ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

本実験の総合的な目的は、異なる病原体変異株由来のタンパク質と共通の細胞因子セットとの相互作用プロファイルを比較するためのエクトミック研究を行うことです。これは、酵母ツーハイブリッド法を用いたcDNAスクリーニングにより、異なる病原体変異株のタンパク質と相互作用する可能性のあるパートナーを特定することで達成されます。第二段階として、相互作用パートナーのオープンリーディングフレームをシーケンシングし、さらなる検証に適したベクターへと転写します。

次に、2つのハイブリッドスクリーニングの両方で得られた一連の個別のパートナーを選択し、研究対象とした全菌株との相互作用を再試験します。これは、堅牢な比較相互作用データセットを提供するため、哺乳類細胞を用いて、直交するルシフェラーゼベースのタンパク質断片相補法（gia）を用いて行われます。結果として、得られたルシフェラーゼの測定値に基づき、病原体タンパク質と細胞タンパク質との間で異なる相互作用強度が示され、これにより病原体と宿主のタンパク質間相互作用の比較的な概観が得られます。

階層的クラスタリングによる相互作用プロファイルの処理により、特定の宿主ー病原体相互作用を病理学的特性と相関させることができ、病原体タンパク質の病原性への関与についての知見が得られます。病原体ー宿主タンパク質間相互作用をマッピングする他の手法に対するこのアプローチの主な利点は、複数の菌株変異体間で厳格な比較相互作用データセットを提供できる点にあります。この手法は病原体タンパク質の相互作用ネットワークへの知見を提供しますが、完全なウイルスやリバースジェネティクスを用いた感染分子などの他のシステムにも適用可能です。このプロトコルは、記述されたプロトコルシードに従って、酵母細胞の接合および播種から開始してください。

病原体タンパク質を発現するP-G-B-K-T sevenプラスミドで形質転換したAH 1 0 9酵母株のコロニーを少量含む、トリプトファン欠損選択合成培地30 millilitersに接種します。30 degrees Celsiusで回転させながら30時間培養します。次に、このAH 1 0 9の培養液30 millilitersを、トリプトファン欠損選択合成培地200 millilitersに播種します。

培養物を30 °Cで20時間、回転させてインキュベートします。また、cDNAライブラリーを形質転換したY187を、20 mLのYP培地を用いて30 °Cで10分間、回転させてインキュベートします。その後、生存しているY187酵母細胞と同量に相当する量のpGBKT7形質転換AH109培養液を、3,500 RPM、20 °Cで5分間遠心分離します。

上清を慎重に除去し、ペレットを10 millilitersのYP glueで再懸濁させます。再懸濁したAH 109酵母を、ライブラリを含むY 187と混合します。50 milliliterチューブに移した後、3,500 RPM、20 degrees Celsiusで5分間遠心分離します。

超遠心後、ペレットをYPグルーで懸濁し、全量を1.5 millilitersにします。次に、酵母を3枚のYCMアガー150 millimeterプレートに、1枚あたり0.5 millilitersずつ塗布し、30 degrees Celsiusで4.5 hoursインキュベートします。YCMプレートから交配した酵母を、ガラス製スクレイパーを用いて、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンを除いた10 millilitersの選択的ドロップアウト培地へと回収します。

同種の培地 5 mL でプレートを2回洗浄し、3,500 RPM、20 °C で5分間遠心分離した後に回収します。上清を捨て、再懸濁します。酵母ペレットを、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンを除いた選択的ドロップアウト培地 5 mL に懸濁します。

その後、交配させた酵母を、オートアクティベーション試験で決定した濃度の3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（3-AT）を添加した、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジン欠損選択合成培地（SD培地）の10枚のプレートに塗布します。加湿雰囲気下、30°Cで6〜10日間培養した後、書面によるプロトコルに従って二倍体率を算出します。酵母コロニーをピックアップし、新たに調製したロイシン、トリプトファン、ヒスチジン欠損選択合成培地に3-ATを添加したプレートに転写します。

後でシーケンシングを行いやすくするため、96ウェルプレートを再現した12ウェル×8レーンの形式で酵母を配置します。加湿条件下、30 °Cで4〜5日間、酵母コロニーを培養します。このセクションの目的は、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジン欠損の選択的ドロップアウト寒天培地で培養し、溶菌させた酵母コロニーに含まれるPA ct twoベクター内のcDNAをPCRで増幅することです。

まず、96ウェルPCRプレートを氷上に置き、各ウェルに50 µLのxmal 20 T溶液を加えて酵母細胞を溶解させます。1ウェルあたり1コロニーを穏やかに再懸濁します。プレートを37 °Cで15分間、次いで95 °Cで15分間インキュベートします。

プレートを再び氷上に置いた後、各ウェルに50 µLの蒸留水を加え、ピペッティングで混合し、3,500 RPM、4 °Cで5分間遠心分離します。本文のプロトコルに従ってX tack mixを調製した後、96ウェルPCRプレートの各ウェルにこのミックスを40 µLずつ分注します。各ウェルに溶菌した酵母を10 µL加え、本文のプロトコルに記載されている通りに増幅を行います。

PCR産物3 µLを1.2%アガロースゲルで電気泳動し、PCR陽性クローンを検出します。得られた3つの陽性クローンから単離したPCR増幅断片のシーケンス解析を行います。その後、BLAST解析を行い、細胞のオープンリーディングフレームを同定します。細胞へのトランスフェクションを行う前に、信頼性の低いアライメント、ならびにフレームシフトや早期終止コドンを含む配列は除外してください。

