ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集
February 26th, 2021
ダイヤモンドビームラインI24でのシリアルシンクロトロン結晶学用の固定対象サンプル調製、データ収集、データ処理に関する包括的なガイドを提供します。
シリアルシンクロトロン結晶学(SSX)は、MXの比較的新しく急速に発展している領域です。それは低用量および室温実験に非常によく適していますが、おそらく最も重要なのは、ダイナミクスに従うのに本当に適しています。これにより、実際のタンパク質のストップモーションムービーを作成できます。I24では、SSXの複数のモードが利用可能です。
このプロトコルは固定ターゲット SSX に焦点を当てており、限られた量のサンプルを使用して広範囲のシリアル実験が可能です。シリコンチップは、シリコンチップをロードしてクリーニングするときに、それらに慣れていない場合に損傷を受ける可能性があります。また、チップアライメントプロトコルは多くの結晶学者にはまったく新しく、データ処理は標準的な回転データとは若干異なります。
チップホルダーを準備するには、ポリエステル箔の2枚を約6〜6センチメートルの正方形に切り、2つのベースプレートの上にシートを置きます。金属シールリングを使用して、シートを所定の位置に固定し、余分なホイルを慎重に引っ張って折り目を取り除きます。次に、分析する結晶の大きさに対して適切なサイズの開口を有するシリコンチップを選択する。
グローは、15ミリアンペア電流で0.39ミリバールで25秒間チップを排出します。ピンセットを使用して、チップローディングステージにシリコンチップを配置し、上げられたバーを下に向けます。次いで、ピペットを用いて、チップの平坦側に200マイクロクリスタルスラリーを塗布し、チップのすべての都市ブロックをカバーするためにスラリーを広げる。
チップが破損している場合は、ポリエステル箔の小片で任意の穴をカバーし、真空を均一に適用できることを確認します。その後、チップを介して余分な液体のすべてを吸引するために穏やかな真空を適用します。チップローディング段階からチップを取り出し、余分な液体を取り除くために慎重にフィルターペーパーでチップの下側をブロットします。
チップホルダーの大きな半分に、チップホルダーの大きな半分に、取り付けたチップをガイドマークの間に置き、平らな側を下に置きます。チップホルダーの小さい半分をチップの上に置き、それを密封します。チップホルダーの2つの半分は所定の位置にスナップする必要があります。
次に、六進ボルトを使用してチップを固定します。チップを整列させるには、チップホルダーを30度の角度で持ち、マウントに近づいてください。次に、キネマティックマウントを使用して、ビームラインのXYZステージにロードされたチップを配置します。
磁石が接触したら、チップホルダーが流れに平行に回転し、所定の位置をクリックします。チップを配置したら、ビームラインオン軸表示システムとチップアライメントグラフィカルユーザインターフェイスを使用して、チップの左上の受託者を見つけます。X、Y、Z の受託者 0 を中心に、フォーカスの出入りを行って Z を整列させ、上下に Y を揃え、左右に X を揃えます。
次に「ブロックチェック」をクリックして、XYZステージを各都市ブロックの最初の井戸に移動します。X線のクロスヘアが開口部と並ぶ場合、チップは整列されます。このグラフィック表示では、DIALS のスポット検索結果を更新するヒット率プロットを観察できます。
ヒットがクリックされると、対応する回折画像がDIALSイメージビューアに表示されます。この表では、訪問中にデータが収集される際にリアルタイムで更新される現在のインデックス作成と統合率を視覚化できます。単位細胞パラメータの可視化は、多形を明らかにすることができる。
また、有用なパラメータの2次元プロットを作成して、荷重や脱水効果によって生じる変動を明らかにすることもできます。ステレオグラフィック投影は、負荷プロトコルにフィードバックできる優先方向の有無を明らかにすることができます。例えば、この投影では、リソチーム結晶でチップをオーバーロードする効果が観察される。
チップをロードするときは、ピペットをゆっくりと指で使用してチップの上にピペットを置きます。チップに触れたり、シリコンの穴を誤って刺したりするのを防ぎます。データを処理する場合は、自動化されたパイプラインを利用できるようにします。
これは、実験がどのように進行しているかについて、そして何かを変える必要がある場合に、良いアイデアを与えるでしょう。この方法は、大量に結晶化することができる任意のタンパク質系に適用することができる。そして、反応は、光X線または急速な混合によって引き起こされ得る。
一連の構造に関する動的研究は、タンパク質がどのように機能するかについての洞察を提供することができます。
概要
この記事では、ダイヤモンドビームラインI24での連続シンクロトロン結晶解析のための固定標的サンプル調製、データ収集、およびデータ処理に関する包括的なガイドを提供します。限られたサンプル量での実験を行いながら、チップの完全性を確保するための方法論に重点を置いています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 構造生物学
- 結晶学
- タンパク質ダイナミクス
背景
- 連続シンクロトロン結晶解析（SSX）は、大分子結晶解析の分野で発展中の分野です。
- 低線量および室温実験に適しています。
- SSXはタンパク質の動的研究を可能にし、その動作の可視化を可能にします。
- 固定標的SSXは、限られたサンプル量を効果的に活用できます。
研究目的
- ダイヤモンドビームラインI24での固定標的SSXの詳細なプロトコルを提供すること。
- 最適なデータ収集のための適切なチップの準備とアライメントを確保すること。
- 標準回転データとの比較におけるデータ処理の違いを強調すること。
使用方法
- ポリエステル箔とシーリング技術を使用したシリコンチップの調製。
- チップへのマイクロ結晶スラリーの塗布と真空吸引。
- ビームラインでのグラフィカルユーザーインターフェースを使用したチップのアライメント。
- 自動化されたパイプラインを使用したリアルタイムのデータ可視化と処理。
主な結果
- チップの正確なアライメントは、正確なデータ収集につながります。
- 実験中のインデックス付けと統合率のリアルタイムモニタリング。
- 単位胞パラメータの可視化により、多形体とローディング効果が明らかになります。
- 動的研究はタンパク質の機能性に関する洞察を提供します。
結論
- このプロトコルは固定標的SSX実験の効率を向上させます。
- 適切なチップの取り扱いとアライメントは、成功したデータ収集にとって重要です。
- SSXを使用した動的研究は、タンパク質の挙動に関する理解を大幅に進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
