ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集
2021年2月26日
ダイヤモンドビームラインI24でのシリアルシンクロトロン結晶学用の固定対象サンプル調製、データ収集、データ処理に関する包括的なガイドを提供します。
シリアルシンクロトロン結晶学(SSX)は、MXの比較的新しく急速に発展している領域です。それは低用量および室温実験に非常によく適していますが、おそらく最も重要なのは、ダイナミクスに従うのに本当に適しています。これにより、実際のタンパク質のストップモーションムービーを作成できます。I24では、SSXの複数のモードが利用可能です。
このプロトコルは固定ターゲット SSX に焦点を当てており、限られた量のサンプルを使用して広範囲のシリアル実験が可能です。シリコンチップは、シリコンチップをロードしてクリーニングするときに、それらに慣れていない場合に損傷を受ける可能性があります。また、チップアライメントプロトコルは多くの結晶学者にはまったく新しく、データ処理は標準的な回転データとは若干異なります。
チップホルダーを準備するには、ポリエステル箔の2枚を約6〜6センチメートルの正方形に切り、2つのベースプレートの上にシートを置きます。金属シールリングを使用して、シートを所定の位置に固定し、余分なホイルを慎重に引っ張って折り目を取り除きます。次に、分析する結晶の大きさに対して適切なサイズの開口を有するシリコンチップを選択する。
グローは、15ミリアンペア電流で0.39ミリバールで25秒間チップを排出します。ピンセットを使用して、チップローディングステージにシリコンチップを配置し、上げられたバーを下に向けます。次いで、ピペットを用いて、チップの平坦側に200マイクロクリスタルスラリーを塗布し、チップのすべての都市ブロックをカバーするためにスラリーを広げる。
チップが破損している場合は、ポリエステル箔の小片で任意の穴をカバーし、真空を均一に適用できることを確認します。その後、チップを介して余分な液体のすべてを吸引するために穏やかな真空を適用します。チップローディング段階からチップを取り出し、余分な液体を取り除くために慎重にフィルターペーパーでチップの下側をブロットします。
チップホルダーの大きな半分に、チップホルダーの大きな半分に、取り付けたチップをガイドマークの間に置き、平らな側を下に置きます。チップホルダーの小さい半分をチップの上に置き、それを密封します。チップホルダーの2つの半分は所定の位置にスナップする必要があります。
次に、六進ボルトを使用してチップを固定します。チップを整列させるには、チップホルダーを30度の角度で持ち、マウントに近づいてください。次に、キネマティックマウントを使用して、ビームラインのXYZステージにロードされたチップを配置します。
磁石が接触したら、チップホルダーが流れに平行に回転し、所定の位置をクリックします。チップを配置したら、ビームラインオン軸表示システムとチップアライメントグラフィカルユーザインターフェイスを使用して、チップの左上の受託者を見つけます。X、Y、Z の受託者 0 を中心に、フォーカスの出入りを行って Z を整列させ、上下に Y を揃え、左右に X を揃えます。
次に「ブロックチェック」をクリックして、XYZステージを各都市ブロックの最初の井戸に移動します。X線のクロスヘアが開口部と並ぶ場合、チップは整列されます。このグラフィック表示では、DIALS のスポット検索結果を更新するヒット率プロットを観察できます。
ヒットがクリックされると、対応する回折画像がDIALSイメージビューアに表示されます。この表では、訪問中にデータが収集される際にリアルタイムで更新される現在のインデックス作成と統合率を視覚化できます。単位細胞パラメータの可視化は、多形を明らかにすることができる。
また、有用なパラメータの2次元プロットを作成して、荷重や脱水効果によって生じる変動を明らかにすることもできます。ステレオグラフィック投影は、負荷プロトコルにフィードバックできる優先方向の有無を明らかにすることができます。例えば、この投影では、リソチーム結晶でチップをオーバーロードする効果が観察される。
チップをロードするときは、ピペットをゆっくりと指で使用してチップの上にピペットを置きます。チップに触れたり、シリコンの穴を誤って刺したりするのを防ぎます。データを処理する場合は、自動化されたパイプラインを利用できるようにします。
これは、実験がどのように進行しているかについて、そして何かを変える必要がある場合に、良いアイデアを与えるでしょう。この方法は、大量に結晶化することができる任意のタンパク質系に適用することができる。そして、反応は、光X線または急速な混合によって引き起こされ得る。
一連の構造に関する動的研究は、タンパク質がどのように機能するかについての洞察を提供することができます。
概要
本記事では、Diamond光源のI24ビームラインにおける連続シンクロトロン結晶構造解析のための、固定ターゲット試料調製、データ収集、およびデータ処理に関する包括的なガイドを提供します。ここでは、チップの完全性を維持しつつ、限られた試料量で実験を行うための手法に重点を置いて解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 構造生物学
- 結晶学
- タンパク質ダイナミクス
背景
- シリアルシンクロトロン結晶構造解析（SSX）は、高分子結晶構造解析における発展中の分野です。
- 低線量かつ室温での実験に適しています。
- SSXではタンパク質の動的な研究が可能であり、その動作を可視化することができます。
- 固定ターゲット方式のSSXを用いることで、限られたサンプル量を効果的に利用できます。
研究の目的
- DiamondビームラインI24における固定標的SSXの詳細なプロトコルを提供すること。
- 最適なデータ収集のために、適切なチップの準備とアライメントを確実に行うこと。
- 標準的な回転データと比較した際の、データ処理における相違点を明確にすること。
使用した方法
- ポリエステル箔と封止技術を用いたシリコンチップの作製。
- チップへの微結晶スラリーの塗布および真空吸引。
