選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

私たちは、質量分析法を用いて、高等組織サンプルの特定の領域におけるプロテオームを研究するための合理的な方法を開発しました。私たちの目標は、サンプル調製や質量分析などのプロテオミクス技術を向上させ、高い精度と信頼性を実現することです。FFPEベースの空間プロテオミクスにおける課題の1つは、不完全なタンパク質消化であり、これにより全体的なタンパク質被覆率が低下します。

これらを克服するには、最適化された消化プロトコルと強化された質量分析戦略により、プロテオームの深さと精度を向上させる必要があります。私たちは、さまざまな種類の膵臓疾患にわたる明確なタンパク質変化を特定し、良性状態と前癌状態の違いについての洞察を提供しました。これらの知見は、膵臓がんの早期診断に役立つ可能性があります。

私たちは、患者様のプロテイナーゼ法を進歩させ、組織領域内での高分解能タンパク質マッピングを実現することを目指しています。質量分析に基づくプロテオミクスを利用して、バイオマーカーの発見に寄与する領域特異的な分子シグネチャの特定を目指しています。私たちのアプローチは、これらの患者トラップと事前調製をデータに依存しない機会質量分析と統合し、選択したFFPE組織領域から高品質のプロテオームデータを迅速に生成します。

この方法により、空間的プロテオームの優れた定量が可能になります。まず、ヘマトキシリンとエオシンで染色した組織スライド、または免疫組織化学染色した組織スライドを、病理医が関心領域を示して調製します。未染色の組織スライドと染色した組織スライドを背中合わせに置き、適切な位置合わせを確保します。

メスを使用して、関心のない組織領域を取り除き、スライドの中心に向かって関心のある組織領域をこすり落とします。採取した組織を清潔な1.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブに移し、各チューブに180マイクロリットルのSDS溶解バッファーを添加します。20%振幅でプローブ超音波処理を5秒間オンおよび5秒間オフの10サイクルで実行します。

次に、1, 000 Gの速度を維持しながら、摂氏100度でサンプルを3.5時間インキュベートします。次に、室温で16, 000 Gで10分間遠心分離し、上清から組織破片を分離します。上清を清潔なラベル付きチューブに集め、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。.

アセトン沈殿の場合は、100〜300マイクログラムに対応するタンパク質サンプルをアセトン適合チューブに入れます。次に、氷冷したアセトンをマイナス20°Cに予冷し、サンプル容量の5倍の容量で加えます。混合物をマイナス20°Cで18時間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブを16, 000 Gで15分間遠心分離します。上清は、タンパク質ペレットを乱さずに慎重に廃棄してください。マイナス20°Cでテンパリングしたアセトン500マイクロリットルを加えて遠心分離します。

上清をデカントした後、サンプルを風乾します。懸濁液トラッピング溶解バッファーを脱イオン水で調製します。次に、調製したバッファー40マイクロリットルをサンプルチューブに加え、十分にボルテックスして風乾したタンパク質ペレットを溶解します。

サンプルを摂氏100度、1, 000 Gの振とうインキュベーターに35分間入れます。次に、10マイクロリットルのアルキル化試薬をサンプルに加え、サンプルを室温300Gで1時間インキュベートします。化学ヒュームフード内で、10%トリクロロ酢酸の5マイクロリットルをサンプルに加え、総容量を55マイクロリットルにします。

pHペーパーを使用してサンプルのpHをチェックし、pHが1未満であることを確認します。次に、350マイクロリットルの結合バッファー1をサンプルに加えて、タンパク質をトラップします。懸濁液トラップカラムを2ミリリットルのチューブに入れ、不溶性物質を含むサンプル全体をカラムに移します。

カラムを4, 000 Gで50秒間遠心分離し、タンパク質をトラップします。次に、400マイクロリットルの洗浄バッファー2を追加します。遠心分離後、フロースルーを廃棄します。

最終洗浄後、カラムを 4, 000 G で 1.25 分間遠心分離し、バッファー 1 が完全に通過することを確認します。懸濁液トラップカラムに125マイクロリットルの消化バッファーを追加し、蒸発を防ぐためにキャップします。サンプルを摂氏37度で18時間振らずにインキュベートします。

次に、80マイクロリットルの溶出バッファー1を懸濁液トラップカラムに加え、4, 000Gで1.25分間遠心分離します。溶出したペプチドを引っ張り、きれいな新しいチューブに移します。ペプチド定量後、20 μgのペプチドを凍結乾燥します。

凍結乾燥ペプチドを3%アセトニトリルを含有する40マイクロリットルの水性緩衝液に0.1%ギ酸水に再溶解し、超音波処理浴中で10分間超音波処理する。サンプルを16, 000 Gで60分間遠心分離し、上清をバイアルに移して質量分析を行います。ナノ液体クロマトグラフィー質量分析システムのオートサンプラーを使用して、各サンプルの2マイクロリットルを注入します。

3 μm の C18 材料を充填した逆相カラムで、5 〜 35% アセトニトリルを 127 分間グラジエントし、100 ナノリットル/分でペプチドを分離します。ナノスプレーイオン源を介してペプチドをイオン化し、Orbitrapベースの質量分析計に移します。データに依存しない狭い範囲の取得方法を使用してペプチドを分析します。

FFPE組織プロセシング中の正確な関心領域の分離は、さまざまな膵臓嚢胞性ホルマリン固定パラフィン包埋組織間で達成されました。再現性のあるトータルイオンクロマトグラムは、膵臓嚢胞性腫瘍の各タイプについて、生物学的三重複製間で得られました。液体クロマトグラフィー質量分析により、9, 703のタンパク質が同定されました。

同定されたすべてのタンパク質の存在量は6.25桁に及び、包括的なプロテオームカバレッジを示し、既知の膵臓がんタンパク質マーカーが定量化されました。合計933の差次的に発現するタンパク質が同定され、457がアップレギュレーションされ、476が管内乳頭粘液性腫瘍でダウンレギュレーションされました。バイオインフォマティクス解析により、差次的に発現するタンパク質がいくつかの膵臓がん関連経路と関連していることが明らかになりました。