クリプトコッカスと自然免疫系との関係に関する新たな洞察を提供するために使用できます。病原体に対するマクロファージの応答と、十分な真菌タンパク質の検出は重要です。したがって、各種のMOIと時点をテストして最適化することをお勧めします。
マクロファージと真菌細胞の培養は困難な場合があるため、共培養後に何を期待すべきかを知ることが重要です。視覚化により、研究者は手順の実装に自信を持つことができます。マクロファージ感染用の真菌細胞を調製するには、中長相培養からC neoformans細胞を採取して遠心分離し、続いて同じ遠心分離条件下で1ミリリットルの室温PBSで3回穏やかに洗浄します。
最後の洗浄後、真菌細胞を抗生物質を含まない細胞培養、中濃度の1ミリリットルあたり1.2倍10〜8番目の細胞で再懸濁し、70%〜80%コンフルエントの6ウェルマクロファージ培養プレートの4つのウェルのそれぞれに1ミリリットルの真菌細胞懸濁液を添加します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに3時間置きます。プレートを慎重に傾けて、各ウェルを1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで3回優しく洗浄できるようにします。
最後の洗浄後の感染能力を測定するには、6ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの抗生物質を含まない培地を追加し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。適切な実験時点で、各ウェルから上清を収集し、標準プロトコルに従って各ウェルのLDH量を測定します。同時に、感染していないマクロファージ細胞を溶解して、最大の細胞毒性の値を決定します。
その後、細胞毒性は、示されている式を使用して計算できます。未感染のマクロファージの収集と共培養のためには、未感染のマクロファージの各ウェルに1ミリリットルの冷たいPBSを添加します。1分後、プレートを軽くたたいてウェルの底から細胞を剥がし、細胞懸濁液を1本の15ミリリットルチューブにプールします。
遠心分離によって細胞を回収し、上清を完全に除去して、ペレットを液体窒素ですぐに瞬間凍結し、マイナス80度で保存できるようにします。データセットへのプロセスの主成分分析により、予想通り、データ間の分離の最大の要素は感染したサンプルと感染していないサンプルであることが明らかになりました。サンプルの2つ目の際立った特徴は、その生物学的多様性です。
ピアソン相関とユークリッド距離による階層クラスタリングを組み合わせると、感染サンプルと非感染サンプルの明確なクラスタリングが示され、再現再現性は95%から96%の範囲ですBenjamini-Hochberg False Discovery Rateを使用して複数の仮説検定を補正したStudents'Tテストは、非感染対照と比較して感染中の存在量に有意差があるタンパク質を特定するために実行できます。この解析では、感染時に発現に有意な変化を示す117の宿主タンパク質が同定されました。特に、感染中に予想されるように、真菌タンパク質の存在量の大幅な増加も観察されました。
マクロファージは、共培養、洗浄、サンプル採取の際に優しく取り扱うことが重要です。病原体が宿主にどのように適応し、宿主が感染からどのように防御するかを定義することで、微生物学と免疫学の分野に新たな知見がもたらされます。
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概要
本プロトコルでは、質量分析ベースのプロテオミクスを用いて、真菌感染における宿主と病原体の相互作用を調査します。これにより、単一の実験で宿主と病原体の両方のタンパク質を検出することが可能となり、感染関連タンパク質に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 感染症
- プロテオミクス
背景
- 宿主と病原体の相互作用を理解することは、疾患研究において極めて重要です。
- 真菌感染症は重大な健康リスクをもたらすため、新たな治療戦略が必要とされています。
- プロテオミクスにより、感染時のタンパク質存在量の変化を明らかにすることができます。
- マクロファージは、病原体に対する免疫応答において重要な役割を果たします。
研究目的
- 宿主のマクロファージと病原体 Cryptococcus neoformans の間の相互作用をプロファイリングすること。
- 真菌感染時に産生される、新たな感染関連タンパク質を同定すること。
- さまざまな生物学的システムに適用可能な、汎用的なプロテオミクスおよびバイオインフォマティクスのパイプラインを確立すること。
使用した手法
- タンパク質検出のための質量分析ベースのプロテオミクス。
- タンパク質発現量の変化を測定するためのラベルフリー定量法。
- 正確な結果を得るための感染多重度（MOI）およびタイムポイントの最適化。
- プロテオームデータを解釈するためのバイオインフォマティクス解析。
主要な結果
- 感染中に特異的に産生される真菌タンパク質の同定。
- Cryptococcus neoformansに対するマクロファージ応答に関する知見。
- さまざまな病原体および免疫応答を研究するための枠組みの構築。
- 異なる生物学的システムに対する本プロトコルの適用可能性の実証。
結論
- 本プロトコールは、宿主と病原体の相互作用を研究するための包括的なアプローチを提供します。
- 本手法は、真菌感染症および免疫応答に関する今後の研究の基礎を築くものです。
- 異なる種を用いる場合は、実験条件のさらなる最適化が推奨されます。
よくある質問
業界における重要性