- ビームラインでのグラフィカルユーザーインターフェースを用いたチップのアライメント。
- 自動化パイプラインを用いたリアルタイムのデータ可視化および処理。
主な結果
- チップを正確にアライメントすることで、精度の高いデータ収集が可能になります。
- 実験中のインデックス付けおよび統合速度をリアルタイムでモニタリングします。
- 単位格子のパラメータを可視化することで、多形やローディング効果を明らかにします。
- ダイナミック研究により、タンパク質の機能に関する知見が得られます。
結論
- 本プロトコルにより、固定標的SSX実験の効率が向上します。
- データ収集を成功させるには、チップの適切な取り扱いとアライメントが極めて重要です。
- SSXを用いた動的解析は、タンパク質の挙動に関する理解を大幅に進展させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
固定標的シリアルシンクロトロン結晶構造解析により、構造生物学者は限られた試料量でタンパク質のダイナミクス研究を行うことができ、高解像度の構造的知見を通じてターゲットのバリデーションを支援することが可能です。この手法は、タンパク質の発現と精製がボトルネックとなる初期段階の探索において極めて重要であり、データ品質を維持しながら試料消費量を削減します。また、室温および時間分解実験を容易にすることで、タンパク質機能のメカニズム的な理解を深め、前臨床開発におけるリード最適化やリスク低減に向けた取り組みに寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：タンパク質の機能的な構造を捉えることで治療仮説の検証を可能にし、機能的なターゲットバリデーションを支援する。
- 運用の価値：大量の結晶体への依存度を低減し、発現量が限定的な困難なターゲットのスクリーニングを可能にする。
- 予測の信頼性：結合部位の特性評価や作用機序に寄与する構造データを提供し、ターゲット選択の意思決定を改善する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 微小結晶から定量的な電子密度マップを生成し、正確なリガンド結合評価を可能にします。
- 運用の価値： チップベースのシステムによりサンプルのマウンティングとアライメントを標準化し、スクリーニングキャンペーン全体の再現性を向上させます。
- アッセイの即応性： フラグメントまたは化合物のスクリーニングにおける、実行または中止の判断を支援するヒット率およびインデックス作成の指標をリアルタイムで算出します。
翻訳・前臨床研究
- 科学的価値： 薬剤の結合や安定性に影響を及ぼす可能性のある多形や構造変化を明らかにし、製剤戦略に有用な情報を提供します。
- 運用的価値： 機能的アッセイと相関し得る時間分解構造データを取得し、トランスレーショナルバイオマーカーの整合性を強化します。
- リスク低減： ローディングに起因するアーチファクトや脱水の影響を早期に特定し、後続の最適化における誤解釈のリスクを低減します。
パイプラインとワークフローの統合
固定標的SSXは、標的の同定およびアッセイ開発に続くディスカバリーワークフローに組み込まれ、リード化合物の同定や前臨床検証の指針となる構造的知見を提供します。これにより、化合物の結合やタンパク質のダイナミクスに関する迅速な構造フィードバックが得られ、「設計-合成-試験-解析（design-make-test-analyze）」の反復サイクルが促進されます。
- 探索生物学： リガンド誘導性の構造変化および作用機序に関連するタンパク質ダイナミクスを可視化することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 標準化されたチップの調製とアライメントによりアッセイの準備を可能にし、化合物スクリーニングにおける一貫したデータ品質を確保します。
- 分析： 単位格子のパラメータ、ヒット率、および積分メトリクスなどの定量的な出力を提供し、実験条件の客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： バイオアベイラビリティやターゲットエンゲージメントに影響を与える可能性のあるダイナミクスを明らかにすることで、構造的観察を機能的結果に結びつけます。
- エンタープライズでの再利用： 複数のターゲットにわたる構造スクリーニングのための再利用可能なプラットフォームを構築し、マルチプロジェクト環境における再検証の手間を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 生理的条件に近い状態で高解像度かつ時間分解能を持つ構造データを提供することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 標準化されたチップの取り扱い、アライメントプロトコル、および自動データ処理パイプラインを通じて、再現性とスケーラビリティを強化する。
- 戦略的価値： サンプル消費量を最小限に抑え、構造最適化キャンペーンにおける迅速な反復を可能にすることで、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： ターゲットとリガンドの相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、リスク調整後の進展決定を支援する。
実施上の考慮事項
- 高分子結晶学の専門知識および、シンクロトロンを用いた試料ハンドリング技術への習熟が必要です。
- キネマティックマウント、オンアクシス観察、およびDIALSなどの自動データパイプラインを備えたビームライン・インフラストラクチャへのアクセスに依存します。
- データの整合性を確保するため、チップの作製、真空吸引、およびアライメント手順に関するチーム間での標準化が必要です。
- 結晶のサイズや空間群の違いに応じた適応検討が必要であり、アパーチャの選択や分散技術の調整が求められます。
- ロードおよび洗浄時のチップの脆弱性や、時間の経過とともに結晶品質を変化させる可能性のある脱水効果への感受性といった、実用上の制限が含まれます。