テキストプロトコルに詳述されている通り、病原体タンパク質および細胞タンパク質のオープンリーディングフレームをそれぞれのベクターに組み込み、Gaiaルシフェラーゼのフラグメントと融合させたタンパク質を作製します。293T細胞を、抗生物質を含まない10%胎児牛血清添加DMEMを用いて、1 mLあたり350,000個の密度で播種します。滅菌済みの白色培養プレートに1ウェルあたり100 µLずつ分注し、37 °C、5% CO2条件下で24時間培養します。翌日、適切なトランスフェクションプロトコルを用いて細胞にトランスフェクションを行います。病原体およびホストのオープンリーディングフレームプラスミド構築物を、それぞれ1ウェルあたり100 ng使用します。また、トランスフェクション効率を正規化するため、CMVホタルルシフェラーゼプラスミドを1ウェルあたり10 ngトランスフェクションします。

各ポイントについて、培養した2 9 3 T細胞のプレートにトランスフェクションミックスを3連で添加し、試験を行います。2 9 3 T細胞は接着力が弱く、ウェルの底から剥がれやすいため、DNAミックスを細胞上に静かに滴下するように注意してください。その後、37 °C、5% carbon dioxideの細胞培養インキュベーター内で24から30時間インキュベートします。1ウェルあたり100 µLのPBSで細胞を洗浄します。1 x vanilla lysis bufferを40 µL加え、室温で30分間インキュベートします。

撹拌しながら、細胞溶解液 10 µL を別のホワイトプレートに分注し、4 °C または -20 °C で保存して、後の Gaia 活性測定用のホタルルシフェラーゼ投与に備えます。プレートをルミノメーターにセットし、細胞溶解液にルシフェラーゼアッセイ試薬 100 µL を注入します。その後、10 秒間ルミネッセンスを計測します。

96ウェルプレートへの分注には約30分かかります。凍結や長期保存は、残りの10 µLの細胞抽出物における相互作用を介したGaia活性に影響を及ぼす可能性があるため、常に新鮮な抽出物を使用してください。ルミノメーターを用いて、細胞溶解物に50 µLのホタルルシフェラーゼアッセイ試薬を注入し、10秒間ルミネッセンスを計測します。

96ウェルプレートの分注には、各インタラクションにつき約30分かかります。Gaiaルシフェラーゼ活性とホタルルシフェラーゼ活性の比率を算出し、正規化したGAIAルミネッセンス値を得ます。これにより、トランスフェクション効率と細胞生存率が考慮されます。

相互作用をモニタリングするため、3連系の平均値を算出します。各病原体と宿主のペアについて、正規化ルミネッセンス比（NLR）を推定します。その際、病原体と宿主タンパク質の両方が存在する状態で検出された正規化GAIAルミネッセンス活性を、コントロールウェルで測定された活性の合計で除します。

陽性相互作用に対するNLRのカットオフ値は、先行研究において約3.5であると推定されています。ハイスループットGIA法、すなわちタンパク質相補性アッセイ（H-T-G-P-C-A）の大きな強みは、その高い感度にあり、これはHPV E2タンパク質の偽陽性率および偽陰性率の評価によって示されています。HPV 16のE2による既知の相互作用をH-T-G-P-C-Aで評価したところ、18個の相互作用のうち4個が検出されず、これは22%の偽陰性率に相当します。

12種類のHPV E2タンパク質をランダムな細胞内タンパク質セットに対して用いたところ、偽陽性の相互作用は5.8%と測定されました。本手法の高い特異性は、E2とその細胞内パートナーであるBRD4への結合を阻害することが知られている単一塩基置換が、NLR比を消失させることを示すこの図に強調されています。この大規模な比較エクトミクスアプローチは、異なる遺伝子型に由来し、それぞれの初期タンパク質における向性と病理の自然な多様性を代表する、ヒトパピローマウイルスの3つの初期タンパク質（E2、E6、E7）に最近適用され、成功を収めています。

相互作用プロファイルの階層的クラスタリングは、概ねHPVの系統樹を再現しており、本アプローチの堅牢性と相互作用データセットの包括性が証明された。これにより、特定のウイルス・宿主相互作用プロファイルを病理学的特性と相関させることができ、ウイルス蛋白質の関与についての手がかりを得ることが可能となる。病原性においては、遺伝子型特異的な相互作用を抽出でき、これらは組織向性や病原性バイオマーカーに対応している可能性がある。

ここに示すE6の6つの相互作用パートナーのように、細胞内ターゲットを相互作用の強度に基づいてソートし、相互作用するHPV型ごとにグループ化しました。この表現形式により、発がん性HPVのE6タンパク質のみと相互作用するfadのような特異的なバイオマーカーを特定することが可能になります。このようなターゲットへの作用は、すべての発がん性HPVのがん化特性にとって極めて重要であると考えられ、したがってHPV感染のサロゲートマーカーまたは治療ターゲットとして利用するための有望な候補となります。

本手順に従い、H-T-G-P-C-Aを、ビオチンタグとの融合タンパク質として発現させた3番目のタンパク質に合わせて適応させることができます。これにより、ストレプトアビジンコートプレート上で3つのパートナー複合体をキャプチャすることが可能となり、巨大なタンパク質複合体の形成に関する疑問を解決できます。

このビデオを視聴することで、病原体と宿主の相互作用をどのように特性評価するかについて、十分な理解を得ることができます。まず、複数の菌株変異体の相互作用パートナーを探索することによって、また、哺乳類細胞などのタンパク質間相互作用を用いて、一連の病原体タイプとの相互作用を比較することによって、その評価を行います。