ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

次の実験の全体的な目標は、さまざまな病原体変異体由来のタンパク質の相互作用プロファイルを共通の細胞因子セットと比較するためのエクトミクス研究を実施することです。これは、異なる病原体変異体由来のタンパク質の潜在的な相互作用パートナーを特定するためのCDNAの2つのハイブリッドスクリーニングである、酵母の交配によって達成されます。第2のステップとして、相互作用するパートナーのオープンリーディングフレームは、シーケンシングされ、さらなる検証のために互換性のあるベクトルに転送されます。

次に、2つのハイブリッドスクリーニングすべてから得られた個々のパートナーのセットが選択され、研究された全系統との相互作用について再テストされます。これは、哺乳類細胞で実施される直交GIAのルシフェラーゼベースのタンパク質フラグメント補完アッセイを使用して行われ、堅牢な比較相互作用データセットを提供します。結果は、得られたルシフェラーゼ測定に基づいて、病原体タンパク質と細胞タンパク質との間の異なる相互作用強度を示しており、したがって、病原体宿主タンパク質タンパク質相互作用の比較概要を提供します。

階層的クラスタリングによる相互作用プロファイルの処理は、特定の宿主病原体の相互作用と病理学的形質と相関し、病原体タンパク質の病因への関与に関する洞察を提供します。このアプローチが病原体宿主タンパク質タンパク質相互作用をマッピングする他の方法と比較した場合の主な利点は、複数の株バリアント間の厳密な比較相互作用データセットを提供できることです。この技術は、病原体タンパク質の相互作用ネットワークへの洞察を提供するが、それはまた、完全なウイルスおよび河川遺伝学を使用して感染性分子として他のシステムに適用することもでき、例えば、書かれたプロトコルシードに記載されているように酵母細胞を交配および拡散することからこのプロトコルを開始する。

AH 1 0 9酵母株のコロニーがほとんどないトリプトファンを欠く30ミリリットルの選択的ドロップアウト培地で、病原体タンパク質を発現するP-G-B-K-T 7プラスミドで形質転換しました。回転させて摂氏30度で30時間インキュベートします。次のシードは、AH 1 0 9の30ミリリットルとトリプトファンを差し引いた選択的ドロップアウト培地の200ミリリットル。

培養物は、摂氏30度で20時間回転させてインキュベートします。また、CDNAライブラリーは、回転しながら摂氏30度で10分間、20ミリリットルのYP接着剤でY187を変換したと考えました。次に、同量の生菌Y187酵母細胞に対応する7つの形質転換AH109培養物であるPG BK T 7の体積を、3,500RPMおよび摂氏20°Cで5分間遠心分離します。

上清を慎重に引き抜き、Resusは10ミリリットルのYP接着剤で口蓋を一時停止します。再懸濁したAH 109酵母をY 187を含むライブラリーと混合します。50ミリリットルのチューブに移してから、3、500 RPMおよび摂氏20度で5分間遠心分離します。

スーパーダットレサスを慎重に引き出した後、ペレットをYP接着剤で懸濁して合計1.5ミリリットルにします。次に、酵母を3つのYCM寒天、150mmプレート、プレートあたり0.5mlに広げ、摂氏30度で4.5時間インキュベートします。YCMプレートから嵌合酵母を採取し、ロイシントリプトファンとヒスチジンを除いた10ミリリットルの選択的ドロップアウト培地にレーキグラスで掻き取ります。.

同じ培地の5ミリリットルでプレートを2回すすぎ、遠心分離後、3、500 RPMおよび20°Cで5分間プールします。上清とreusを捨てます。酵母ペレットを5ミリリットルの選択的ドロップアウト培地からロイシン、トリプトファン、ヒスチジンを差し引いたものに懸濁します。

次に、嵌合した酵母を、ロイシン、トリプトファン、ヒスタミンを除いた選択的ドロップアウト寒天の10プレートに広げ、自動活性化試験で決定された3つのアミノトリアゾールまたは3つのアミノトリアゾールの適切な濃度を補充します。加湿雰囲気中で摂氏30度で6〜10日間インキュベートした後、書面によるプロトコルに記載されている二倍体率を計算します。酵母のコロニーを選び、選択的ドロップアウト寒天からロイシントリプトファンとヒスチジンを差し引いたばかりのプレートに移します。

酵母を12ウェルの8レーンのスキームで注文し、96ウェルプレートを再現して、後でシーケンシングが容易になります。酵母のコロニーを加湿された雰囲気の中で摂氏30度で4〜5日間成長させます。このセクションの目標は、選択的ドロップアウト寒天培地からロイシン、トリトファン、およびヒスチジンプレートを除いた上で成長した溶解酵母コロニーのPA ctに含まれるCDNAをPCRし、増幅することです。

まず、96ウェルのPCRプレートを氷上に置いて、xmal 20 T溶液のウェルあたり50マイクロリットルで酵母細胞を溶解します。ウェルごとに1つのコロニーを穏やかに再懸濁します。プレートを摂氏37度で15分、摂氏95度で15分インキュベートします。

プレートを氷に戻した後、ピペッティングで上下させてウェルミックスごとに50マイクロリットルの蒸留水を加え、3、500 RPMおよび摂氏4度で5分間遠心分離に進みます。テキストプロトコルに記載されているようにXタックミックスを調製した後、96ウェルPCRプレートにウェルあたり40マイクロリットルのミックスを分配します。ウェルあたり10マイクロリットルの溶解酵母を添加し、テキストプロトコルに記載されているように増幅を行います。