このラベルフリー定量プロテオミクスワークフローにより、感染中の宿主および病原体のプロテオームを同時にプロファイリングすることが可能となり、感染症研究における標的バリデーションに不可欠な、バイアスのないタンパク質存在量のデータが得られます。感染に関連する真菌タンパク質および宿主応答シグネチャーを同定することで、本手法は抗病原性戦略のメカニズム的なリスク低減を支援し、前臨床段階での標的選択に寄与します。また、宿主・病原体システムを問わず適用可能であるため、抗真菌薬および免疫調節薬の探索プログラムにおけるポートフォリオ全体の適用性が向上します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：感染中にのみ産生される病原体タンパク質を特定することで、新規の病原性関連ターゲットを提示し、治療仮説の検証を可能にする。
- 科学的価値：ホストと病原体の双方のプロテオームにおける相関的な量変化を通じて、ホスト・病原体相互作用経路を明らかにし、機能的なターゲットの妥当性確認を支援する。
- 科学的価値：定量的かつ再現可能な感染状態のプロテオミックプロファイルを提供することで、メカニズムの曖昧さを排除し、ターゲット仮説のリスクを低減させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 運用的価値： 標準化された感染条件とMOIの最適化により、ダウンストリームのアッセイ開発に向けた検証済み生物学的システム（感染マクロファージ）を調製する。
- 運用的価値： スクリーニングキャンペーンにおけるアッセイの標準化および再現性評価に適した、定量的なラベルフリーのプロテオミクス出力を生成する。
- 運用的価値： 汎用的なプロテオミクスおよびバイオインフォマティクスパイプラインの設計により、多様な病原体にわたるスケーラブルなプラットフォームの再利用を支援する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナル価値： 微生物侵入に反応する疾患関連の宿主タンパク質を特定し、前臨床検証に向けたバイオマーカーの整合性を可能にする。
- トランスレーショナル価値： 感染状態におけるプロテオームの変化を病原性メカニズムに結びつけることで、発見から前臨床研究までの連続性を確保する。
- トランスレーショナル価値： 病原性と宿主防御メカニズムに不可欠なタンパク質を明確にすることで、リスク調整に基づいた開発推進の意思決定に情報を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このワークフローは、宿主・病原体相互作用のプロファイリングを通じて初期の探索生物学に統合され、標準化された感染モデルによりスクリーニングへの移行をサポートし、さらにプロテオームの変化を病原性と免疫応答メカニズムに結びつけることで、トランスレーショナルリサーチを可能にします。
- 探索生物学：病原体と宿主の両方のプロテオームにおける感染誘発性の変化を定量化することで、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：最適化されたMOIおよびタイムポイントを備えた、アッセイ即応型の生物学的システムを提供し、化合物評価のための再現性の高い感染モデルを保証します。
- 分析：ラベルフリーの定量測定と統計的出力（例：Benjamini-Hochberg補正t検定）を提供し、条件間の比較および有意に変動したタンパク質の同定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：プロテオミクスシグネチャーを病原性メカニズムおよび宿主防御応答に結びつけ、バイオマーカーの探索と前臨床段階の連続性を支援します。
- エンタープライズ再利用：複数の病原体や免疫系に適用可能な、再利用可能なプロテオミクスおよびバイオインフォマティクスパイプラインを確立し、冗長なメソッド開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：バイアスのない定量的な感染状態のプロテオミクスプロファイリングを通じて、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：最適化された共培養、洗浄、および溶解プロトコルと、検証済みのQC指標（PCA、クラスタリング、95-96%のレプリケート再現性）により、再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値：重要な病原性因子と宿主応答ネットワークを明らかにすることで、go/no-go判断を改善し、抗真菌薬開発プログラムにおける後期の生物学的リスクを軽減します。
- ポートフォリオへの影響：感染特異的なタンパク質発現およびパスウェイへの関与に基づいた、リスク調整済みのターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 哺乳類および真菌の細胞培養、プロテオミクスのサンプル調製、および質量分析データ解析の専門知識が必要です。
- LC-MS/MS装置、ラベルフリー定量ソフトウェア、ならびにPCA、クラスタリング、および変動発現解析のためのバイオインフォマティクスツールの利用が前提となります。
- 研究間での再現性を確保するため、感染パラメータ（MOI、タイムポイント）およびサンプルハンドリングのチーム間での標準化が必要です。
- 真菌細胞の調製やマクロファージのコンフルエンシーの最適化を含め、異なる病原体-宿主システムへの適応を検討する必要があります。
- 実用上の制限として、ホスト由来の高いバックグラウンド信号の中で低存在量の真菌タンパク質を検出するという技術的課題があり、十分な感染深度と感度が求められます。