1.2%agrosゲル上で3マイクロリットルのPCR産物を泳動し、PCR陽性クローンを検出します。彼の3つの陽性クローンから単離されたPCR増幅フラグメントの配列決定。次に、ブラスト解析を実施して細胞のオープンリーディングフレームを同定し、細胞トランスフェクション前の包含配列のフレームシフトおよび早期停止コードだけでなく、信頼性の低いアラインメントを破棄します。

病原体蛋白質および細胞蛋白質の開いた読書フレームをそれぞれのベクトルに転移し、テキストプロトコルの種2 9 3 T細胞で350、000細胞/DMEMの10%のウシの血清と抗生物質なしで1ミリリットルあたりの000の細胞で詳述されているように、ガイアルシフェラーゼの断片に融合した蛋白質を生成する。ウェルあたり100マイクロリットルを滅菌した白色培養プレートに分配し、翌日、摂氏37度で5%の二酸化炭素で24時間増殖させます。任意の適切なトランスフェクションプロトコルを使用したトランスフェクション細胞は、病原体と宿主の両方のウェルあたり100ナノグラムを使用します オープンリーディングフレームプラスミドコンストラクト CMVホタルルシフェラーゼプラスミドのウェルあたり10ナノグラムをトランスフェクションして、トランスフェクション効率を標準化します。

各ポイントは、培養した2 9 3 T細胞のプレートへの3回転写トランスフェクションミックスで試験されます。2、9、3 T細胞は強く接着せず、ウェルの底から容易に剥離するため、DNAミックスを細胞に穏やかに沈着させるように注意してください。40マイクロリットルの1 x バニラ溶解液を加え、緩衝液を緩衝し、室温で30分間インキュベートします。

攪拌下で、4°Cまたは天井でマイナス20°Cで保存されたホタルルシフェラーゼのその後の投与量のために、別の白いプレートに細胞溶解物の10マイクロリットルを保存しますガイア活性を測定するために。プレートをルミノメーターにセットし、100マイクロリットルのバニラルシフェラーゼアッセイ試薬を細胞溶解物に注入します。その後、発光を10秒間カウントします。

96ウェルプレートの投与量には約30分かかります。凍結または長期保存は、残りの10マイクロリットルの細胞抽出物に対する相互作用を介したガイア活性に影響を与える可能性があるため、常に新鮮な抽出物を使用してください。50マイクロリットルのホタルルシフェラーゼアッセイ試薬をルミノメーターを使用して細胞溶解物に注入し、ルミネセンスを10秒間カウントします。

96ウェルプレートの投与量は、各相互作用に約30分かかります。Gaia ルシフェラーゼ活性とホタルルシフェラーゼ活性の比率を計算して、正規化された GAIA 発光値を取得します。トランスフェクション効率と細胞生存率を考慮に入れます。

三重奏の平均を計算して、交互作用を監視します。各病原体宿主ペアの正規化された発光比またはNLRを推定します。これを行うには、病原体タンパク質と宿主タンパク質の両方の存在下で検出された正規化されたGAIA発光活性を、コントロールウェルで測定した活性の合計で割ります。

正の相互作用のNLRカットオフ値は、以前の研究では約3.5と推定されています。ハイスループットGIAの教訓、タンパク質補完アッセイ、またはH-T-G-P-C-Aの主な強みは、HPVE 2つのタンパク質の偽陽性率と偽陰性率を評価して偽陰性率を決定することで示されるように、その高感度にあります。HPV 16からのE-2の既知の相互作用をH-T-G-P-C-Aによって評価し、18の相互作用のうち4つは回復せず、22%の偽陰性率に対応しました。

偽陽性の相互作用は、ランダムな細胞タンパク質セットに対して 12 個の HPVE 2 タンパク質を使用して 5.8% と測定されました。この図では、この方法の強い特異性が強調されており、その細胞パートナーであるBRD 4へのE 2の結合を妨害することが知られている一点変異がNLR比を消滅させることを示しています。この大規模な比較電子学的アプローチは、最近、ヒトパピローマウイルスの3つの初期タンパク質、E 2、E 6、およびE sevenに適用され、異なる遺伝子型に由来し、初期のタンパク質のそれぞれの親和性および病状におけるそれらの自然な多様性を表しています。

相互作用プロファイルの階層的クラスタリングは、主にHPV系統発生を再現し、アプローチの堅牢性と相互作用データセットの柔軟性を証明します。これは、特定のウイルス宿主相互作用プロファイルを病理学的形質と相関させるために使用でき、それによってウイルスタンパク質の関与に関する手がかりを与えることができます。病因では、遺伝子型特異的な相互作用を抽出することができ、これは潜在的に親和性または病原性バイオマーカーに対応する。

ここで示したように、E 6の相互作用パートナーについて、細胞標的は相互作用強度に基づいて選別され、相互作用するHPVの種類に従ってグループ化されました。この表現により、発癌性HPVのE-6タンパク質とのみ相互作用するfadなどの特定のバイオマーカーの同定が可能になります。このような標的化は、すべての発がん性HPVの発がん性形質にとって重要でなければならず、したがって、HPV感染の代替マーカーとして、または治療標的として使用されるのに適した候補を構成します。

この手順に従います。H-T-G-P-C-Aは、ビオチンタグとの融合として発現する第3のタンパク質と併用するように適合させることができます。これにより、連鎖球菌ダイビングカラープレート上の3つのパートナー複合体を捕捉することができ、大きなタンパク質複合体の形成の問題に答えることができます。

このビデオを見れば、病原体と宿主ポットの相互作用を特徴付ける方法について十分に理解できるはずです。第三に、複数の株バリアントの相互作用パートナーを調査することによって。次に、たとえば哺乳類の細胞におけるタンパク質タンパク質の持続時間を使用して、病原体の種類全体との相互作用を比較することによって。